焦化污染土壤中降解甲苯的厭氧反硝化菌群結(jié)構(gòu)

王建偉，李亞男，張國凱，饒 竹，王國英，王 迪，岳秀萍

(1.太原理工大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，太原 030024；2.中海國亞環(huán)保工程有限公司，太原 030012；3.國家地質(zhì)實(shí)驗(yàn)測試中心，北京 100037)

焦化土壤中最常見的污染物質(zhì)主要成分是BTEX和其他芳烴類物質(zhì)[1-2]。BTEX屬于單環(huán)芳烴類物質(zhì)，包括苯、甲苯、乙苯和二甲苯，這類物質(zhì)對(duì)人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)有抑制作用[3]，在人類繁殖生育過程中也會(huì)產(chǎn)生毒性[4-6]。這些有害物質(zhì)通過煤氣凈化和焦油加工排放出來，給周圍土壤環(huán)境帶來了極其嚴(yán)重的污染。

國內(nèi)外研究表明，在焦化土壤中，污染物不僅降低了土壤微生物的多樣性，還改變了其群落結(jié)構(gòu)和組成，使得降解性微生物成為了優(yōu)勢菌群[7]。隨著煤炭深加工對(duì)土壤造成污染的問題越來越受到重視，一些相應(yīng)的土壤治理措施得到應(yīng)用，治理措施主要有3類：物理法、化學(xué)法和生物法[8]。其中，利用土壤中微生物修復(fù)技術(shù)來治理污染土壤受到了廣泛關(guān)注[9-10]。微生物修復(fù)技術(shù)機(jī)理是土壤中的降解菌群對(duì)污染性有機(jī)物進(jìn)行吸附、降解和轉(zhuǎn)化以降低污染物濃度或使其反應(yīng)生成無害物質(zhì)。BTEX在土壤中具有垂直遷移滲透能力[11]，當(dāng)其下滲一定深度后，土壤多為缺氧或者厭氧環(huán)境，這就給土壤微生物厭氧降解BTEX提供了條件。在厭氧條件下，甲苯作為BTEX中的簡單有機(jī)物，可以通過各種電子受體被微生物降解[9，12]，其中硝酸鹽作為常規(guī)電子受體有很大優(yōu)勢。苯甲酸作為BTEX反應(yīng)過程的中間產(chǎn)物[13-14]同時(shí)參與甲苯降解菌液對(duì)照能夠更好分析焦化土壤微生物菌群特性。

因此，本實(shí)驗(yàn)主要研究在硝酸鹽厭氧條件下，通過降解甲苯或苯甲酸的反應(yīng)過程，來富集焦化廠污染土壤中的微生物。與此同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)利用高通量測序技術(shù)手段對(duì)降解菌群結(jié)構(gòu)多樣性和組成進(jìn)行分析。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1樣品采集

采集山西省太原市小井峪一處廢棄的煤化所焦化廠排污溝內(nèi)覆土10～15 cm以下的土壤樣品。該土壤樣品用于富集厭氧微生物來進(jìn)行降解試驗(yàn)，取樣后立刻帶回實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)存于4 ℃冰箱內(nèi)，直至使用。

1.1.2培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基菌液由以下物質(zhì)組成：Na2HPO4·7H2O(7.90 g/L)，KH2PO4(1.50 g/L)，NH4Cl(0.30 g/L)，NaCl(23.00 g/L)，KNO3(0.51 g/L)，MgSO4·7H2O(0.10 g/L)，EDTA(0.25 g/L)，ZnSO4·7H2O(0.12 g/L)，CaCl2(0.03 g/L)，MnCl2·4H2O(0.03 g/L)，F(xiàn)eSO4·4H2O(0.04 g/L)，(NH4)6Mo7O24·4H2O(0.03 g/L)，CuSO4·5H2O(0.01 g/L)，CoCl2·6H2O(0.02 g/L)，以上培養(yǎng)基均使用超純水進(jìn)行配制，然后通入氬氣(壓強(qiáng)0.4 MPa，15～20 min)來吹脫溶液中溶解氧。培養(yǎng)基及所用血清瓶、槍頭等操作材料用高壓蒸汽滅菌鍋在121 ℃下滅菌30 min，最終使培養(yǎng)基成為無菌厭氧實(shí)驗(yàn)條件。

