β-乳球蛋白聚乙二醇定點(diǎn)修飾物的制備及其抗原性變化

劉成梅，江辛琳，李冬梅，周 磊，鐘俊楨，吉 莉，羅舜菁,*

（1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.江西丹霞生物科技股份有限公司，江西 鷹潭 335200）

牛乳過敏是一種常見的食物過敏反應(yīng)。在導(dǎo)致牛乳過敏反應(yīng)的蛋白中，β-乳球蛋白（beta-lactoglobulin，β-LG）被認(rèn)為是主要的過敏原[1]。采用共價(jià)修飾技術(shù)降低β-LG抗原性[2]已成為國(guó)際乳制品加工技術(shù)研究的重點(diǎn)。但常用共價(jià)修飾手段如糖基化[3]、磷酸化[4]等隨機(jī)修飾，存在修飾位點(diǎn)選擇性低、穩(wěn)定性不理想、修飾產(chǎn)物不均一等問題。研究表明β-LG抗原性同時(shí)受線性表位和構(gòu)象表位影響[5]，共價(jià)修飾發(fā)生在不同位點(diǎn)會(huì)對(duì)蛋白構(gòu)象及抗原性產(chǎn)生不同影響[6]。為明晰不同位點(diǎn)共價(jià)修飾對(duì)β-LG抗原性的影響，實(shí)現(xiàn)共價(jià)修飾對(duì)β-LG抗原性的有效調(diào)控，需采用定點(diǎn)修飾技術(shù)以制備均一化修飾產(chǎn)物。

聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）定點(diǎn)修飾技術(shù)，是能針對(duì)特定基團(tuán)或?qū)Ｒ晃稽c(diǎn)進(jìn)行修飾的共價(jià)修飾方法。PEG在人體內(nèi)代謝簡(jiǎn)單、毒性小，具有較好的生物相容性、低免疫原性和生物學(xué)惰性，其安全性已經(jīng)過FDA認(rèn)證[7]。目前關(guān)于β-LG的PEG化研究較少，Nijs[8]和Zhong Junzhen[9]等利用第一代PEG隨機(jī)修飾對(duì)β-LG進(jìn)行修飾，但修飾很大程度上存在隨機(jī)性，修飾產(chǎn)物多為不同修飾度及同分異構(gòu)體的混合物且修飾率低[10]。本研究團(tuán)隊(duì)采用PEG定點(diǎn)修飾技術(shù)針對(duì)β-LG不同位點(diǎn)進(jìn)行修飾以系統(tǒng)地探究不同位點(diǎn)對(duì)β-LG抗原性的影響，前期分別對(duì)β-LG的N-末端氨基[11]、谷氨酰胺殘基[12-13]進(jìn)行了定點(diǎn)修飾產(chǎn)物的制備，在單修飾產(chǎn)物的制備中，發(fā)現(xiàn)不同修飾條件會(huì)產(chǎn)生不同修飾度的修飾產(chǎn)物，修飾條件對(duì)產(chǎn)物修飾率及純度影響極大，若選取不當(dāng)還會(huì)導(dǎo)致修飾產(chǎn)物難以分離純化。并且針對(duì)不同基團(tuán)進(jìn)行PEG修飾能不同程度改變?chǔ)?LG構(gòu)象并有效降低β-LG抗原性。

在PEG蛋白修飾常用基團(tuán)中，巰基因其含量少成為PEG定點(diǎn)修飾中的理想位點(diǎn)[14]，目前針對(duì)β-LG巰基使用PEG定點(diǎn)修飾的鮮見報(bào)道。并且β-LG第121位半胱氨酸（Cys121）游離巰基位于被97%人血清識(shí)別的主要抗原表位肽段AA102-124中[15]，游離巰基或是探究不同結(jié)合位點(diǎn)對(duì)β-LG抗原性影響及實(shí)現(xiàn)β-LG致抗原性調(diào)控的關(guān)鍵位點(diǎn)。因此本研究針對(duì)β-LG Cys121游離巰基，選擇5 kDa單甲氧基聚乙二醇-馬來酰亞胺（methoxyPEG-maleimide，mPEG-MAL）對(duì)其進(jìn)行定點(diǎn)修飾（圖1），以期獲得高修飾率β-LG PEG定點(diǎn)修飾產(chǎn)物，并對(duì)修飾前后β-LG抗原性進(jìn)行探究。

