3 種不同物種來源的溶菌酶結(jié)晶條件的研究

徐勝男, 林東強, 田 兵, 姚善涇

(1.浙江大學(xué)生物質(zhì)化工教育部重點實驗室, 浙江大學(xué) 化學(xué)工程與生物工程學(xué)院, 浙江 杭州 310027;2. 教育部生物系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)與保護(hù)重點實驗室, 浙江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 浙江 杭州 310027)

1 引 言

蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)是研究生物大分子結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的科學(xué)依據(jù)，測定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的主要實驗方法有X 射線衍射、低溫冷凍電鏡和二維核磁共振。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中90% 的結(jié)構(gòu)均來自X 射線衍射，是獲得蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)最常用、最準(zhǔn)確的方法[1]。但目前僅少部分蛋白質(zhì)可以形成符合衍射要求的單晶，因此獲得符合衍射要求的蛋白質(zhì)晶體成為解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的瓶頸問題[2-3]。致力于闡明蛋白質(zhì)結(jié)晶機制的大多數(shù)研究均是使用溶菌酶進(jìn)行，這是由于其易于獲得、易于儲存、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在很寬的條件范圍內(nèi)可以獲得大晶體[3-4]。溶菌酶廣泛存在于人、動物、植物的組織及微生物細(xì)胞，主要分為C 型(雞)、G 型(鵝)、細(xì)菌型和噬菌體型[5]，不同物種來源的溶菌酶氨基酸數(shù)量、氨基酸組成、等電點和三維結(jié)構(gòu)等都存在差異，因此，不同物種溶菌酶的結(jié)晶條件也會有顯著的不同[6]。盡管在蛋白質(zhì)結(jié)晶領(lǐng)域有許多研究和實驗進(jìn)展[7-8]，但仍然沒有清晰的模型來解釋蛋白質(zhì)結(jié)晶各個階段的機理，因此，需要投入大量的時間和樣品量，通過反復(fù)試驗來優(yōu)化結(jié)晶條件[9]。

通過對蛋白質(zhì)溶解度的研究，將增強對潛在晶體形成的預(yù)測。許多實驗室通過對蛋白質(zhì)溶解度研究來探究結(jié)晶機理[10-11]。1991 年，Ries-Kautt 等[12]得到了不同條件下雞蛋清溶菌酶的溶解度曲線，但不同物種的溶菌酶溶解度曲線并不一致。蛋白質(zhì)晶體的質(zhì)量取決于許多參數(shù)，如溫度、pH 值、沉淀劑、蛋白質(zhì)種類、蛋白質(zhì)初始濃度、生長方法、蒸發(fā)速率等[7]。大量文獻(xiàn)報道了溶菌酶結(jié)晶條件的相關(guān)研究[9,13]，溶菌酶具有很強的溫度依賴性，溫度是最常用于改變晶體生長的參數(shù)之一[14]；溶液的 pH 值會影響蛋白質(zhì)表面凈電荷的數(shù)量，從而影響溶菌酶結(jié)晶成核的速率[15-16]；沉淀劑是溶菌酶結(jié)晶的另一個重要因素[15]，通過添加沉淀劑，顆粒之間的相互作用從排斥性變?yōu)槲?，不同沉淀劑的相互作用力不同[17-18]；蛋白質(zhì)初始濃度影響著結(jié)晶液滴的過飽和度，過飽和度的大小影響晶核形成的數(shù)量與質(zhì)量[19]。

為了建立高效的蛋白質(zhì)結(jié)晶方法，本文以雞蛋清溶菌酶、芽孢桿菌溶菌酶和人源溶菌酶3 種不同物種來源的溶菌酶為研究對象，采用氣相擴(kuò)散座滴法，探究溶菌酶初始濃度、溫度、pH 值和沉淀劑對這3種溶菌酶結(jié)晶的影響，優(yōu)化溶菌酶結(jié)晶條件，提高結(jié)晶效率，為深入研究蛋白質(zhì)結(jié)晶的方法和拓展蛋白質(zhì)結(jié)晶的應(yīng)用提供依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 溶菌酶