1.2 富集菌液的建立

1.3 化學(xué)分析

1.4 細(xì)菌的多樣性分析

1.4.1細(xì)菌DNA提取和PCR擴(kuò)增

DNA提?。簠⒄誒MEGA試劑盒E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit使用說明書的步驟進(jìn)行操作。提取后，用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性。

PCR擴(kuò)增：第一輪擴(kuò)增利用Qubit2.0 DNA檢測試劑盒對(duì)基因組DNA精確定量，以確定PCR反應(yīng)加入的DNA量。通過如下引物進(jìn)行土壤富集菌液細(xì)菌DNA的PCR擴(kuò)增：341F引物，CCTACGGGNGGCWGCAG；805R引物，GACTACHVGGGTATCTAATCC. PCR反應(yīng)體系為2×Taq master Mix 15 μL，PCR primer F (10 μmol/L) 1 μL，Primer R (10 μmol/L) 1 μL，Genomic DNA 10～20 ng，超純水30 μL. PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件：在95 ℃條件下擴(kuò)增3 min；94 ℃條件下擴(kuò)增 30 s，45 ℃ 條件下擴(kuò)增20 s，65 ℃條件下擴(kuò)增30 s，做5次循環(huán)；在94 ℃條件下擴(kuò)增20 s，55 ℃條件下擴(kuò)增20 s，72 ℃條件下擴(kuò)增30 s，做20次循環(huán)；在72 ℃條件下擴(kuò)增5 min，最后冷卻至10 ℃.PCR擴(kuò)增結(jié)束后，進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。第二輪擴(kuò)增引入Illumina橋式PCR兼容引物，PCR反應(yīng)體系為2×Taq master Mix 15 μL，Primer F (10 μmol/L)1 μL，Primer R (10 μmol/L) 1 μL，Genomic DNA 20 ng，超純水30 μL. PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件：在95 ℃條件下擴(kuò)增3 min；在94 ℃條件下擴(kuò)增20 s，在55 ℃條件下擴(kuò)增20 s，在72 ℃條件下擴(kuò)增30 s，做5次循環(huán)；在72 ℃條件下擴(kuò)增5 min，最后冷卻至10 ℃. PCR結(jié)束后，對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4.216S rDNA測序數(shù)據(jù)處理

16S rDNA測序由上海生工公司完成，通過原始序列數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控過濾，得到3個(gè)樣本(Back，Toluene，Benzoate)處理后高質(zhì)量序列讀數(shù)。再使用Usearch去除預(yù)處理后序列中非擴(kuò)增區(qū)域序列和靶區(qū)域外序列，最后得到3個(gè)樣本(Toluene，Benzoate，Back)剩余序列數(shù)目。通過OTU(operational taxonomic unit)操作單元分類法將3個(gè)樣本菌種、菌屬的相似性進(jìn)行歸類，用Venn圖來統(tǒng)計(jì)樣本中共有和獨(dú)有的OTU的數(shù)目，直觀地展現(xiàn)出3個(gè)樣品(Back，Toluene，Benzoate)的OTU數(shù)目組成。

采用Na?ve Bayesian assignment算法對(duì)每條序列在不同層級(jí)水平上計(jì)算其分配到此rank中的概率值，當(dāng)概率值大于0.8時(shí)，此分類結(jié)果可信。同時(shí)基于Bergey’s taxonomy后分為6層，依次為域(domain)、門(phylum)、綱(class)、目(order)、科(family)、屬(genus)。最后根據(jù)分類學(xué)分析結(jié)果數(shù)量，統(tǒng)計(jì)在各個(gè)分類層級(jí)水平上的3個(gè)樣品(Back，Toluene，Benzoate)的群落組成。