圖1 β-LG與mPEG-MAL共價(jià)結(jié)合示意圖Fig. 1 Schematic diagram of β-LG/mPEG-MAL covalent binding

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛乳β-LGAB、兔抗β-LG IgG一抗、明膠 美國(guó)Sigma-Aldrich Chemistry公司；5 kDa mPEG-MAL北京鍵凱科技股份有限公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）試劑盒及4×上樣緩沖液（含β-巰基乙醇）、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記羊抗兔IgG酶標(biāo)二抗、5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸) 北京索萊寶科技有限公司；三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽（tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride，TCEP） 阿拉丁化工有限公司；乙二胺四乙酸二鈉（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）西隴科學(xué)股份有限公司；蛋白Marker 美國(guó)Thermo公司；所有試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

Mini-PROTEAN小型垂直電泳儀、NGC Quest 10 Plus中高壓層析系統(tǒng)、Enrich SEC70 10×300凝膠柱美國(guó)Bio-Rad公司；SP Sepharose Fast Flow色譜柱（25 mL）美國(guó)GE公司；Five Easy Plus pH計(jì)、ME104型電子天平梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Simplicity UV超純水系統(tǒng)、ME104型電子分析天平、Amico Ultra-15超濾離心管 美國(guó)Millipore公司；SYC-A水浴恒溫?fù)u床 常州金壇精達(dá)儀器制造有限公司；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司；Heraeus Multifuge X1R高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Thermo公司；HF2000酶標(biāo)儀 北京華安麥科生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 修飾反應(yīng)條件優(yōu)化

參考Natarajan等[16]的MAL法，稍作修改。β-LG與20 倍物質(zhì)的量的mPEG-MAL反應(yīng)，在0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）（pH 7.0，含2 倍物質(zhì)的量TCEP及2 mmol/L EDTA）中4 ℃反應(yīng)12 h。以此反應(yīng)條件為基礎(chǔ)進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.3.1.1 β-LG與mPEG-MAL反應(yīng)物質(zhì)的量比

根據(jù)1.3.1節(jié)方法，β-LG與mPEG-MAL分別以物質(zhì)的量比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶30、1∶40在0.1 mol/L pH 7.0 PBS（含2 倍物質(zhì)的量TCEP和2 mmol/L EDTA）中4 ℃反應(yīng)12 h。分別取樣考察β-LG與mPEG-MAL反應(yīng)物質(zhì)的量比對(duì)修飾反應(yīng)的影響。

1.3.1.2 反應(yīng)時(shí)間

根據(jù)1.3.1節(jié)方法，β-LG與mPEG-MAL以物質(zhì)的量比1∶20在0.1 mol/L，pH 7.0 PBS（含2 倍物質(zhì)的量TCEP和2 mmol/L EDTA）中4 ℃反應(yīng)0、4、8、12、24、48 h。分別取樣研究反應(yīng)時(shí)間對(duì)修飾反應(yīng)的影響。

1.3.1.3 pH值

根據(jù)1.3.1節(jié)方法，β-LG與mPEG-MAL以物質(zhì)的量比1∶20在0.1 mol/L，pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 PBS（含2 倍物質(zhì)的量TCEP和2 mmol/L EDTA）中4 ℃反應(yīng)12 h。分別取樣考察pH值對(duì)修飾反應(yīng)的影響。