本文使用了3 種不同來源的溶菌酶，分別是人源溶菌酶，購自武漢中昌國研標(biāo)物科技有限公司；芽孢桿菌溶菌酶，購自北京華邁科生物技術(shù)有限責(zé)任公司；雞蛋清溶菌酶，購自生物工程(上海)股份有限公司，以上3 種溶菌酶純度均大于95%。3 種溶菌酶的相關(guān)信息列于表1 中。

表1 3 種物種來源的溶菌酶的氨基酸序列Table 1 Amino acid sequences of lysozymes from three species

由表 1 可知，3 種不同物種來源的溶菌酶氨基酸序列和氨基酸數(shù)量存在差異。雞蛋清溶菌酶由 129個氨基酸組成，等電點pH 在10.8 左右，最適pH 為6.2，相對分子量為14 kDa，主要由4 個二硫鍵、氫鍵以及疏水鍵等維持其穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)；芽孢桿菌溶菌酶由143 個氨基酸組成，最適pH 為8.0，相對分子量為16.0 kDa；人源溶菌酶由130 個氨基酸組成，最適pH 為6.5，相對分子量為14.72 kDa，由于Lys108的取代，不具有其他兩種溶菌酶所具有的二聚體結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)糖基化活性。3 種溶菌酶的催化殘基都是天冬氨酸和谷氨酸，處于保守區(qū)域，但位置存在差異。不同物種來源的溶菌酶酶活也不相同，人源溶菌酶最高，約為雞蛋清溶菌酶的3 倍[20-22]。

2.2 其他試劑與儀器

Thermo Shaker，型號MSC-100；eppendorf 小型高速離心機，型號Centrifuge 5415R；紫外可見分光光度計，日本島津公司產(chǎn)品，型號UV-1800；96 和48 條件雙孔座滴晶體培養(yǎng)板，均購自博亞捷晶科技(北京)有限公司；Bio Tiss 微孔板封板膜，購自云城辦公專營店；晶體篩選劑Crystal Screen HR2-110、Index HR2-144、晶體染色液Izit crystal dye，購自美國Hampton Research 公司；Nikon 光學(xué)顯微鏡，型號ECLIPSE E200，放大倍數(shù)80×；I-cube 培養(yǎng)箱，產(chǎn)自日本亞速旺公司，型號FCI-280。

2.3 實驗方法

2.3.1 溶菌酶的溶解度

溶解度是指可溶性蛋白質(zhì)占總蛋白質(zhì)的百分比，蛋白質(zhì)分散指數(shù)(protein dispersibility index，PDI)為蛋白質(zhì)溶解度的常用表示方法之一，指水分散蛋白質(zhì)占總蛋白質(zhì)的百分比，蛋白質(zhì)樣品體積和濃度的乘積可以得到水分散蛋白質(zhì)的含量。

稱取3 種溶菌酶各350 mg，加入5 mL 蒸餾水后，1 500×g(相對離心力)旋轉(zhuǎn)振蕩5 h，12 000×g (相對離心力)離心15 min，吸取上清液。量取上清液體積，并通過Bradford 法測量上清液的蛋白質(zhì)濃度[23]，根據(jù)牛血清白蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出上清液蛋白質(zhì)濃度，得到水分散蛋白質(zhì)含量。BSA 標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=7.228 3x+0.417 8，y 為上清液樣品的吸光度A595，x 為上清液中溶菌酶的濃度。溶菌酶溶解度為

式中：V 為上清液體積。

測定不同溫度(5、10、15、25、30 和 40 ℃)和不同 pH 值(3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 和8.5)時3 種溶菌酶的溶解度。以溫度作為變量時，pH 值均為5.5，以pH 值作為變量時，溫度均為25 ℃。

