焦化污染土壤中降解甲苯的厭氧反硝化菌群結構

王建偉，李亞男，張國凱，饒 竹，王國英，王 迪，岳秀萍

(1.太原理工大學 環(huán)境科學與工程學院，太原 030024；2.中海國亞環(huán)保工程有限公司，太原 030012；3.國家地質實驗測試中心，北京 100037)

焦化土壤中最常見的污染物質主要成分是BTEX和其他芳烴類物質[1-2]。BTEX屬于單環(huán)芳烴類物質，包括苯、甲苯、乙苯和二甲苯，這類物質對人體中樞神經系統(tǒng)有抑制作用[3]，在人類繁殖生育過程中也會產生毒性[4-6]。這些有害物質通過煤氣凈化和焦油加工排放出來，給周圍土壤環(huán)境帶來了極其嚴重的污染。

國內外研究表明，在焦化土壤中，污染物不僅降低了土壤微生物的多樣性，還改變了其群落結構和組成，使得降解性微生物成為了優(yōu)勢菌群[7]。隨著煤炭深加工對土壤造成污染的問題越來越受到重視，一些相應的土壤治理措施得到應用，治理措施主要有3類：物理法、化學法和生物法[8]。其中，利用土壤中微生物修復技術來治理污染土壤受到了廣泛關注[9-10]。微生物修復技術機理是土壤中的降解菌群對污染性有機物進行吸附、降解和轉化以降低污染物濃度或使其反應生成無害物質。BTEX在土壤中具有垂直遷移滲透能力[11]，當其下滲一定深度后，土壤多為缺氧或者厭氧環(huán)境，這就給土壤微生物厭氧降解BTEX提供了條件。在厭氧條件下，甲苯作為BTEX中的簡單有機物，可以通過各種電子受體被微生物降解[9，12]，其中硝酸鹽作為常規(guī)電子受體有很大優(yōu)勢。苯甲酸作為BTEX反應過程的中間產物[13-14]同時參與甲苯降解菌液對照能夠更好分析焦化土壤微生物菌群特性。

因此，本實驗主要研究在硝酸鹽厭氧條件下，通過降解甲苯或苯甲酸的反應過程，來富集焦化廠污染土壤中的微生物。與此同時，本實驗利用高通量測序技術手段對降解菌群結構多樣性和組成進行分析。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1樣品采集

采集山西省太原市小井峪一處廢棄的煤化所焦化廠排污溝內覆土10～15 cm以下的土壤樣品。該土壤樣品用于富集厭氧微生物來進行降解試驗，取樣后立刻帶回實驗室儲存于4 ℃冰箱內，直至使用。

1.1.2培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基菌液由以下物質組成：Na2HPO4·7H2O(7.90 g/L)，KH2PO4(1.50 g/L)，NH4Cl(0.30 g/L)，NaCl(23.00 g/L)，KNO3(0.51 g/L)，MgSO4·7H2O(0.10 g/L)，EDTA(0.25 g/L)，ZnSO4·7H2O(0.12 g/L)，CaCl2(0.03 g/L)，MnCl2·4H2O(0.03 g/L)，F(xiàn)eSO4·4H2O(0.04 g/L)，(NH4)6Mo7O24·4H2O(0.03 g/L)，CuSO4·5H2O(0.01 g/L)，CoCl2·6H2O(0.02 g/L)，以上培養(yǎng)基均使用超純水進行配制，然后通入氬氣(壓強0.4 MPa，15～20 min)來吹脫溶液中溶解氧。培養(yǎng)基及所用血清瓶、槍頭等操作材料用高壓蒸汽滅菌鍋在121 ℃下滅菌30 min，最終使培養(yǎng)基成為無菌厭氧實驗條件。

1.2 富集菌液的建立

1.3 化學分析

1.4 細菌的多樣性分析

1.4.1細菌DNA提取和PCR擴增

DNA提?。簠⒄誒MEGA試劑盒E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit使用說明書的步驟進行操作。提取后，用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性。

