代謝工程優(yōu)化大腸桿菌高效合成L-苯丙氨酸

門佳軒，熊 博，郝亞男，李 旋，劉益寧，謝希賢

（天津科技大學生物工程學院，代謝控制發(fā)酵技術國家地方聯(lián)合工程實驗室，天津 300457）

L-苯丙氨酸（L-phenylalanine，L-Phe）是一種重要的藥品和食品化學品的中間體，參與合成動物體內重要的神經遞質與激素，在醫(yī)藥、食品領域均有廣泛應用[1]。作為一種抗癌藥物的載體，L-Phe可將抗癌藥物導入腫瘤位置，在抑制腫瘤增長的同時又可大幅降低藥物毒副作用。此外，L-Phe也是低熱量甜味劑阿斯巴甜的主要合成原料。近年來，隨著腫瘤藥物及甜味劑阿斯巴甜的市場需求不斷增加，L-Phe供應也在逐年增長[2]，這對L-Phe的工業(yè)生產提出了更高的要求。此前，L-Phe生產方法主要分為化學合成法、酶法以及微生物發(fā)酵法。近年來，由于化學合成法及酶法生產成本高昂、材料來源有限及環(huán)境污染嚴重等問題，L-Phe主要生產方法已發(fā)展為相對經濟環(huán)保的微生物發(fā)酵法[3]。微生物發(fā)酵法中產能主要取決于工程菌株的性能，高效的工程菌株可有效提高綜合產能并節(jié)約生產成本。然而，現(xiàn)有工程菌株普遍存在生產效率低下以及攜帶質粒等問題，導致生產成本較高，限制了規(guī)?；I(yè)應用。因此，構建1 株高效、無質粒的L-Phe工程菌株意義重大。

隨著合成生物學及系統(tǒng)代謝工程等技術手段的發(fā)展，L-Phe的生物合成及代謝調控在大腸桿菌中得到廣泛研究。L-Phe合成途徑由中心代謝途徑、莽草酸途徑及分支途徑3 部分組成，常規(guī)L-Phe生產菌株構建策略也主要集中在這3 個方面[4]。首先是解除雙功能酶PheA和3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸（3-deoxy-D-arabinoheptulosonate-7-phosphate，DAHP）合成酶AroG的反饋抑制并增強其表達。Backman等[5]在1 株酪氨酸缺陷菌株中通過質粒過表達了解除反饋抑制的pheAfbr（抗反饋抑制）和aroFfbr基因，發(fā)酵36 h后，產量達50 g/L。其次是增強前體物赤蘚糖-4-磷酸（erythrose-4-phosphate，E4P）與磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvate，PEP）的供應。由于PEP分流十分明顯，大部分參與到磷酸葡萄糖轉移酶（glucose phosphotransferase，PTS）系統(tǒng)的攝糖作用中[6]，因此多數(shù)研究都是利用其他酶代替PTS系統(tǒng)進行糖的攝取[7-8]。而這種策略在節(jié)省大量PEP的同時會嚴重影響菌體生長，因此不適于工程菌株的構建。最后則是強化莽草酸途徑部分基因。Liu Yongfei等[9]在1 株L-酪氨酸缺陷型大腸桿菌中通過質粒過表達了去反饋抑制的關鍵酶及3-脫氫奎寧酸脫水酶基因aroD，同時過表達大腸桿菌自身的半乳糖透性酶基因galP及葡萄糖激酶基因glk以代替失活的PTS系統(tǒng)，利用該菌株發(fā)酵52 h后，L-Phe產量達72.9 g/L，生產強度達到1.4 g/（L·h），是目前為止報道的L-Phe最高產量。

上述菌株的改造策略雖指導了后續(xù)L-Phe菌株的構建，但與現(xiàn)有工程菌株一樣，由于上述菌株為缺陷型菌株且攜帶質粒等問題，發(fā)酵過程中需要添加抗生素和缺陷型氨基酸以保證菌株穩(wěn)定生產，這些弊端無疑會增加工業(yè)生產的成本，降低產品在市場上的競爭力。此外，常規(guī)改造策略多是對雙功能酶PheA、DAHP合成酶、前體物供應等關鍵節(jié)點進行改造，少有全面系統(tǒng)對大腸桿菌中L-Phe代謝網絡進行優(yōu)化，這就可能導致代謝流至某一步反應時發(fā)生阻塞，積累毒副產物，影響菌體生產。針對上述問題，本研究從大腸桿菌基因組水平出發(fā)，通過代謝工程技術手段，分模塊依次對L-Phe分支途徑、莽草酸途徑以及中心代謝通路進行系統(tǒng)全面的優(yōu)化。首先，通過強化L-Phe合成支路獲得1 株能夠初步積累L-Phe的菌株；在此基礎上，對莽草酸途徑各基因的表達強度進行優(yōu)化以確定最適表達量；最后，通過增強中心代謝途徑中前體物的供應，獲得1 株穩(wěn)定高產、無質粒的非缺陷型大腸桿菌L-Phe生產菌株（圖1）。

