時(shí)差成像系統(tǒng)對(duì)IVF-ET結(jié)局的改善及其優(yōu)選模型初探

李國(guó)臻，耿亞松，楊志偉，陶林林，戴芳芳，鄭波

(邢臺(tái)不孕不育專(zhuān)科醫(yī)院/邢臺(tái)生殖與遺傳專(zhuān)科醫(yī)院，邢臺(tái) 054000)

體外受精-胚胎移植(IVF-ET)中為了獲得好的臨床結(jié)局，通常需要優(yōu)選1～2枚胚胎移入子宮。迄今為止，根據(jù)不連續(xù)時(shí)間點(diǎn)觀察胚胎發(fā)育情況優(yōu)選胚胎是最實(shí)用的經(jīng)典方法，然而通過(guò)簡(jiǎn)單的形態(tài)學(xué)評(píng)分并不能了解其卵裂過(guò)程的精確變化。雖然將胚胎多次移出培養(yǎng)箱觀察可以獲得更多發(fā)育信息，但長(zhǎng)時(shí)間暴露于培養(yǎng)箱外會(huì)改變胚胎培養(yǎng)環(huán)境的溫度、濕度及氣體含量[1]。

時(shí)差成像 (time-lapse imaging，TLI) 系統(tǒng)克服了這一缺點(diǎn)，不僅能穩(wěn)定胚胎培養(yǎng)條件，而且提供了一種動(dòng)態(tài)評(píng)估胚胎發(fā)育潛能的新方法，然而如何規(guī)范的使用TLI技術(shù)目前還沒(méi)有達(dá)成共識(shí)，且相對(duì)于常規(guī)胚胎優(yōu)選方案，TLI的使用是否確實(shí)能提高胚胎鑒別能力、使患者盡早獲得妊娠，尚存在爭(zhēng)議[2]，且人工智能尚不能完成TLI的胚胎優(yōu)選，巨量的胚胎發(fā)育資料分析大大增加了胚胎學(xué)家的工作量，使TLI在輔助生殖中的應(yīng)用受到局限。因此結(jié)合實(shí)際工作，我們提出了一種簡(jiǎn)單的形態(tài)學(xué)結(jié)合動(dòng)力學(xué)的胚胎優(yōu)選方案，通過(guò)比較TLI培養(yǎng)與常規(guī)培養(yǎng)的胚胎結(jié)局和妊娠結(jié)局，嘗試探討TLI的臨床應(yīng)用價(jià)值，以期為T(mén)LI技術(shù)在IVF-ET中的使用規(guī)范制定上提供參考。

材料和方法

一、研究對(duì)象

回顧性分析2019年6～11月在我院行IVF/ICSI-ET治療的610個(gè)周期。其中使用TLI系統(tǒng)培養(yǎng)的周期數(shù)為67例(TLI組)，新鮮周期移植34例；常規(guī)培養(yǎng)周期543例(常規(guī)組)，新鮮周期移植262例。納入標(biāo)準(zhǔn)：常規(guī)長(zhǎng)方案促排卵后行IVF或ICSI；因女方輸卵管因素和卵巢高反應(yīng)或男方因素接受輔助生殖治療；均為首次輔助技術(shù)助孕。排除標(biāo)準(zhǔn)：子宮內(nèi)膜異位、盆腔炎等宮腔和盆腔病變；子宮畸形和染色體異?；颊?。

二、研究方法

1.胚胎培養(yǎng)：常規(guī)組的受精卵在預(yù)平衡6 h的蓋油卵裂培養(yǎng)液微滴中培養(yǎng)3 d。TLI組的time-lapse培養(yǎng)皿按照說(shuō)明書(shū)制作，于受精后放入卵裂培養(yǎng)微滴中孵育3 d，兩組胚胎的培養(yǎng)環(huán)境均為6%CO2和5%O2，受精卵發(fā)育第3天盡量抽凈卵裂培養(yǎng)液，重新注入預(yù)平衡的囊胚培養(yǎng)液以達(dá)到半量換液的目的。