2.3.2 座滴法制備溶菌酶晶體

在室溫下，配制溶菌酶溶液，如圖1 所示，吸取80 μL 晶體篩選劑于儲液池(liquid reservoir)中，1 μL溶菌酶溶液于點樣孔(sample hole)中，再從儲液池中吸取1 μL 晶體篩選劑于點樣孔中，用封板膜密封，在培養(yǎng)箱中靜置生長，定期觀察并記錄晶體的生長情況，第1 周每天觀察，第2 周3 d 觀察一次晶體。

2.3.3 溶菌酶晶體的鑒定

利用Hampton Research 公司的Izit Crystal Dye 進(jìn)行晶體染色。Izit 是一種小分子染料，用于區(qū)分生物大分子晶體、小分子晶體和無機晶體。生物大分子晶體含有大溶劑通道，允許 Izit 滲透并使晶體呈現(xiàn)深藍(lán)色，小分子晶體和無機晶體不具有大的溶劑通道，無法吸收Izit。若添加Izit 后出現(xiàn)薄的針狀藍(lán)色晶體，是由于具有高相對過飽和度的篩選劑促使染料結(jié)晶后形成的，可以通過添加1 μL Izit 染色液和1 μL 篩選劑形成2 μL 液滴的對照實驗將這種假陽性與陽性區(qū)分開[24]。將10 μL Izit 與儲液池中80 μL 的晶體篩選劑混合均勻，從混合液中吸取1 μL 至點樣孔中的結(jié)晶液滴，對晶體進(jìn)行染色。在特定溫度的培養(yǎng)箱中靜置6 h 后，觀察染色情況，根據(jù)整個晶體是否被染成深藍(lán)色來判斷晶體是否為蛋白質(zhì)。

2.3.4 溶菌酶結(jié)晶條件的研究

從溶菌酶初始濃度、溫度、pH 值、沉淀劑4 個方面對3 種物種來源的溶菌酶的最適結(jié)晶條件進(jìn)行實驗探究。

圖1 座滴板的橫截面Fig.1 Cross section of the sitting-drop plate

2.3.4.1 溶菌酶初始濃度對溶菌酶結(jié)晶的影響

在25 ℃下培養(yǎng)3 種溶菌酶，初始質(zhì)量濃度分別為10、20、40、80 和120 mg·mL-1。雞蛋清溶菌酶以及芽孢桿菌溶菌酶的篩選劑均含有濃度為0.1 mol?L-1乙酸鈉的緩沖液以及濃度為2.0 mol?L-1甲酸鈉沉淀劑，pH 為 5.5；人源溶菌酶的篩選劑中含有 0.1 mol?L-1雙(2-羥乙基)氨基(三羥甲基)甲烷(Bis-(2-Hydroxyethyl)amino-tris(Hydroxymethyl)methane, BIS-TRIS)緩沖液及 2.0 mol?L-1硫酸銨沉淀劑，pH為6.1。

2.3.4.2 溫度對溶菌酶結(jié)晶的影響

在5、15、25 和40 ℃ 4 個溫度下對3 種溶菌酶進(jìn)行晶體培養(yǎng)。雞蛋清溶菌酶和芽孢桿菌溶菌酶初始質(zhì)量濃度均為 40 mg·mL-1，篩選劑均含有 0.1 mol?L-1乙酸鈉的緩沖液以及 2.0 mol?L-1甲酸鈉沉淀劑，pH 為5.5；人源溶菌酶的初始質(zhì)量濃度為80 mg?mL-1，篩選劑含有0.1 mol?L-1BIS-TRIS 的緩沖液以及2.0 mol?L-1硫酸銨的沉淀劑，pH 為6.1。

2.3.4.3 pH 對溶菌酶結(jié)晶的影響

在25 ℃的溫度下培養(yǎng)3 種溶菌酶晶體，pH 設(shè)置為3.5、4.5、5.5、6.5、7.5 和8.5。雞蛋清溶菌酶和芽孢桿菌溶菌酶的初始質(zhì)量濃度均為40 mg?mL-1，篩選劑均含有0.1 mol?L-1乙酸鈉的緩沖液和2.0 mol?L-1甲酸鈉的沉淀劑；人源溶菌酶的初始質(zhì)量濃度為80 mg?mL-1，篩選劑含有0.1 mol?L-1BIS-TRIS 的緩沖液和2.0 mol?L-1硫酸銨的沉淀劑。