圖1 大腸桿菌L-Phe合成代謝路徑Fig. 1 Biosynthetic pathways of L-phenylalanine in Escherichia coli

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L。

2×YT培養(yǎng)基：蛋白胨1.6 g/100 mL，酵母粉1 g/100 mL，NaCl 0.5 g/100 mL。

斜面培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，牛肉膏10 g/L，葡萄糖5 g/L，瓊脂20 g/L。

種子培養(yǎng)基：酵母粉10 g/L，(NH4)2SO44 g/L，K2HPO4·3H2O 3 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，檸檬酸鈉2 g/L，NaCl 1 g/L，微量元素混合液1 mL/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 5 mg/L，CaCl2·2H2O 0.015 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L，(NH4)2SO45 g/L，K2HPO4·3H2O 3 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，檸檬酸鈉2 g/L，NaCl 1 g/L，微量元素混合液1.5 mL/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 30 mg/L，CaCl2·2H2O 0.015 g/L。

微量元素混合液：Na2MoO4·2H2O 2.5 g/L，AlCl3·6H2O 2.5 g/L，NiSO4·6H2O 2.5 g/L，CoCl2·6H2O 1.75 g/L，CaCl2·2 H2O 10 g/L，ZnSO4·7 H2O 0.5 g/L，CuCl2·2 H2O 0.25 g/L，H3BO30.125 g/L。

1.2 儀器與設備

5 L自動控制發(fā)酵罐 上海保興生物設備工程有限公司；UV 200II紫外-可見波長檢測器 美國Laballiance設備公司；1200高效液相色譜儀 美國Agilent公司；SBA-40C生物傳感儀 山東省科學院生物研究所。

1.3 方法

1.3.1 工程菌株的構建

利用規(guī)律間隔成簇短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/Cas9技術對菌株基因進行改造，完成工程菌的構建[10]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)包括pGRB和pREDCas9兩個質粒。pREDCas9質粒主要由RED重組酶、Cas9蛋白及pGRB質粒消除系統(tǒng)組成，含奇霉素抗性（質量濃度100 mg/L、32 ℃培養(yǎng)）。pGRB質粒主要由啟動子、gRNA-Cas9蛋白結合區(qū)域和終止子組成，含氨芐青霉素抗性（質量濃度100 mg/L、37 ℃培養(yǎng)）。pGRB質粒能夠轉錄出相應的gRNA與Cas9蛋白形成復合物并識別到靶位點，實現(xiàn)靶位點基因雙鏈斷裂[11]。同時，目的DNA片段在重組酶作用下與斷裂雙鏈發(fā)生同源重組從而被整合在基因組上，完成基因編輯。

1.3.1.1 gRNA質粒構建與目的DNA片段的獲得

設計兩條反向互補的單鏈DNA，退火后形成雙鏈DNA，該雙鏈兩端由pGRB的同源序列組成，中間部分為靶位點的特定gRNA序列。雙鏈DNA與線性化pGRB在同源重組酶作用下形成gRNA表達質粒。

使用Primer 5.0設計引物，以待編輯基因上下游序列為模板，設計上下游同源臂的引物；以待整合基因為模板，設計整合基因的擴增引物。通過聚合成酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）方法擴增待編輯基因的上下游同源臂和整合基因片段，后經重疊PCR制備重組片段。

1.3.1.2 重組菌株構建

將pREDCas9質粒電轉導入大腸桿菌W3110感受態(tài)細胞中，經菌落PCR篩選出陽性轉化子，并接種至LB培養(yǎng)基，32 ℃培養(yǎng)10～12 h后，接1～1.5 mL菌液轉至100 mL 2×YT培養(yǎng)基中，32 ℃培養(yǎng)，當細菌OD600nm達0.1～0.2時，添加0.1 mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷溶液誘導重組酶表達，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600nm達到0.4～0.6左右收集菌體，制備電轉感受態(tài)。將gRNA質粒和重組DNA片段加入電轉感受態(tài)細胞中進行電轉化，于1 mL復蘇液中32 ℃復蘇2 h。然后取100 μL菌液涂布至含奇霉素和氨芐青霉素抗性的LB平板，挑選單菌落進行菌落PCR驗證，將篩選得到的正確陽性重組菌接至含0.2%阿拉伯糖和奇霉素抗性的LB培養(yǎng)基，誘導pREDCas9中的質粒消除系統(tǒng)切割pGRB質粒，最后將僅含pREDCas9質粒的菌株于42 ℃培養(yǎng)10～12 h，消除溫敏性質粒pREDCas9，獲得無質粒菌株。