1.3.1.4 TCEP添加量

根據(jù)1.3.1節(jié)方法，β-LG與mPEG-MAL以物質(zhì)的量比1∶20在0.1 mol/L，pH 7.0 PBS（含不同物質(zhì)的量TCEP，TCEP為β-LG物質(zhì)的量的0、1、2、3、4 倍和2 mmol/L EDTA）中4 ℃反應(yīng)12 h。分別取樣考察TCEP添加量對(duì)修飾反應(yīng)的影響。

1.3.1.5 乙醇體積分?jǐn)?shù)

根據(jù)1.3.1節(jié)方法，β-LG與mPEG-MAL以物質(zhì)的量比1∶20在0.1 mol/L，pH 7.0 PBS（含2 倍物質(zhì)的量TCEP，2 mmol/L EDTA及不同體積分?jǐn)?shù)乙醇0%、5%、10%、15%、20%、25%）中4 ℃反應(yīng)12 h。分別取樣考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)修飾反應(yīng)的影響。

1.3.2 SDS-PAGE測(cè)定樣品

電泳凝膠濃縮膠5%，分離膠12%[17]，將30 μL蛋白樣品與10 μL 4×上樣緩沖液（含β-巰基乙醇）混合，于100 ℃水浴鍋中煮沸7 min至變性，冷卻后離心2 min；加樣，每孔約10 μL樣品；濃縮膠電泳80 V、15 min，分離膠以120 V約50 min電泳至使溴酚藍(lán)條帶到達(dá)電泳膠底部；染色，取出凝膠置于考馬斯亮藍(lán)染色液中染色2 h左右；脫色，使用蒸餾水漂洗凝膠數(shù)次后，置于脫色液中脫色直至蛋白條帶清晰。

1.3.3 凝膠過濾色譜分析

參考甘克明[11]和薛曉瑩[18]，通過凝膠過濾色譜分析不同反應(yīng)條件下修飾產(chǎn)物的修飾率。反應(yīng)混合液通過Bio-Rad Enrich SEC70 10×300凝膠柱進(jìn)行分析，洗脫緩沖液為0.01 mol/L的PBS，流速為1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。修飾率的計(jì)算，通過自帶軟件積分計(jì)算產(chǎn)物各組分峰面積。

1.3.4 陽離子交換層析

修飾產(chǎn)物通過陽離子交換層析進(jìn)行分離純化得到，參考Zhong Junzhen[9]和Yu Pengzhan[19]等的方法，將修飾混合液經(jīng)陽離子層析交換柱SP Sepharose Fast Flow進(jìn)行分離。洗脫液A：0.04 mol/L，pH 4.5乙酸鈉緩沖液；洗脫液B：0.04 mol/L，pH 4.5乙酸鈉緩沖液+1.0 mol/L NaCl；首先用洗脫液A平衡柱子，流速為2 mL/min；進(jìn)樣，使用洗脫液B 進(jìn)行梯度洗脫，洗脫梯度為0%～100%，流速為2 mL/min，洗脫90 min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。收集洗脫峰，使用SDS-PAGE對(duì)洗脫峰進(jìn)行鑒定。大量收集樣品后使用截留分子質(zhì)量10 kDa的Amico Ultra-15超濾離心管對(duì)目標(biāo)峰產(chǎn)物于4 ℃、6 000 r/min離心15 min，并使用0.1 mol/L pH 7.0 PBS置換樣品中洗脫液，濃縮得到樣品。

1.3.5 游離巰基含量測(cè)定

使用Ellman試劑對(duì)修飾前后β-LG樣品游離巰基含量進(jìn)行測(cè)定。將樣品配制為1 mg/mL，取50 μL待測(cè)樣品與加入4 mL Tris-Gly緩沖液中，于25 ℃恒溫1 h。加入25 μL 0.01 mol/L 5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)混合均勻，靜置。使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定檢測(cè)波長(zhǎng)為412 nm處吸光度（A412nm）。以5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)在波長(zhǎng)412 nm處消光系數(shù)13 600 L/（mol·cm）計(jì)算游離巰基含量。游離巰基含量以每克蛋白的物質(zhì)的量計(jì)（μmol/g）[20-21]。