PCR擴增：第一輪擴增利用Qubit2.0 DNA檢測試劑盒對基因組DNA精確定量，以確定PCR反應加入的DNA量。通過如下引物進行土壤富集菌液細菌DNA的PCR擴增：341F引物，CCTACGGGNGGCWGCAG；805R引物，GACTACHVGGGTATCTAATCC. PCR反應體系為2×Taq master Mix 15 μL，PCR primer F (10 μmol/L) 1 μL，Primer R (10 μmol/L) 1 μL，Genomic DNA 10～20 ng，超純水30 μL. PCR擴增的反應條件：在95 ℃條件下擴增3 min；94 ℃條件下擴增 30 s，45 ℃ 條件下擴增20 s，65 ℃條件下擴增30 s，做5次循環(huán)；在94 ℃條件下擴增20 s，55 ℃條件下擴增20 s，72 ℃條件下擴增30 s，做20次循環(huán)；在72 ℃條件下擴增5 min，最后冷卻至10 ℃.PCR擴增結束后，進行第二輪擴增。第二輪擴增引入Illumina橋式PCR兼容引物，PCR反應體系為2×Taq master Mix 15 μL，Primer F (10 μmol/L)1 μL，Primer R (10 μmol/L) 1 μL，Genomic DNA 20 ng，超純水30 μL. PCR擴增的反應條件：在95 ℃條件下擴增3 min；在94 ℃條件下擴增20 s，在55 ℃條件下擴增20 s，在72 ℃條件下擴增30 s，做5次循環(huán)；在72 ℃條件下擴增5 min，最后冷卻至10 ℃. PCR結束后，對其產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4.216S rDNA測序數據處理

16S rDNA測序由上海生工公司完成，通過原始序列數據進行質控過濾，得到3個樣本(Back，Toluene，Benzoate)處理后高質量序列讀數。再使用Usearch去除預處理后序列中非擴增區(qū)域序列和靶區(qū)域外序列，最后得到3個樣本(Toluene，Benzoate，Back)剩余序列數目。通過OTU(operational taxonomic unit)操作單元分類法將3個樣本菌種、菌屬的相似性進行歸類，用Venn圖來統(tǒng)計樣本中共有和獨有的OTU的數目，直觀地展現(xiàn)出3個樣品(Back，Toluene，Benzoate)的OTU數目組成。

采用Na?ve Bayesian assignment算法對每條序列在不同層級水平上計算其分配到此rank中的概率值，當概率值大于0.8時，此分類結果可信。同時基于Bergey’s taxonomy后分為6層，依次為域(domain)、門(phylum)、綱(class)、目(order)、科(family)、屬(genus)。最后根據分類學分析結果數量，統(tǒng)計在各個分類層級水平上的3個樣品(Back，Toluene，Benzoate)的群落組成。

2 結果與討論

2.1 富集菌液中微生物對甲苯或苯甲酸的降解

在菌液富集期間，甲苯或苯甲酸(電子供體)在硝酸鹽(電子受體)還原條件下完全反應時，若不考慮細胞生長代謝，硝化反應過程化學計量方程式如下。

甲苯：

苯甲酸：

在第8 d，向活性菌液中添加相應的甲苯(或苯甲酸)和硝酸鹽，而背景對照菌液中只添加硝酸鹽。在第16 d中，背景對照菌液中硝酸鹽被消耗約0.46mmol/L之后基本保持變化，但在活性菌液中，甲苯和苯甲酸分別被消耗約0.10 mmol/L，基本被全部降解。在本實驗中，甲苯和苯甲酸的降解率與硝酸鹽的消耗量比值分別為1∶8.7和1∶5.9，這說明原甲苯菌液土壤中仍有少量有機物與硝酸鹽完全反應。圖1表明，在活性菌液中，硝酸鹽能夠生成亞硝酸鹽，之后又完全反應。在滅活對照菌液中，底物濃度基本保持不變。在背景對照和滅活對照菌液中，沒有亞硝酸產生。

圖1 富集菌液中的基質降解和硝酸根還原過程Fig.1 Substrate degradation and nitrate-reducing process in enrichment solution