1.3.2 L-Phe發(fā)酵

1.3.2.1 搖瓶發(fā)酵

將菌株接種至18 mm×180 mm的試管斜面培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)2 代，每代12 h，后將二代斜面中的菌株接種至裝有30 mL種子培養(yǎng)基的500 mL圓底瓶中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)8～10 h。然后按10%～15%接種量轉接至裝有30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL擋板瓶中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h。發(fā)酵培養(yǎng)基中添加終質量濃度為8 mg/L的苯酚紅作為酸堿指示劑，培養(yǎng)過程中需根據(jù)培養(yǎng)基顏色變化手動補加氨水以維持培養(yǎng)基pH 7.0左右，當葡萄糖耗盡時，培養(yǎng)基顏色呈紅色且不變色，通過移液槍一次性補加1 mL的60 g/100 mL葡萄糖溶液維持發(fā)酵進行。

1.3.2.2 發(fā)酵罐分批補料發(fā)酵

菌株活化后，用無菌水將茄形瓶中的菌落沖洗下來制成菌懸液，全部接種到裝有3 L種子培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中進行菌體擴大培養(yǎng)，發(fā)酵過程中控制pH 7.0左右，溫度恒定在37 ℃，溶氧保持在25%～35%之間，至種子OD600nm達到10～16時，按15%的接種量接入裝有3 L發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中進行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵過程中維持pH 7.0左右，溫度保持在37 ℃，溶氧控制在25%～35%之間。當罐中的葡萄糖耗盡時，開始以一定速率流加質量濃度80 g/100 mL的葡萄糖溶液，維持罐中葡萄糖質量濃度在0.1～5 g/L內。

1.3.2.3 發(fā)酵過程中檢測與分析

發(fā)酵過程中菌體生物量通過紫外分光光度儀檢測OD600nm。發(fā)酵液葡萄糖質量濃度通過SBA生物傳感儀檢測。發(fā)酵液L-Phe含量通過高效液相色譜儀檢測，色譜條件：色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse AAA（4.6 mm×150 mm，5 μm），流動相為10%乙腈溶液，柱溫40 ℃，檢測波長210 nm，流動相總流速1 mL/min，采用二元梯度洗脫的方法。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結果與分析

2.1 L-Phe合成支路強化

按系統(tǒng)代謝工程思路對L-Phe合成途徑進行模塊化改造，首先對合成途徑的后半段進行改造，即L-Phe合成途徑中分支酸到L-Phe的反應。這一過程由分支酸變位酶/預苯酸脫水酶PheA和轉氨酶TyrB共同參與完成，是L-Phe合成途徑中的主要限速步驟之一。其中PheA受到L-Phe強烈的反饋抑制。此外，與L-Phe合成和轉運相關酶的表達還受到抑制因子TyrR的抑制[12-13]。根據(jù)報道，可通過保留PheA酶的分支酸變位酶區(qū)（1～109位氨基酸）和預苯酸脫水酶區(qū)（110～285位氨基酸）解除L-Phe的反饋抑制[14-15]。

圖2 過表達雙功能酶PheA及轉氨酶TyrB對L-Phe產量的影響Fig. 2 Effect of overexpression of bifunctional enzyme PheA and transaminase TyrB on L-Phe production

對此，首先以本實驗室的大腸桿菌W3110為出發(fā)菌株，通過敲除該菌株乳糖操縱子中的lacI基因，獲得菌株PHE1，以解除LacI阻遏蛋白對啟動子Ptrc的阻遏調控作用。在此基礎上，構建解除反饋抑制的pheA*片段，然后在tyrR位點將pheA*與tyrB串聯(lián)成操縱子，由強啟動子Ptrc啟動轉錄，構建菌株PHE2。搖瓶發(fā)酵測試后，檢測到L-Phe有積累。為驗證其最適表達量，又在假基因gapC及yeeP位點分別整合了這2 種酶的雙拷貝及三拷貝，均由Ptrc啟動轉錄，分別構建了PHE3-1和PHE3-2。搖瓶結果如圖2所示，PHE2的L-Phe產量為6.5 g/L，PHE3-1的L-Phe產量達8.8 g/L，較PHE2提高了36.22%。而PHE3-2的產量又下降至6.5 g/L，說明關鍵酶的表達不宜過強，由Ptrc啟動子控制的關鍵酶PheA及TyrB雙拷貝效果最好。