1.3.6 抗原性測(cè)定

采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定修飾前后蛋白樣品抗原性。包被：每孔加入100 μL 2.5 μg/mL包被抗原4 ℃過夜；洗板，拍干，封阻：每孔加入250 μL 1%明膠，37 ℃溫育1 h。洗板，拍干，每孔加入50 μL待測(cè)樣品及50 μL兔抗β-LG抗體（1∶5 000稀釋），37 ℃溫育1 h；洗板，拍干，每孔加入100 μL HRP標(biāo)記羊抗兔酶標(biāo)二抗（1∶7 000稀釋），37 ℃溫育2 h；洗板，拍干，每孔加入100 μL TMB顯色液，37 ℃避光反應(yīng)15 min；終止反應(yīng)：每孔加入100 μL 1 mol/L H2SO4溶液；使用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定吸光度。每個(gè)樣品平行做3 次，取平均值。以不同濃度梯度β-LG對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，各濃度梯度β-LG對(duì)應(yīng)吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。抗原性變化率按下式[22]計(jì)算：

式中：A0為無競(jìng)爭(zhēng)對(duì)照孔吸光度；A1為β-LG吸光度；A2為待測(cè)樣品吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3 次重復(fù)的平均值，使用Origin 9.0軟件作圖，使用SPSS 17.0軟件分析數(shù)據(jù)顯著性（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 β-LG與mPEG-MAL反應(yīng)物質(zhì)的量比對(duì)修飾反應(yīng)的影響

圖2 β-LG與mPEG-MAL反應(yīng)物質(zhì)的量比對(duì)SDS-PAGE（a）及修飾率（b）的影響Fig. 2 Effect of molar ratio of β-LG to mPEG-MAL on modification efficiency

如圖2a所示，條帶1～6對(duì)應(yīng)修飾率分別為3.2%、11.3%、18.6%、26.3%、41.2%、41.9%（圖2b）。產(chǎn)物修飾率隨mPEG-MAL添加比例的增加而升高，反應(yīng)物質(zhì)的量比達(dá)1∶30后，增加PEG的量修飾率變化不明顯。因此選擇1∶30作為最佳蛋白與PEG物質(zhì)的量比。

2.1.2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)修飾反應(yīng)結(jié)果的影響

圖3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)SDS-PAGE（a）及修飾率（b）的影響Fig. 3 Effect of reaction time on modification efficiency

如圖3a所示，條帶1～6對(duì)應(yīng)修飾率分別為4.1%、18.3%、23.6%、31.4%、42.1%、42.8%（圖3b）。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過24 h后，β-LG與mPEG-MAL反應(yīng)完全，PEG修飾產(chǎn)物的量達(dá)到最大。因此選擇24 h作為最佳反應(yīng)時(shí)間。

2.1.3 pH值對(duì)修飾反應(yīng)的影響

如圖4a所示，條帶1～6對(duì)應(yīng)修飾率分別為33.8%、32.1%、34.9%、36.7%、34.2%、35.5%（圖4b）。研究顯示β-LG對(duì)溶液pH值變化敏感，在生理pH值下β-LG以非共價(jià)二聚體和單體平衡狀態(tài)存在，pH值改變可引起β-LG形態(tài)在單體與聚集狀態(tài)間轉(zhuǎn)變[23-24]。而實(shí)驗(yàn)中不同pH值下的修飾率無顯著變化，說明此反應(yīng)條件可能較好地保持β-LG在不同pH值溶液中的穩(wěn)定性。也可能因PEG鏈包裹在蛋白外部能形成一層獨(dú)特的水化層，其對(duì)蛋白產(chǎn)生空間屏蔽的保護(hù)作用[25]，使得pH值變化對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物修飾率影響不顯著，因此選擇生理?xiàng)l件pH 7為最佳反應(yīng)pH值。