2.2 樣品測序操作單元分類及菌群多樣性分析

3個樣本(Back，Toluene，Benzoate)的高通量測序共得到183 690條高質量序列，平均長度為421.24 bp.以97%相似度劃分，共得到8 382個OTU，見表1.在焦化土壤富集菌液中，3個樣本(Back，Toluene，Benzoate)中檢測得到的序列數分別為65 216、61 101、57 373.背景對照樣本中含有3 502個OTU，降解甲苯和苯甲酸菌液中分別含有2 776個OTU和2 551個OTU. 3個樣品覆蓋率值均為0.96，說明絕大部分的樣品基因序列在測序后被組裝得到,測序結果能夠較準確地反映樣品的生物菌群特性。

香農指數(Shannon index)指數通常用來分析微生物樣品的生物菌群多樣性，香農指數越大，說明樣品生物多樣性越高[15]。在表1中，由Ace指數和Chao1指數可看出，背景對照指數均大于降解苯甲酸菌液指數和降解甲苯溶液指數。3個樣本(Back，Toluene，Benzoate)香農指數分別為3.80、3.43、2.91，說明降解甲苯和苯甲酸的生物多樣性明顯都比背景對照低。

表1 微生物群落多樣性指數Table 1 Microbial community diversity index

在土壤富集菌液中，利用Venn圖對3個樣本(Back，Toluene，Benzoate)的OTU進行相互歸類比較，如圖2所示，甲苯菌液和背景對照中OTU共享數量為161個，各自獨有OTU數分別為2 615和3 344. 甲苯菌液和苯甲酸菌液共享的OTU數241個，各自擁有OTU數分別為2 535和2 310. 苯甲酸菌和背景對照共有的OTU數125個，各自特有的分別為2 426和3 380. 由OTU層面來看，3個樣本(Back，Toluene，Benzoate)存在相似的OTU類型較少，表明樣品間主要菌種類型很可能差別較大，同時相似OTU的不同含量也可能造成菌種比例及菌群結構差異。

圖2 細菌群落操作單元結構Venn圖Fig.2 Venn plot of bacterial community structure

2.3 細菌群落組成和菌群結構差異性

2.3.1菌群在門上組成和結構差異的分析

利用16S rRNA宏基因組測序序列，進一步分析微生物群落在門水平上群落結構豐度和菌群組成。3個土壤樣品(Back，Toluene，Benzoate)的8 382條OTU分屬10個門，15個綱，25個科，34個目，44個屬，見圖3.圖3(a)中可觀察到樣品菌門上的分類，其中低于1%的部分合并為other. 3個樣本(Back，Toluene，Benzoate)中變形菌門(Proteobacteria)占3個樣本(Back，Toluene，Benzoate)的豐度較大，分別為55.65%、67.21%和62.44%，這主要因為Proteobacteria菌能長期生活在含有大量芳香族有機物的焦化土壤中[16-17]。在厭氧反硝化富集焦化土壤菌液中，降解甲苯的主要菌門為Proteobacteria、Firmicutes和Deinococcus-thermus，相對豐度分別為67.21%、22.52%和8.16%，這與文獻研究得出厭氧降解甲苯菌群基本一致[18]，推斷出這三個菌門的細菌是富集菌液厭氧反硝化降解甲苯的重要菌群。在圖3(a)中，降解苯甲酸樣本的菌門主要為Proteobacteria、Firmicutes、Ignavibacteria、Deinococcusthermus、Bactercidetes和Actinobacteria，相對豐度分別為62.44%、7.54%、13.15%、8.89%、4.24%和1.28%，這包括了降解甲苯菌液中主要的菌門種類，這由于苯甲酸和甲苯降解過程的共代謝模型[19]。其中，從圖3(a)可看出，與背景控制的菌門相比，降解甲苯菌液的三個菌門中Proteobacteria、Firmicutes和Deinococcus-thermus菌豐度分別增長了20.77%、142.67%和17.41%，F(xiàn)irmicutes菌的豐度增加量顯著，從而說明降解甲苯菌液中菌種的優(yōu)勢門為Firmicutes.而相較于背景控制菌液，降解苯甲酸菌液樣本中Proteobacteria、Ignavibacteria、Deinococcus-thermus和Bactercidetes菌豐度分別增加了12.20%、8.00%、8.89%和7.61%，但Fimicutes和Actinobacteria菌分別減少了18.75%和60.10%，這說明降解苯甲酸的優(yōu)勢菌門為Proteobacteria.在以甲苯或苯甲酸為碳源的焦化污染土壤富集菌液中，Proteobacteria門菌的相對豐度都最高，是能夠降解廣泛有機污染物生物除氮的主要細菌菌落[20]。3個樣本(Back，Toluene，Benzoate)中大部分的細菌群落菌門均已分析(相對豐度分別為5.24%、2.11%和2.46%的微生物未分類以及未鑒定)。