2.2 莽草酸合成途徑優(yōu)化

表1 莽草酸途徑基因的改造對L-Phe生產的影響Table 1 Effects of modification of genes in the shikimate pathway on L-Phe production

莽草酸途徑連接中心代謝途徑和分支酸途徑，是L-Phe合成途徑的重要組成部分[16]。作為連接中心代謝途徑與分支途徑的中間通路，莽草酸途徑的通暢對于平衡代謝通量分布，減少毒副產物（如莽草酸等）積累至關重要[17-18]。本研究通過對莽草酸途徑中各反應酶的表達強度進行梯度優(yōu)化，測試莽草酸途徑中各基因的改造對L-Phe合成及菌體生長的影響。在PHE3-1的基礎上，依次替換莽草酸途徑各酶的啟動子，從莽草酸途徑后段向前逐步確定各酶最適活力，構建了表1菌株。搖瓶發(fā)酵結果如表1所示，其中PHE5-2（過表達5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶AroA）產量為9.3 g/L，較PHE3-1（8.4 g/L）提高了10.56%；在此基礎上，依次對其余酶的表達量進行了優(yōu)化，最終僅有PHE8-2（過表達3-脫氫奎寧脫水酶AroD）對產物合成產生了正向作用。PHE8-2的L-Phe產量達11.9 g/L，與PHE5-2相比提高了27.96%。推測改造后的正向菌株應對產量或生長有積極的影響。經過多輪優(yōu)化篩選，最終確定在6 種酶中，僅有5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶AroA和3-脫氫奎寧脫水酶AroD可以通過適度強化提高L-Phe產量且不影響菌體生長，其余酶的表達水平已達最佳，無需優(yōu)化。

莽草酸途徑中，PEP和E4P在DAHP合成酶作用下縮合生成DAHP是L-Phe合成途徑的另一限速步驟[19]。DAHP合成酶由3 種同工酶AroF、AroG、AroH組成，其中AroG占大部分酶活力，受到L-Phe的反饋抑制[20-21]。根據(jù)文獻報道，將編碼AroG蛋白的第180位絲氨酸突變?yōu)長-Phe可解除L-Phe的反饋抑制作用[22-23]。本研究以PHE8-2為出發(fā)菌，分別整合了由強啟動子Ptrc控制的aroG*基因及其雙拷貝，構建了菌株PHE10及PHE11。搖瓶發(fā)酵結果如圖3所示，PHE10與PHE11的L-Phe產量分別為16.8 g/L與16.6 g/L，其中PHE10較PHE8-2（11.23 g/L）提高了49.77%，說明適度強化DAHP合成酶可顯著提高L-Phe產量。

圖3 增強DAHP合成酶表達對L-Phe合成的影響Fig. 3 Effects of enhanced expression of DAHP synthase on L-Phe synthesis

2.3 前體物供應增加

PEP作為合成芳香族氨基酸的前體物之一，同時還被多條代謝途徑競爭，分流十分明顯，僅有少部分PEP能夠流向莽草酸途徑，因此PEP的供應也是合成L-Phe的限制性因素之一[14]。中心代謝途徑中一部分PEP會在丙酮酸激酶的作用下生成丙酮酸，隨后進入三羧酸循環(huán)[24]。因此，為在增加PEP供應的同時減少對菌體生長的影響，僅敲除丙酮酸激酶（pykF與pykA編碼）中的pykF基因，構建了菌株PHE12。搖瓶發(fā)酵結果如圖4所示，PHE12產量達到20.5 g/L，比出發(fā)菌PHE10（16.94 g/L）提高了21.13%。說明敲除丙酮酸激酶可有效增加PEP供應，進而提升L-Phe產量。