2.促排方案：采用常規(guī)長(zhǎng)方案促排卵，女方在黃體期肌肉注射促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑(GnRH-a，達(dá)菲林，益普生，法國(guó))，達(dá)到降調(diào)節(jié)要求后，給予重組促卵泡β素(普利康，Merck Sharp & Dohme，英國(guó))或尿促性素(樂(lè)寶得，麗珠制藥)促排卵，定期通過(guò)陰道B超監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育情況，當(dāng)1/3卵泡直徑≥18 mm時(shí)肌肉注射HCG(麗珠制藥)5 000～10 000 U，36.5 h左右B超引導(dǎo)下經(jīng)陰道穿刺取卵，卵冠丘復(fù)合體置于37℃、6%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3.體外受精和胚胎移植：受精方式分為IVF和ICSI兩種。IVF受精：HCG后39～40 h體外受精，受精密度為2萬(wàn)條精子每個(gè)卵母細(xì)胞，受精后4～6 h拆除卵子周?chē)w粒細(xì)胞，觀察受精情況酌情行早補(bǔ)救ICSI。ICSI：HCG后40～42 h選擇成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行ICSI。在受精后第3天，根據(jù)卵裂球數(shù)目、大小和碎片等情況進(jìn)行形態(tài)學(xué)評(píng)分：Ⅰ級(jí)為卵裂球大小均勻，形態(tài)規(guī)則，胞質(zhì)均勻清晰，無(wú)碎片或碎片率<10%；Ⅱ級(jí)為卵裂球大小均勻或略不均勻，形態(tài)欠規(guī)則，無(wú)碎片或碎片率10%～20%；Ⅲ級(jí)為卵裂球大小不均，形態(tài)欠規(guī)則，碎片率20%～50%；Ⅳ級(jí)為卵裂球大小嚴(yán)重不均，碎片率>50%。級(jí)別在Ⅲ級(jí)及以上的胚胎為D3可用胚胎。

4.胚胎優(yōu)選方案：常規(guī)胚胎優(yōu)選方案選擇正常受精、胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)分最優(yōu)的1～2枚胚胎移植入子宮。TLI組結(jié)合胚胎形態(tài)學(xué)和動(dòng)力學(xué)方案優(yōu)選胚胎，需移植前回查確保非多精受精來(lái)源胚胎，并盡量排除異常卵裂模式、PN轉(zhuǎn)換、逆卵裂等異常發(fā)育來(lái)源胚胎[3-4]；若不能根據(jù)形態(tài)學(xué)選擇出最好的胚胎移植或冷凍，以受精為起始時(shí)間注釋發(fā)育動(dòng)力學(xué)參數(shù)：受精至二細(xì)胞時(shí)間(T2)、受精至三細(xì)胞時(shí)間(T3)，以及依次T4、T5、T6、T7和T8，通過(guò)比較實(shí)際分裂與理想時(shí)間的吻合度擇優(yōu)移植或冷凍(表1)；若仍然無(wú)法區(qū)分出最好的胚胎，根據(jù)動(dòng)力學(xué)參數(shù)CC1=T3-T2(8.5～14 h)、CC2=T4-T3(越短越好)、CC3=T5-T3(9～15 h)、S3=T8-T5(越短越好)優(yōu)選胚胎[5-8]。

表1 不同受精方式的胚胎發(fā)育動(dòng)力學(xué)理想時(shí)間(h)

5.黃體支持和妊娠確定：取卵當(dāng)日即肌肉注射黃體酮注射液(浙江仙琚)進(jìn)行黃體支持。視HCG注射日E2水平，移植日給予適量雌二醇(補(bǔ)佳樂(lè)，拜耳醫(yī)藥，德國(guó))補(bǔ)充，移植當(dāng)日常規(guī)使用黃體酮(安琪坦，博賞醫(yī)藥，法國(guó))口服或陰道用藥進(jìn)行黃體支持。移植后14 d查血HCG確定HCG陽(yáng)性，移植后28 d行B超檢查，見(jiàn)孕囊確定臨床妊娠。