圖4 反應(yīng)pH值對(duì)SDS-PAGE（a）及修飾率（b）的影響Fig. 4 Effect of reaction pH on modification efficiency

2.1.4 TCEP添加量對(duì)反應(yīng)結(jié)果的影響

圖5 TCEP添加量對(duì)SDS-PAGE（a）及修飾率（b）的影響Fig. 5 Effect of TCEP concentration on modification efficiency

因β-LG蛋白分子含有一游離巰基，β-LG在溶液中常以單體和二聚體形式共同存在[24]。在反應(yīng)中添加還原劑TCEP，能有效避免蛋白分子間二聚體的形成[26]，以便于mPEG-MAL與β-LG游離巰基的連接。將不同TCEP反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE及凝膠過濾色譜分析，圖5a中條帶1～5對(duì)應(yīng)修飾率分別為5.9%、17.9%、32.5%、42.1%、43.2%（圖5b）。隨著TCEP添加量的增加，反應(yīng)產(chǎn)物修飾率得到顯著提升，當(dāng)TCEP添加量至蛋白3 倍后，修飾率無顯著變化，因此選擇3 倍物質(zhì)的量為本實(shí)驗(yàn)最佳TCEP添加量。

2.1.5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)反應(yīng)的影響

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)SDS-PAGE（a）及修飾率（b）的影響Fig. 6 Effects of ethanol concentration on modification efficiency

如圖6a所示，條帶1～6分別對(duì)應(yīng)修飾率為35.6%、37.1%、37.8%、40.1%、39.8%、49.2%（圖6b），乙醇體積分?jǐn)?shù)為25%時(shí)修飾率達(dá)到最高為49.2%。彭飛[27]在水溶液中添加20%比例乙醇溶液使干擾素beta 1b的PEG單修飾產(chǎn)物產(chǎn)率提高20%，一定比例乙醇溶劑能使蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)松散發(fā)生可逆性改變從而提高修飾率。在本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)30%時(shí)，蛋白出現(xiàn)大量不溶沉淀，說明高濃度乙醇環(huán)境蛋白溶解性下降，不適合進(jìn)行修飾反應(yīng)，因而未對(duì)更高濃度進(jìn)行條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

綜上，通過單因素試驗(yàn)，研究不同反應(yīng)條件對(duì)該修飾反應(yīng)的影響，確定本實(shí)驗(yàn)最佳修飾條件：β-LG與mPEG-MAL物質(zhì)的量比1∶30，在0.1 mol/L、pH 7.0的PBS（含3 倍物質(zhì)的量的TCEP，25%乙醇溶液及2 mmol/L EDTA）中4 ℃反應(yīng)24 h。

2.2 修飾產(chǎn)物的分離純化及修飾率鑒定

β-LG等電點(diǎn)在5.1～5.3左右[28]，修飾所用PEG化合物為電中性不帶電，經(jīng)修飾后，PEG會(huì)屏蔽蛋白表面電荷使蛋白表面所帶電荷有所區(qū)別[11]，因此本實(shí)驗(yàn)可采用陽離子交換層析分離純化β-LG-MAL修飾產(chǎn)物。實(shí)驗(yàn)中，β-LG在pH 4.5的緩沖液中帶正電，吸附于帶負(fù)電的層析介質(zhì)中；而β-LG-MAL修飾產(chǎn)物經(jīng)PEG修飾后與層析介質(zhì)的結(jié)合強(qiáng)度會(huì)有所減弱，因此β-LG-MAL修飾產(chǎn)物會(huì)先于未修飾的蛋白而被洗脫下來[28]。

圖7 陽離子交換層析純化β-LG-MAL的單修飾產(chǎn)物（a）和洗脫峰SDS-PAGE（b）Fig. 7 Cation exchange chromatogram of PEGylated β-LG (a) and SDS-PAGE analysis of eluates (b)