圖3 細菌群落結構分布Fig.3 Composition of the bacterial community structure

2.3.2菌群在綱上結構差異的分析

通過高通量測序檢測三個樣品(Back，Toluene，Benzoate)共得到15種細菌綱類，將低于1%和未檢測到的菌群歸于other，剩下主要菌群有12種，見圖3(b).圖3(b)為綱水平上的分類，背景對照中綱排序前三的菌群依次為α-proteobacteria、β-proteobacteria、Ignavibacteria，相對豐度分別為20.92%、17.77%、12.15%.降解甲苯土壤菌液中菌群綱類前三排序依次為α-proteobacteria、γ-proteobacteria、Bacilli，相對豐度分別為38.93%、20.47%、17.32%，是背景對照土壤中菌群相對豐度的1.86倍、1.87倍、2.14倍。降解苯甲酸土壤樣本菌液中前三類綱排序為β-proteobacteria、Ignavibacteria、γ-proteobacteria，同時分別相對豐度為46.10%、13.15%、9.54%，是背景對照土壤中菌群相對豐度的2.59倍、1.08倍、0.87倍。其中，α-proteobacteria、γ-proteobacteria、Bacilli是降解甲苯土壤中的優(yōu)勢綱，而降解苯甲酸土壤中優(yōu)勢綱為β-proteobacteria.在3個樣品中Proteobacteria主要包括α-proteobacteria、β-proteobacteria、γ-proteobacteria. α-proteobacteria和β-proteobacteria相對豐度較高，在缺氧或厭氧條件下，Proteobacteria的α-及β-綱的菌株能夠使苯類物質在硝酸鹽條件下發(fā)生還原反應[21]，β-proteobacteria經常利用有機物分解產生的氨氣、甲烷等營養(yǎng)物質。從圖3(b)中觀察到，α-proteobacteria、β-proteobacteria、γ-proteobacteria、Bacilli和Deinococci綱是降解苯甲酸和降解甲苯土壤中共同擁有的綱類，其中α-proteobacteria、γ-proteobacteria、Bacilli在甲苯降解菌液中的相對豐度比苯甲酸降解菌液的分別增加了33.00%、10.93%、10.02%，而降解甲苯土壤菌液中β-proteobacteria和Deinococci的相對豐度比苯甲酸菌液減少了38.33%和0.73%.這充分說明了各類綱在底物不同的條件下，菌種對菌液環(huán)境的適應性不同，各類菌種為了適應各自的能源環(huán)境而表現(xiàn)出來的微生物群落結構存在差異(相對豐度分別為5.24%、2.11%和2.46%的微生物未分類以及未鑒定)。