2 結(jié)果與討論

2.1 富集菌液中微生物對(duì)甲苯或苯甲酸的降解

在菌液富集期間，甲苯或苯甲酸(電子供體)在硝酸鹽(電子受體)還原條件下完全反應(yīng)時(shí)，若不考慮細(xì)胞生長代謝，硝化反應(yīng)過程化學(xué)計(jì)量方程式如下。

甲苯：

苯甲酸：

在第8 d，向活性菌液中添加相應(yīng)的甲苯(或苯甲酸)和硝酸鹽，而背景對(duì)照菌液中只添加硝酸鹽。在第16 d中，背景對(duì)照菌液中硝酸鹽被消耗約0.46mmol/L之后基本保持變化，但在活性菌液中，甲苯和苯甲酸分別被消耗約0.10 mmol/L，基本被全部降解。在本實(shí)驗(yàn)中，甲苯和苯甲酸的降解率與硝酸鹽的消耗量比值分別為1∶8.7和1∶5.9，這說明原甲苯菌液土壤中仍有少量有機(jī)物與硝酸鹽完全反應(yīng)。圖1表明，在活性菌液中，硝酸鹽能夠生成亞硝酸鹽，之后又完全反應(yīng)。在滅活對(duì)照菌液中，底物濃度基本保持不變。在背景對(duì)照和滅活對(duì)照菌液中，沒有亞硝酸產(chǎn)生。

圖1 富集菌液中的基質(zhì)降解和硝酸根還原過程Fig.1 Substrate degradation and nitrate-reducing process in enrichment solution

2.2 樣品測序操作單元分類及菌群多樣性分析

3個(gè)樣本(Back，Toluene，Benzoate)的高通量測序共得到183 690條高質(zhì)量序列，平均長度為421.24 bp.以97%相似度劃分，共得到8 382個(gè)OTU，見表1.在焦化土壤富集菌液中，3個(gè)樣本(Back，Toluene，Benzoate)中檢測得到的序列數(shù)分別為65 216、61 101、57 373.背景對(duì)照樣本中含有3 502個(gè)OTU，降解甲苯和苯甲酸菌液中分別含有2 776個(gè)OTU和2 551個(gè)OTU. 3個(gè)樣品覆蓋率值均為0.96，說明絕大部分的樣品基因序列在測序后被組裝得到,測序結(jié)果能夠較準(zhǔn)確地反映樣品的生物菌群特性。

香農(nóng)指數(shù)(Shannon index)指數(shù)通常用來分析微生物樣品的生物菌群多樣性，香農(nóng)指數(shù)越大，說明樣品生物多樣性越高[15]。在表1中，由Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)可看出，背景對(duì)照指數(shù)均大于降解苯甲酸菌液指數(shù)和降解甲苯溶液指數(shù)。3個(gè)樣本(Back，Toluene，Benzoate)香農(nóng)指數(shù)分別為3.80、3.43、2.91，說明降解甲苯和苯甲酸的生物多樣性明顯都比背景對(duì)照低。

表1 微生物群落多樣性指數(shù)Table 1 Microbial community diversity index

在土壤富集菌液中，利用Venn圖對(duì)3個(gè)樣本(Back，Toluene，Benzoate)的OTU進(jìn)行相互歸類比較，如圖2所示，甲苯菌液和背景對(duì)照中OTU共享數(shù)量為161個(gè)，各自獨(dú)有OTU數(shù)分別為2 615和3 344. 甲苯菌液和苯甲酸菌液共享的OTU數(shù)241個(gè)，各自擁有OTU數(shù)分別為2 535和2 310. 苯甲酸菌和背景對(duì)照共有的OTU數(shù)125個(gè)，各自特有的分別為2 426和3 380. 由OTU層面來看，3個(gè)樣本(Back，Toluene，Benzoate)存在相似的OTU類型較少，表明樣品間主要菌種類型很可能差別較大，同時(shí)相似OTU的不同含量也可能造成菌種比例及菌群結(jié)構(gòu)差異。