2.3.4.4 沉淀劑對溶菌酶結(jié)晶的影響

在25 ℃的溫度下培養(yǎng)3 種溶菌酶晶體，雞蛋清溶菌酶和芽孢桿菌溶菌酶的初始質(zhì)量濃度均為40 mg?mL-1，篩選劑pH 值為5.5；人源溶菌酶的初始質(zhì)量濃度為80 mg?mL-1，篩選劑pH 值為6.1。沉淀劑設(shè)置如表2所示。

表2 3 種物種來源的溶菌酶的沉淀劑種類Table 2 Precipitants for lysozyme from three species

3 結(jié)果與討論

3.1 3 種物種來源的溶菌酶的溶解度

圖2 3 種物種來源的溶菌酶在不同溫度和pH 值下的溶解度Fig.2 Solubility of lysozymes from three species at different temperatures and pH values

測定了不同溫度(5、10、15、25、30 和 40 ℃)和 pH 值(3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 和8.5)條件下3 種溶菌酶在緩沖液中的溶解度，結(jié)果如圖2 所示。以溫度為變量時，pH 值為5.5。如圖2(a)所示，溫度為5～40 ℃，雞蛋清和芽孢桿菌溶菌酶的溶解度呈現(xiàn)了相同的變化規(guī)律，人源溶菌酶與它們不同。在5～25 ℃，人源溶菌酶溶解度是雞蛋清和芽孢桿菌溶菌酶溶解度的5～7 倍，在30～40 ℃，3種溶菌酶溶解度的差距趨于0。在15 ℃時，人源溶菌酶溶解度達(dá)到最大值，而其余2 種溶菌酶卻降至最小值。在25 ℃時，人源溶菌酶的溶解度開始大幅下降，而雞蛋清和芽孢桿菌溶菌酶的溶解度達(dá)到最大值。以pH 值為變量時，溫度為25 ℃。圖2(b)示出在pH 為3.5～8.5 時3 種溶菌酶溶解度的變化，由圖可知人源溶菌酶溶解度是其余2 種溶菌酶的6 倍左右。3 種溶菌酶的溶解度均隨著pH 值增大而增大，在pH 值為7.5 時3 種溶菌酶溶解度均達(dá)到最大值，其后便開始下降;并且pH 值在4.5～6.0，溶解度大幅上升，隨pH 值變化顯著。這些溶解度數(shù)據(jù)的獲得，為研究溶菌酶結(jié)晶條件提供了主要依據(jù)。

由溶解度數(shù)據(jù)測定可知，人源溶菌酶溶解度為雞蛋清和芽孢桿菌溶解度的5～7 倍，因此研究溶菌酶初始濃度對晶體生長的影響時，溶菌酶的初始濃度范圍要寬一點，以覆蓋人源溶菌酶溶解度最大值以及其余2 種溶菌酶溶解度最小值。因此設(shè)置了蛋白質(zhì)初始質(zhì)量濃度為10～120 mg?mL-1。同樣將溫度設(shè)置為5、15、25 和40 ℃，在這個溫度范圍內(nèi)，人源溶菌酶溶解度與其余2 種溶菌酶溶解度呈現(xiàn)不一樣的變化規(guī)律。設(shè)置了pH 為3.5～8.5，3 種溶菌酶溶解度在這個pH 值范圍內(nèi)均呈現(xiàn)出相同的變化規(guī)律。