2.3.3菌群在屬上結構差異的分析

為了能夠進一步細化微生物菌群結構的差異性和菌群組成，以菌屬為研究對象，2個樣品(Toluene，Benzoate)共檢測到44種細菌菌屬。將低于1%和未檢測到的菌屬歸于other，剩下主要菌屬有16類，如圖4所示。甲苯降解菌液中前三位菌屬相對豐度排序：Exiguobacterium>Phyllobacterium>Citrobacter，分別占Deinococci、α-proteobacteria、γ-proteobacteria百分比為95.40%、41.70%、48.85%，Exiguobacterium是甲苯降解菌液的優(yōu)勢菌屬。這充分說明在Deinococci綱中，Exiguobacterium菌屬在甲苯降解土壤菌液環(huán)境中生存能力極強[16]。Phyllobacterium和Citrobacter菌屬分別在α-proteobacteria綱和γ-proteobacteria綱中，相比其他菌屬適應甲苯降解菌液能力較強。苯甲酸降解菌液菌屬相對豐度排前三位的依次是：Azoarcus>Ignavibacterium>Truepera，分別占β-proteobacteria、Ignavibacteria、Deinococci百分比為86.96%、100%、99.78%，表明苯甲酸土壤菌液中Azoarcus為優(yōu)勢菌屬，Azoarcus、Ignavibacterium、Truepera菌屬在各自綱水平群落結構中占主要地位。2個土壤菌液樣品(Toluene，Benzoate)共同享有的菌屬包括Exiguobacterium、Citrobacter、Truepera、Acinetcbacter、Limnobacter、Pseudomonas，其中Exiguobacterium菌屬在兩種土壤菌液中相對豐度較高，說明Exiguobacterium屬在兩種菌液中能以甲苯或苯甲酸作為能源物質，進行自身細胞新陳代謝而增殖。此外，SHIM et al[22]培養(yǎng)Pseudomonas菌在纖維床生物反應器中缺氧降解苯系物。Exiguobacterium和Pseudomonas菌在富集海洋沉積物降解BTEX中也能得到[23]。甲苯降解菌液獨有的微生物菌屬有Phyllobacterium、Aquamicrobium、Thauera、Anaxybacter、Stappia、Alkaliphilusd，而苯甲酸降解菌液獨有的菌屬為Azoarcus、Ignavibacterium、Moheibacter、Parvibaculum、Lamia，其中Azoarcus是焦化污染土壤中厭氧反硝化降解苯甲酸的最主要菌屬。LI et al[24]等應用基于16S rRNA基因的DGGE技術，甲苯脫氮降解菌中Azoarcus并不顯著，而苯甲酸降解菌液中最佳匹配菌Thauera、Azoarcus和Thauera具有反硝化降解芳烴類有機物的能力[24]。在焦化土壤中，微生物菌落結構是一個具有差異的結構，環(huán)境中基質的不同導致微生物多樣性也不同。在整個甲苯或苯甲酸降解過程中，很可能是好幾種細菌起重要作用，也可能是許多微生物的共同協(xié)作來參與反應。因此，焦化土壤富集菌液中微生物菌群參與過程以及降解甲苯或苯甲酸的功能性基因特性需要探究，為厭氧修復焦化土壤技術層面增加依據。

圖4 細菌群落結構在屬水平上的組成Fig.4 Composition of the bacterial community structure at genus level

3 結論

1) 在富集焦化污染土壤菌液過程中，微生物降解甲苯或苯甲酸與消耗硝酸鹽的反應過程是同步進行的，本實驗甲苯和苯甲酸的降解量與硝酸根的反應量實際比值分別約為1∶8.7和1∶5.9，這個數據和理論計量學比率在合理程度上可認為相近。

2) 在120 d厭氧脫氮富集焦化污染土壤菌液過程中，活性菌液微生物降解甲苯和苯甲酸的微生物菌群結構多樣性都比背景對照樣本中少一些，且兩者之間菌群差異較大。焦化土壤中主要菌門為Proteobacteria，反硝化菌液中降解甲苯的優(yōu)勢門為Firmicutes，而降解苯甲酸菌液中的優(yōu)勢門為Proteobacteria.

3) α-proteobacteria、γ-proteobacteria、Bacilli是降解甲苯土壤中的優(yōu)勢綱，而降解苯甲酸土壤中優(yōu)勢綱為β-proteobacteria.

4)Exiguobacterium是甲苯降解菌液的優(yōu)勢菌屬，而苯甲酸土壤菌液中Azoarcus為優(yōu)勢菌屬，相對豐度分別為16.53%和40.09%.