圖2 細(xì)菌群落操作單元結(jié)構(gòu)Venn圖Fig.2 Venn plot of bacterial community structure

2.3 細(xì)菌群落組成和菌群結(jié)構(gòu)差異性

2.3.1菌群在門上組成和結(jié)構(gòu)差異的分析

利用16S rRNA宏基因組測序序列，進(jìn)一步分析微生物群落在門水平上群落結(jié)構(gòu)豐度和菌群組成。3個(gè)土壤樣品(Back，Toluene，Benzoate)的8 382條OTU分屬10個(gè)門，15個(gè)綱，25個(gè)科，34個(gè)目，44個(gè)屬，見圖3.圖3(a)中可觀察到樣品菌門上的分類，其中低于1%的部分合并為other. 3個(gè)樣本(Back，Toluene，Benzoate)中變形菌門(Proteobacteria)占3個(gè)樣本(Back，Toluene，Benzoate)的豐度較大，分別為55.65%、67.21%和62.44%，這主要因?yàn)镻roteobacteria菌能長期生活在含有大量芳香族有機(jī)物的焦化土壤中[16-17]。在厭氧反硝化富集焦化土壤菌液中，降解甲苯的主要菌門為Proteobacteria、Firmicutes和Deinococcus-thermus，相對(duì)豐度分別為67.21%、22.52%和8.16%，這與文獻(xiàn)研究得出厭氧降解甲苯菌群基本一致[18]，推斷出這三個(gè)菌門的細(xì)菌是富集菌液厭氧反硝化降解甲苯的重要菌群。在圖3(a)中，降解苯甲酸樣本的菌門主要為Proteobacteria、Firmicutes、Ignavibacteria、Deinococcusthermus、Bactercidetes和Actinobacteria，相對(duì)豐度分別為62.44%、7.54%、13.15%、8.89%、4.24%和1.28%，這包括了降解甲苯菌液中主要的菌門種類，這由于苯甲酸和甲苯降解過程的共代謝模型[19]。其中，從圖3(a)可看出，與背景控制的菌門相比，降解甲苯菌液的三個(gè)菌門中Proteobacteria、Firmicutes和Deinococcus-thermus菌豐度分別增長了20.77%、142.67%和17.41%，F(xiàn)irmicutes菌的豐度增加量顯著，從而說明降解甲苯菌液中菌種的優(yōu)勢門為Firmicutes.而相較于背景控制菌液，降解苯甲酸菌液樣本中Proteobacteria、Ignavibacteria、Deinococcus-thermus和Bactercidetes菌豐度分別增加了12.20%、8.00%、8.89%和7.61%，但Fimicutes和Actinobacteria菌分別減少了18.75%和60.10%，這說明降解苯甲酸的優(yōu)勢菌門為Proteobacteria.在以甲苯或苯甲酸為碳源的焦化污染土壤富集菌液中，Proteobacteria門菌的相對(duì)豐度都最高，是能夠降解廣泛有機(jī)污染物生物除氮的主要細(xì)菌菌落[20]。3個(gè)樣本(Back，Toluene，Benzoate)中大部分的細(xì)菌群落菌門均已分析(相對(duì)豐度分別為5.24%、2.11%和2.46%的微生物未分類以及未鑒定)。

圖3 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分布Fig.3 Composition of the bacterial community structure