3.2 影響3 種溶菌酶晶體生長的因素

3.2.1 溶菌酶初始濃度對晶體生長的影響

圖3 示出了3 種溶菌酶在不同的初始濃度下晶體生長的情況，表示了溶菌酶初始濃度對晶體生長的影響程度。

圖 3(a)、(b)、(c)、(d)和(e)，為雞蛋清溶菌酶在 10、20、40、80 和 120 mg·mL-1初始質(zhì)量濃度下的狀態(tài)，分別是：未形成沉淀或晶體；出現(xiàn)數(shù)量較少的四方塊狀晶型；形成多個四方塊狀晶體的理想晶型；形成四方塊和六面體等不規(guī)則形狀的晶體交疊在一起；形成了大量形狀各不相同的晶體。圖 3(f)、(g)、(h)、(i)和(j)，芽孢桿菌溶菌酶在 10、20、40、80 和 120 mg·mL-1初始濃度下的狀態(tài),分別是：未形成沉淀或晶體；形成了單個板塊狀晶體；形成多個板塊狀晶體的理想晶型；形成大量的微小晶體；生成小麥?zhǔn)鵂畹木w。圖 3(k)、(l)、(m)、(n)和(o)，為人源溶菌酶在 10、20、40、80 和 120 mg·mL-1初始濃度下的狀態(tài)，分別是：出現(xiàn)不透明沉淀；形成棒簇狀晶體；形成不透明沉淀以及小型針狀晶體；生成了分散的晶體并且呈現(xiàn)最理想的晶型，針狀晶體；形成了大量的聚集的針狀晶體。研究發(fā)現(xiàn)，在溶菌酶初始濃度過高時會形成過多的晶核，晶體生長速度過快,會形成大量的細(xì)小微晶, 晶體質(zhì)量比較差；初始濃度過低時無法形成沉淀和晶體或生成的晶體數(shù)量過少。因此想要獲得高質(zhì)量的晶體,溶菌酶初始濃度應(yīng)處于較低或中等的水平，避免產(chǎn)生過多晶核，形成質(zhì)量較差的晶體。雞蛋清溶菌酶和芽孢桿菌溶菌酶最適蛋白質(zhì)初始質(zhì)量濃度均為40 mg·mL-1，最理想晶型分別為四方塊狀和板塊狀。人源溶菌酶的最適蛋白質(zhì)初始質(zhì)量濃度與上述二者不同，為80 mg·mL-1，最理想晶型呈現(xiàn)針狀。由此可以說明，初始質(zhì)量濃度不僅影響了晶體的形狀，而且不同物種溶菌酶也顯示了晶型的不同變化。

圖3 3 種物種來源的溶菌酶在10～120 mg·mL-1 初始濃度下的結(jié)晶狀態(tài)Fig.3 Crystallization of lysozyme from three species under initial concentrations of 10～120 mg·mL-1

3.2.2 溫度對晶體生長的影響

圖4 示出了在不同溫度下晶體的生長情況，表示了溫度對晶體生長的影響程度。

如圖 4(a)、(b)、(c)和(d)所示，雞蛋清溶菌酶在5、15、25 和40 ℃的狀態(tài)分別是：形成了大量的晶體；形成了少量板塊狀晶體；生成了數(shù)量適中的方塊狀理想晶型；形成了聚集的棒簇狀晶體且表面殘缺不平整，多處出現(xiàn)裂紋。如圖 4(e)、(f)、(g)和(h)所示，芽孢桿菌溶菌酶在 5、15、25 和40 ℃的狀態(tài)分別是：形成了數(shù)量龐大的孿晶；形成了少量不規(guī)則的多面體晶體；形成了板塊狀的理想晶型；形成了大量的針狀晶體。如圖 4(i)、(j)、(k)和(l)所示，人源溶菌酶在5、15、25 和40 ℃的狀態(tài)分別是：形成了大量交叉的針狀晶體；形成了多層重疊的板塊狀晶體，表面殘缺不規(guī)整；形成了針狀晶體的理想晶型，數(shù)量適中，呈現(xiàn)分散狀態(tài)；形成了小麥?zhǔn)鵂罹w。溶菌酶在低溫時會迅速結(jié)晶，產(chǎn)生過多的晶核或者孿晶，造成晶體聚集，無法獲得達(dá)到衍射要求的晶體；高溫會造成晶體變形，表面出現(xiàn)各種裂紋，因此過高或過低的溫度都無法獲得質(zhì)量較高的晶體。25 ℃為3 種物種溶菌酶的最適結(jié)晶溫度。由此可以說明，溫度也是一個影響晶體形狀的重要因素。