6.觀察指標(biāo)：高齡占比(≥39歲患者數(shù)/全部患者數(shù)×100%)；可用胚胎數(shù)(取卵周期冷凍胚胎數(shù)+新鮮移植胚胎數(shù))；D3可用胚胎(受精后第3天級(jí)別在Ⅲ級(jí)及以上的胚胎)；囊胚形成率(形成囊胚數(shù)/培養(yǎng)囊胚數(shù)×100%)；卵母細(xì)胞利用率(可用胚胎數(shù)/獲卵數(shù)×100%)；臨床妊娠率(臨床妊娠例數(shù)/移植例數(shù)×100%)；種植率(孕囊數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、兩組患者的基礎(chǔ)資料和胚胎結(jié)局比較

兩組患者間女方年齡、不孕年限、BMI、基礎(chǔ)FSH水平、HCG日激素水平、獲卵數(shù)、2PN數(shù)、可用胚胎數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)和囊胚形成率均無(wú)顯著性差異(P>0.05)；TLI組的卵母細(xì)胞利用率顯著高于常規(guī)組(P<0.05)(表2)。

表2 兩組患者基本情況和胚胎結(jié)局比較[(-±s)，%]

二、兩組間臨床妊娠結(jié)局的比較

常規(guī)組543例患者中有262例進(jìn)行了新鮮周期移植，TLI組67例患者進(jìn)行新鮮周期移植的有34例。兩組新鮮移植患者間基本資料、獲卵數(shù)、正常受精率、囊胚形成率均無(wú)顯著性差異(P>0.05)；兩組間移植日子宮內(nèi)膜厚度和移植胚胎個(gè)數(shù)也無(wú)顯著性差異(P>0.05)；TLI組的種植率和臨床妊娠率較常規(guī)組偏高，但無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表3)。

表3 兩組中新鮮周期移植患者間臨床結(jié)局的比較[(-±s)，%]

三、新鮮周期不同亞組間臨床妊娠結(jié)局的比較

根據(jù)女方年齡、獲卵數(shù)和D3可用胚胎數(shù)/移植個(gè)數(shù)進(jìn)行的亞組分析顯示，不同年齡段TLI組的種植率和妊娠率較常規(guī)培養(yǎng)組均略有提高，但無(wú)顯著性差異(P>0.05)；獲卵數(shù)≥10和D3可用胚胎數(shù)/移植個(gè)數(shù)>3時(shí)，TLI組的種植率和臨床妊娠率較常規(guī)培養(yǎng)組有增高趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表4)。

表4 不同亞組間臨床妊娠結(jié)局的比較(%)

討 論

時(shí)差成像系統(tǒng)已在IVF-ET中的廣泛應(yīng)用，觀察系統(tǒng)和培養(yǎng)系統(tǒng)一體化的抽屜式時(shí)差成像培養(yǎng)系統(tǒng)具有更穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境、數(shù)據(jù)可追溯性等優(yōu)點(diǎn)[9]，胚胎動(dòng)力學(xué)在胚胎優(yōu)選上的應(yīng)用顯著提升了首次移植種植率和臨床妊娠率[10-11]。有學(xué)者提出時(shí)差成像培養(yǎng)系統(tǒng)需要在卵母細(xì)胞受精早期脫顆粒，為了獲得清晰的圖像信息而過(guò)度操作帶來(lái)的機(jī)械刺激可能損傷胚胎，且頻繁的曝光也可能不利于胚胎發(fā)育。通過(guò)比較時(shí)差成像培養(yǎng)系統(tǒng)和常規(guī)培養(yǎng)系統(tǒng)的正常受精數(shù)、可用胚胎數(shù)、囊胚形成率和卵母細(xì)胞利用率，我們發(fā)現(xiàn)時(shí)差成像培養(yǎng)系統(tǒng)的正常受精數(shù)、可用胚胎數(shù)、囊胚形成率略有增加，而卵母細(xì)胞利用率顯著增高(P<0.05)。TLI回顧胚胎發(fā)育全過(guò)程，避免了常規(guī)培養(yǎng)一過(guò)式觀察錯(cuò)過(guò)兩原核出現(xiàn)的時(shí)間段，可能與TLI具有較好的胚胎結(jié)局相關(guān)。常規(guī)胚胎培養(yǎng)為了獲得更多的胚胎發(fā)育信息，需要多次將胚胎拿出培養(yǎng)箱外觀察，長(zhǎng)時(shí)間暴露于培養(yǎng)箱外會(huì)改變胚胎培養(yǎng)環(huán)境的溫度、濕度及氣體含量。雖然時(shí)差成像培養(yǎng)系統(tǒng)需要頻繁的曝光胚胎，但光源多采用無(wú)害的長(zhǎng)波長(zhǎng)光，且累計(jì)曝光時(shí)長(zhǎng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于常規(guī)胚胎培養(yǎng)系統(tǒng)[12]。