圖4 敲除丙酮酸激酶pykF對L-Phe合成的影響Fig. 4 Effect of pykF knockout on L-Phe synthesis

此外，中心代謝途徑中丙酮酸也會在磷酸烯醇丙酮酸合成酶Pps的作用下反向生成PEP[25]。因此，本研究嘗試在PHE12基礎上用不同強度的啟動子對pps基因進行強化，分別構建PHE13-1、PHE13-2和PHE13-3（分別由PBBa_j23106、Ptrp和Ptrc進行調控）。搖瓶發(fā)酵結果如圖5所示，與ΔpykF不同，增強pps基因表達后，L-Phe產量呈不同程度的降低，而生長并未受到明顯影響。由于PykF在丙酮酸激酶中占主要酶活力，在ΔpykF后，PEP生成丙酮酸的代謝流被減弱，胞內丙酮酸含量減少。而相應地，為保證生長不受影響，菌體通過自身調節(jié)機制強化了PEP到草酰乙酸的合成[26]。此時過表達磷酸烯醇丙酮酸合成酶Pps也再難產生更多PEP，限制了L-Phe產量。此外，胞內E4P供應不足時，也無法與PEP縮合生成DAHP，使反應向下進行。為了驗證本研究推測，隨后對轉酮酶TktA進行了強化。

圖5 增強磷酸烯醇丙酮酸合成酶表達對L-Phe合成的影響Fig. 5 Effects of enhanced expression of phosphoenolpyruvate synthase on L-Phe synthesis

與PEP不同，E4P在代謝網絡中分流并不明顯，可通過過表達轉酮酶基因tktA增加E4P的供應[27-28]。為驗證上述猜想，在PHE13-3的基礎上嘗試利用不同強度啟動子控制轉酮酶基因tktA，分別構建了PHE14-1和PHE14-2（分別由PtktA和PBBa_j23106進行調控）。搖瓶發(fā)酵結果如圖6所示，增強E4P供應后，產量仍呈下降趨勢，可以判斷此前的E4P供應充足，不需要加強，且在ΔpykF后，通過強化磷酸烯醇丙酮酸合成酶Pps再難增加PEP供應。此外，在本課題組之前研究中，也嘗試過敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶Ppc，以及利用其他酶代替PTS系統(tǒng)進行糖的攝取以增加PEP供應，而這些策略在增加PEP的同時會嚴重影響菌體的生長。因此僅保留ΔpykF菌株（PHE12）作為最終改造的無質粒、非缺陷型L-Phe工程菌株，并進行5 L發(fā)酵罐發(fā)酵測試。

圖6 增強轉酮酶TktA的表達對L-Phe合成的影響Fig. 6 Effect of enhanced expression of transketolase TktA on L-Phe synthesis

2.4 工程菌發(fā)酵罐發(fā)酵測試結果

為測試效果最佳的PHE12的綜合生產性能，進行5 L發(fā)酵罐分批補料發(fā)酵培養(yǎng)（發(fā)酵過程無需添加抗生素及缺陷型氨基酸，降低了發(fā)酵生產成本）。如圖7所示，發(fā)酵初期菌體生長迅速，于36 h OD600nm值達到最高，隨后逐漸降低。發(fā)酵12 h后，L-Phe產量呈穩(wěn)定趨勢一直增長。生產至48 h后，L-Phe產量達81.8 g/L，生產強度達1.7 g/（L·h），糖酸轉化率（以葡萄糖計）為0.24 g/g。

圖7 工程菌PHE12在5 L發(fā)酵罐分批補料發(fā)酵曲線Fig. 7 Time course of fed-batch fermentation of the engineered strain PHE12 in a 5 L bioreactor

3 結 論

本研究按照系統(tǒng)代謝工程思路對L-Phe代謝途徑進行模塊化改造，構建了1 株非缺陷型、無質粒、高效合成L-Phe的大腸桿菌工程菌株。該菌株構建過程如下：1）通過在轉錄抑制因子TyrR位點處整合解除反饋抑制的雙功能酶與轉氨酶，增強了L-Phe的合成；2）通過對莽草酸途徑各基因進行梯度強度優(yōu)化，確定了各反應中酶的最適表達強度，同時確保了后半段代謝通路的通暢；3）通過引入解除反饋抑制的DAHP合成酶增強L-Phe的合成途徑；4）通過敲除丙酮酸激酶PykF增加PEP的供應，進而增加L-Phe產量，以葡萄糖為碳源進行分批補料發(fā)酵48 h，工程菌PHE12的L-Phe產量達到81.8 g/L，糖酸轉化率達0.24 g/g，生產強度達1.7 g/（L·h）。目前文獻報道的L-Phe最高發(fā)酵水平為72.9 g/L，生產強度為1.4 g/（L·h）（發(fā)酵52 h），與該菌株相比，PHE-12的L-Phe產量提高了12.2%，生產強度較該菌株提高21.4%。與現(xiàn)有L-Phe工程菌株相比，該工程菌具備以下優(yōu)點：1）菌株為非缺陷型且不含質粒，避免了抗生素及缺陷型氨基酸的使用；2）生產強度高。該工程菌的構建降低了生產成本，具有良好的工業(yè)化前景。