3.2.3 pH 值對晶體生長的影響

圖5 示出了3 種溶菌酶在不同pH 條件下形成的晶體大小、數(shù)量、形狀各不相同，表示了pH 對晶體生長的影響程度。

圖4 3 種物種來源的溶菌酶在5～40 ℃溫度下的結(jié)晶狀態(tài)Fig.4 Crystallization of lysozyme from three different species at temperatures of 5～40 ℃

圖5 3 種物種來源的溶菌酶在3.5～8.5 的pH 值下的結(jié)晶狀態(tài)Fig.5 Crystallization of lysozyme from three species under pH values of 3.5～8.5

如圖 5(a)、(b)、(c)、(d)、(e)和(f)所示，雞蛋清溶菌酶在 pH 3.5、4.5、5.5、6.5、7.5 和 8.5 的條件下的狀態(tài)分別是：形成了不規(guī)則形狀的晶體；形成了數(shù)個不規(guī)則六面體；形成了方塊狀理性晶型，數(shù)量適中；形成了多個板塊狀晶體，大小各異，晶型不均勻；形成了大小各異的六面體晶體；形成了微小的大量聚集的針狀晶體。如圖5(g)、(h)、(i)、(j)、(k)和(l)所示，芽孢桿菌溶菌酶在pH 3.5、4.5、5.5、6.5、7.5 和8.5 的條件下的狀態(tài)分別是：形成了大量聚集的針狀晶體；形成了數(shù)個六面體晶體，但形狀各異；形成了理想晶型，多個板塊狀晶體，晶型均勻一致形成了數(shù)量較少的板塊狀晶體，邊緣凸起，晶型不均勻；形成了單個六面體晶體；未形成沉淀或晶體。如圖 5(m)、(n)、(o)、(p)、(q)和(r)所示，人源溶菌酶在pH 3.5、4.5、5.5、6.5、7.5 和8.5 的條件下的狀態(tài)分別是：形成了棒簇狀晶體；數(shù)個小麥?zhǔn)鵂罹w，且尾部表面出現(xiàn)殘缺不平整；多個大小不一的針狀晶體，處于聚集狀態(tài)；多個針狀晶體，均勻分散；單個雙頭的小麥?zhǔn)鵂罹w；形成了不透明沉淀，未出現(xiàn)晶體。一般情況下，蛋白質(zhì)的溶解度在等電點處是最低的，此時蛋白質(zhì)表面的凈電荷幾乎為零，當(dāng) pH 值高于或低于等電點時，蛋白質(zhì)所帶的凈電荷為正電荷或負(fù)電荷，溶解度增大，從而對晶體的大小和晶型產(chǎn)生影響。本實驗中3 種物種溶菌酶的最適結(jié)晶pH 均不在溶菌酶的等電點(11.1)附近，在5.5 附近的pH 值更適合雞蛋清以及芽孢桿菌溶菌酶結(jié)晶，在6.5附近的pH 值更適合人源溶菌酶進(jìn)行結(jié)晶。由此說明pH 對晶體生長的影響也十分明顯。