目前關(guān)于胚胎動(dòng)力學(xué)應(yīng)用于胚胎選擇以提高胚胎著床率的研究已有報(bào)道，大量胚胎發(fā)育動(dòng)力學(xué)參數(shù)如CC1、CC2、S2、CC3、S3已被證實(shí)可以預(yù)測(cè)胚胎能否種植成功[13]。目前人工智能沒(méi)有完全運(yùn)用于時(shí)差成像培養(yǎng)系統(tǒng)，大量的胚胎注釋工作增加了胚胎學(xué)家的時(shí)間成本，且時(shí)差成像培養(yǎng)箱和專(zhuān)用的胚胎皿增加了醫(yī)療成本，嚴(yán)重限制了時(shí)差成像培養(yǎng)系統(tǒng)在臨床的應(yīng)用。因此我們提出了一種胚胎形態(tài)學(xué)初篩結(jié)合胚胎動(dòng)力學(xué)優(yōu)選胚胎的簡(jiǎn)單方案(詳見(jiàn)方法學(xué)中的胚胎優(yōu)選方案)。通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)TLI組和常規(guī)培養(yǎng)組的基礎(chǔ)資料、胚胎結(jié)局沒(méi)有顯著差異，移植日子宮內(nèi)膜厚度和移植胚胎數(shù)類(lèi)似，但TLI組的種植率和臨床妊娠率較常規(guī)培養(yǎng)組略有增加。為了尋找適合TLI培養(yǎng)的人群，我們對(duì)女方年齡、獲卵數(shù)、D3可用胚胎數(shù)/移植個(gè)數(shù)進(jìn)行了亞組分析，我們發(fā)現(xiàn)TLI可提升不同年齡段患者的臨床妊娠結(jié)局，獲卵數(shù)>10個(gè)或D3可用胚胎數(shù)/移植個(gè)數(shù)>3時(shí)，TLI胚胎優(yōu)選方案可以連續(xù)性記錄胚胎發(fā)育的全過(guò)程，有效觀察到異常卵裂模式[3-4]、PN轉(zhuǎn)換、逆卵裂現(xiàn)象[14]；移植前回查原核形成過(guò)程，可以避免多精受精胚胎漏檢，排除多核現(xiàn)象[15]，同時(shí)結(jié)合胚胎動(dòng)力學(xué)篩選胚胎有望顯著提升移植胚胎的種植率和臨床妊娠率。因此，在可供選擇胚胎較多時(shí)，TLI胚胎優(yōu)選方案相對(duì)常規(guī)形態(tài)學(xué)胚胎選擇可能具有較大的優(yōu)勢(shì)。

綜上所述，時(shí)差成像培養(yǎng)系統(tǒng)具有較高的卵母細(xì)胞利用率，TLI胚胎優(yōu)選方案簡(jiǎn)單、操作性強(qiáng)，可望提升胚胎種植率和臨床妊娠率；獲卵數(shù)>10個(gè)或D3可用胚胎數(shù)/移植個(gè)數(shù)>3個(gè)而預(yù)計(jì)胚胎結(jié)局較好時(shí)，時(shí)差成像培養(yǎng)系統(tǒng)可望提升IVF-ET的臨床妊娠結(jié)局。后續(xù)我們將擴(kuò)大數(shù)據(jù)量繼續(xù)觀察TLI系統(tǒng)以及TLI胚胎優(yōu)選方案的臨床應(yīng)用價(jià)值。