根據(jù)單因素試驗(yàn)優(yōu)化得出最佳修飾條件，制備β-LG PEG定點(diǎn)修飾產(chǎn)物，并對(duì)優(yōu)化產(chǎn)物進(jìn)行分離純化。將修飾混合液經(jīng)陽離子層析交換柱SP Sepharose Fast Flow進(jìn)行分離純化，如圖7所示，得到2 個(gè)洗脫峰，并通過SDSPAGE對(duì)洗脫峰進(jìn)行鑒定驗(yàn)證，分析顯示保留時(shí)間較短的峰1為β-LG-MAL的單修飾產(chǎn)物（圖7b，條帶2），分子質(zhì)量約為28 kDa；峰2為未反應(yīng)完全的β-LG（圖7b，條帶1），分子質(zhì)量約為18 kDa；β-LG-MAL的單修飾產(chǎn)物表觀分子質(zhì)量高于單點(diǎn)修飾產(chǎn)物的理論分子質(zhì)量，是因?yàn)楫?dāng)PEG溶于溶液中時(shí)，分子中的乙氧基單元易于水分子結(jié)合，使其水化半徑增大，表觀分子質(zhì)量約為PEG實(shí)際分子質(zhì)量的2～3 倍，因此本實(shí)驗(yàn)中制得產(chǎn)物為β-LGMAL的單修飾產(chǎn)物。圖6a顯示陽離子交換層析分離效果較好，優(yōu)化產(chǎn)物修飾率達(dá)64.1%，遠(yuǎn)高于β-LG隨機(jī)修飾的修飾率38%[29]。

2.3 修飾產(chǎn)物純度的鑒定

大量收集圖7a中峰1，使用截留分子質(zhì)量為10 kDa的超濾離心管于冷凍離心機(jī)中以6 000 r/min離心15 min，濃縮得到β-LG-MAL的單修飾產(chǎn)物樣品（圖7b，條帶3）。取樣通過凝膠過濾色譜測(cè)定修飾產(chǎn)物純度，如圖8所示，當(dāng)洗脫液體積為9.5 mL時(shí)所出峰為單修飾產(chǎn)物β-LG-MAL，通過柱層析系統(tǒng)軟件峰面積計(jì)算樣品純度達(dá)94%。

圖8 β-LG-MAL單修飾產(chǎn)物高效凝膠過濾色譜圖Fig. 8 High performance liquid chromatogram of cysteine-specific PEGylated β-LG

2.4 修飾位點(diǎn)鑒定

β-LG中，每個(gè)β-LG單體中含有5 個(gè)半胱氨酸殘基，其中Cys66和Cys160、Cys106和Cys119在結(jié)構(gòu)緊密的β-LG內(nèi)部?jī)蓛尚纬闪? 個(gè)二硫鍵[30]，僅有一游離巰基Cys121位于蛋白α-螺旋與β-折疊結(jié)構(gòu)交界面的疏水空腔[31]，第121位半胱氨酸游離巰基是實(shí)現(xiàn)PEG定點(diǎn)修飾的理想位點(diǎn)。目前未有對(duì)β-LG巰基進(jìn)行PEG定點(diǎn)修飾的相關(guān)研究，因此參考蔡小飛等[22]采用三硝基苯磺酸法測(cè)定氨基含量確定PEG衍生物與β-LG氨基的結(jié)合情況，因此本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)游離巰基含量進(jìn)行測(cè)定以確定PEG衍生物與β-LG游離巰基的結(jié)合情況。