3.2.4 沉淀劑對晶體生長的影響

圖 6 中示出了在不同沉淀劑下 3 種溶菌酶的晶型存在差異，表示了沉淀劑對晶體生長的影響程度。如圖6(a)所示，雞蛋清溶菌酶在濃度為 0.1 mol?L-1醋酸鈉，2.0 mol?L-1甲酸鈉的沉淀劑下形成了最理想的晶型，四方塊狀晶體；圖 6(b)所示，在0.1 mol?L-1檸檬酸，3 mol?L-1氯化鈉下形成六面體晶型；圖6(c)，在 1 mol?L-1琥珀酸，0.1 mol?L-1HEPES ， 在 ρ=0.01 kg?L-1MPEG-2000 下產(chǎn)生的不規(guī)則方塊狀晶體表面存在大量裂紋；圖6(d)所示，芽孢桿菌溶菌酶在0.1 mol?L-1醋酸鈉，2.0 mol?L-1甲酸鈉沉淀劑形成了最理想的晶型，板塊狀晶體；圖 6(e)，在 0.1 mol?L-1HEPES Na，0.8 mol?L-1酒石酸鉀鈉下形成棒簇狀晶型；圖 6(f)，在φ=5% Tacsimate，0.1 mol?L-1HEPES，ρ=0.1 kg?L-1MPEG-5000 下形成了大量重疊的板塊狀晶體。圖 6(g)所示，人源溶菌酶在 0.1 mol?L-1BIS-TRIS，2 mol?L-1硫酸銨沉淀劑下形成了最理想晶型，針狀晶體；圖6(h)和圖6(i)，人源溶菌酶分別在φ=60% Tacsimate 以及1.26 mol?L-1磷酸二氫鈉，0.14 mol?L-1磷酸氫二鉀的沉淀劑下形成了小麥?zhǔn)鵂罹?。不同種類的沉淀劑，與蛋白質(zhì)結(jié)晶的相互作用力不同，最終形成的晶體晶型也各不相同。雞蛋清溶菌酶以及芽孢桿菌溶菌酶的最適結(jié)晶沉淀劑為0.1 mol?L-1乙酸鈉，2.0 mol?L-1甲酸鈉；人源溶菌酶的最適結(jié)晶沉淀劑為 0.1 mol?L-1BIS-TRIS，2 mol?L-1硫酸銨。

圖6 3 種物種來源的溶菌酶在不同沉淀劑條件下的結(jié)晶狀態(tài)Fig.6 Crystallization of lysozyme from three species under different precipitant conditions

4 結(jié) 論

通過Bradford 法測定上清液蛋白濃度，計算得到3 種不同物種來源的溶菌酶在不同溫度和pH 值下的溶解度，發(fā)現(xiàn)人源溶菌酶在不同溫度和pH 值下的溶解度均為其余2 種溶菌酶的5～7 倍；雞蛋清與芽孢桿菌溶菌酶在不同溫度和pH 值下的溶解度變化規(guī)律一致，與人源溶菌酶溶解度在不同pH 值下的變化規(guī)律一致，但在不同溫度下的變化趨勢存在較大差異。通過氣相擴(kuò)散座滴法培養(yǎng)3 種溶菌酶的晶體，結(jié)果表明不同物種的溶菌酶的結(jié)晶條件和形成的晶型也不同。雞蛋清溶菌酶、芽孢桿菌溶菌酶和人源溶菌酶形成的晶型分別是四方塊狀、板塊狀和針狀。雞蛋清溶菌酶通常是在150 mg?mL-1的高蛋白質(zhì)初始質(zhì)量濃度，25 ℃，pH 4.5，0.3 mol?L-1NaCl 作為沉淀劑，0.1 mol?L-1乙酸鈉作為緩沖液的條件下形成晶體。

本文對不同物種的溶菌酶的溶解度、結(jié)晶條件和形成的不同晶型進(jìn)行探究，發(fā)現(xiàn)3 種溶菌酶的結(jié)晶條件中，溫度和 pH 值與以往報道的差距不大，但沉淀劑和蛋白質(zhì)初始濃度存在較大差異；對不同晶型的研究，將有利于探究蛋白質(zhì)的多態(tài)行為。

本文總結(jié)的結(jié)晶條件將不僅為球形蛋白質(zhì)、也對常規(guī)的蛋白質(zhì)結(jié)晶條件優(yōu)化具有參考價值，從而為解析更多蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)提供基礎(chǔ)。