2.3.2菌群在綱上結(jié)構(gòu)差異的分析

通過高通量測序檢測三個(gè)樣品(Back，Toluene，Benzoate)共得到15種細(xì)菌綱類，將低于1%和未檢測到的菌群歸于other，剩下主要菌群有12種，見圖3(b).圖3(b)為綱水平上的分類，背景對(duì)照中綱排序前三的菌群依次為α-proteobacteria、β-proteobacteria、Ignavibacteria，相對(duì)豐度分別為20.92%、17.77%、12.15%.降解甲苯土壤菌液中菌群綱類前三排序依次為α-proteobacteria、γ-proteobacteria、Bacilli，相對(duì)豐度分別為38.93%、20.47%、17.32%，是背景對(duì)照土壤中菌群相對(duì)豐度的1.86倍、1.87倍、2.14倍。降解苯甲酸土壤樣本菌液中前三類綱排序?yàn)棣?proteobacteria、Ignavibacteria、γ-proteobacteria，同時(shí)分別相對(duì)豐度為46.10%、13.15%、9.54%，是背景對(duì)照土壤中菌群相對(duì)豐度的2.59倍、1.08倍、0.87倍。其中，α-proteobacteria、γ-proteobacteria、Bacilli是降解甲苯土壤中的優(yōu)勢綱，而降解苯甲酸土壤中優(yōu)勢綱為β-proteobacteria.在3個(gè)樣品中Proteobacteria主要包括α-proteobacteria、β-proteobacteria、γ-proteobacteria. α-proteobacteria和β-proteobacteria相對(duì)豐度較高，在缺氧或厭氧條件下，Proteobacteria的α-及β-綱的菌株能夠使苯類物質(zhì)在硝酸鹽條件下發(fā)生還原反應(yīng)[21]，β-proteobacteria經(jīng)常利用有機(jī)物分解產(chǎn)生的氨氣、甲烷等營養(yǎng)物質(zhì)。從圖3(b)中觀察到，α-proteobacteria、β-proteobacteria、γ-proteobacteria、Bacilli和Deinococci綱是降解苯甲酸和降解甲苯土壤中共同擁有的綱類，其中α-proteobacteria、γ-proteobacteria、Bacilli在甲苯降解菌液中的相對(duì)豐度比苯甲酸降解菌液的分別增加了33.00%、10.93%、10.02%，而降解甲苯土壤菌液中β-proteobacteria和Deinococci的相對(duì)豐度比苯甲酸菌液減少了38.33%和0.73%.這充分說明了各類綱在底物不同的條件下，菌種對(duì)菌液環(huán)境的適應(yīng)性不同，各類菌種為了適應(yīng)各自的能源環(huán)境而表現(xiàn)出來的微生物群落結(jié)構(gòu)存在差異(相對(duì)豐度分別為5.24%、2.11%和2.46%的微生物未分類以及未鑒定)。

2.3.3菌群在屬上結(jié)構(gòu)差異的分析

為了能夠進(jìn)一步細(xì)化微生物菌群結(jié)構(gòu)的差異性和菌群組成，以菌屬為研究對(duì)象，2個(gè)樣品(Toluene，Benzoate)共檢測到44種細(xì)菌菌屬。將低于1%和未檢測到的菌屬歸于other，剩下主要菌屬有16類，如圖4所示。甲苯降解菌液中前三位菌屬相對(duì)豐度排序：Exiguobacterium>Phyllobacterium>Citrobacter，分別占Deinococci、α-proteobacteria、γ-proteobacteria百分比為95.40%、41.70%、48.85%，Exiguobacterium是甲苯降解菌液的優(yōu)勢菌屬。這充分說明在Deinococci綱中，Exiguobacterium菌屬在甲苯降解土壤菌液環(huán)境中生存能力極強(qiáng)[16]。Phyllobacterium和Citrobacter菌屬分別在α-proteobacteria綱和γ-proteobacteria綱中，相比其他菌屬適應(yīng)甲苯降解菌液能力較強(qiáng)。苯甲酸降解菌液菌屬相對(duì)豐度排前三位的依次是：Azoarcus>Ignavibacterium>Truepera，分別占β-proteobacteria、Ignavibacteria、Deinococci百分比為86.96%、100%、99.78%，表明苯甲酸土壤菌液中Azoarcus為優(yōu)勢菌屬，Azoarcus、Ignavibacterium、Truepera菌屬在各自綱水平群落結(jié)構(gòu)中占主要地位。2個(gè)土壤菌液樣品(Toluene，Benzoate)共同享有的菌屬包括Exiguobacterium、Citrobacter、Truepera、Acinetcbacter、Limnobacter、Pseudomonas，其中Exiguobacterium菌屬在兩種土壤菌液中相對(duì)豐度較高，說明Exiguobacterium屬在兩種菌液中能以甲苯或苯甲酸作為能源物質(zhì)，進(jìn)行自身細(xì)胞新陳代謝而增殖。此外，SHIM et al[22]培養(yǎng)Pseudomonas菌在纖維床生物反應(yīng)器中缺氧降解苯系物。Exiguobacterium和Pseudomonas菌在富集海洋沉積物降解BTEX中也能得到[23]。甲苯降解菌液獨(dú)有的微生物菌屬有Phyllobacterium、Aquamicrobium、Thauera、Anaxybacter、Stappia、Alkaliphilusd，而苯甲酸降解菌液獨(dú)有的菌屬為Azoarcus、Ignavibacterium、Moheibacter、Parvibaculum、Lamia，其中Azoarcus是焦化污染土壤中厭氧反硝化降解苯甲酸的最主要菌屬。LI et al[24]等應(yīng)用基于16S rRNA基因的DGGE技術(shù)，甲苯脫氮降解菌中Azoarcus并不顯著，而苯甲酸降解菌液中最佳匹配菌Thauera、Azoarcus和Thauera具有反硝化降解芳烴類有機(jī)物的能力[24]。在焦化土壤中，微生物菌落結(jié)構(gòu)是一個(gè)具有差異的結(jié)構(gòu)，環(huán)境中基質(zhì)的不同導(dǎo)致微生物多樣性也不同。在整個(gè)甲苯或苯甲酸降解過程中，很可能是好幾種細(xì)菌起重要作用，也可能是許多微生物的共同協(xié)作來參與反應(yīng)。因此，焦化土壤富集菌液中微生物菌群參與過程以及降解甲苯或苯甲酸的功能性基因特性需要探究，為厭氧修復(fù)焦化土壤技術(shù)層面增加依據(jù)。

圖4 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在屬水平上的組成Fig.4 Composition of the bacterial community structure at genus level

3 結(jié)論

1) 在富集焦化污染土壤菌液過程中，微生物降解甲苯或苯甲酸與消耗硝酸鹽的反應(yīng)過程是同步進(jìn)行的，本實(shí)驗(yàn)甲苯和苯甲酸的降解量與硝酸根的反應(yīng)量實(shí)際比值分別約為1∶8.7和1∶5.9，這個(gè)數(shù)據(jù)和理論計(jì)量學(xué)比率在合理程度上可認(rèn)為相近。

2) 在120 d厭氧脫氮富集焦化污染土壤菌液過程中，活性菌液微生物降解甲苯和苯甲酸的微生物菌群結(jié)構(gòu)多樣性都比背景對(duì)照樣本中少一些，且兩者之間菌群差異較大。焦化土壤中主要菌門為Proteobacteria，反硝化菌液中降解甲苯的優(yōu)勢門為Firmicutes，而降解苯甲酸菌液中的優(yōu)勢門為Proteobacteria.

3) α-proteobacteria、γ-proteobacteria、Bacilli是降解甲苯土壤中的優(yōu)勢綱，而降解苯甲酸土壤中優(yōu)勢綱為β-proteobacteria.

4)Exiguobacterium是甲苯降解菌液的優(yōu)勢菌屬，而苯甲酸土壤菌液中Azoarcus為優(yōu)勢菌屬，相對(duì)豐度分別為16.53%和40.09%.