實(shí)驗(yàn)中所用mPEG-MAL是一種巰基特異性PEG衍生物。mPEG-MAL與Cys121游離巰基的特異性結(jié)合結(jié)果驗(yàn)證可以體現(xiàn)在兩方面：首先，對(duì)修飾產(chǎn)物進(jìn)行電泳鑒定發(fā)現(xiàn)所得產(chǎn)物為僅有一單一條帶的單修飾產(chǎn)物。若PEG結(jié)合在非Cys121的任何巰基，說明蛋白內(nèi)部二硫鍵打開，存在多個(gè)游離巰基，則2.1.1節(jié)中在mPEG-MAL加入過量情況下，修飾產(chǎn)物的SDS-PAGE不應(yīng)為單一條帶，而是出現(xiàn)多修飾條帶，電泳鑒定發(fā)現(xiàn)所得產(chǎn)物僅有一單一條帶說明本實(shí)驗(yàn)中蛋白內(nèi)部二硫鍵保持完好。再者，在蛋白內(nèi)部二硫鍵保持完好的情況下，β-LG游離巰基含量即β-LG唯一游離巰基Cys121游離巰基的含量。對(duì)分離純化后產(chǎn)物進(jìn)行游離巰基含量測(cè)定顯示，經(jīng)PEG修飾后β-LG游離巰基含量由52.3 μmol/g降為0.3 μmol/g（P＜0.05）（表1），說明修飾產(chǎn)物中Cys121游離巰基含量幾乎降為零，游離巰基已與mPEG-MAL發(fā)生共價(jià)結(jié)合，因此未被檢測(cè)到。綜上，可驗(yàn)證Cys121游離巰基已與mPEG-MAL發(fā)生特異性結(jié)合。

表1 游離巰基含量測(cè)定結(jié)果Table 1 Results of determination of free sulfhydryl group

2.5 修飾前后β-LG抗原性分析

圖9 PEG修飾對(duì)β-LG抗原性影響Fig. 9 Effect of PEGylation on antigenicity of β-LG

研究顯示PEG修飾能有效降低蛋白免疫原性[8]，然而本實(shí)驗(yàn)經(jīng)mPEG-MAL對(duì)β-LG Cys121游離巰基定點(diǎn)修飾后，β-LG-MAL抗原性顯著提高約25.9%，如圖9所示。本團(tuán)隊(duì)前期采用PEG定點(diǎn)修飾β-LG谷氨酰胺殘基得到產(chǎn)物β-LG-NH2，β-LG-NH2抗原性顯著下降59.04%[12]；對(duì)β-LG的N-末端氨基進(jìn)行修飾得到β-LG-ALD，β-LG-ALD抗原性顯著下降53.8%[11]，該2 種位點(diǎn)修飾使蛋白抗原性下降原因都?xì)w結(jié)于PEG鏈對(duì)于蛋白的空間屏蔽作用，掩蓋了β-LG表面部分抗原決定簇。本實(shí)驗(yàn)中，PEG的巰基定點(diǎn)修飾卻沒有因PEG鏈的屏蔽使抗原性下降，說明結(jié)合位點(diǎn)對(duì)β-LG抗原性的影響較PEG鏈的屏蔽作用更為顯著。β-LG中肽段AA41-46、AA102-124和AA149-163為主要抗原表位，分別為92%、97%、89%的人血清識(shí)別[15]。實(shí)驗(yàn)中Cys121游離巰基位于被97%人血清識(shí)別的主要抗原表位肽段AA102-124中[15]，并且由于β-LG致敏性同時(shí)受線性表位和構(gòu)象表位影響[5]，因此可能是修飾后原處于蛋白內(nèi)部的致敏位點(diǎn)暴露，或者有新的構(gòu)象致敏表位形成導(dǎo)致β-LG致抗原性顯著提升。

3 結(jié)論與討論

本研究采用PEG定點(diǎn)修飾技術(shù)，使用5 kDa mPEGMAL對(duì)β-LG第121位游離巰基進(jìn)行修飾。通過單因素試驗(yàn)不同條件對(duì)修飾反應(yīng)結(jié)果的影響，得到最佳修飾條件：β-LG與mPEG-MAL物質(zhì)的量比1∶30，在0.1 mol/L、pH 7.0的PBS（含3 倍物質(zhì)的量的TCEP，25%乙醇及2 mmol/L EDTA）中4 ℃反應(yīng)24 h，在此條件下蛋白修飾率達(dá)64.1%，對(duì)比β-LG的PEG隨機(jī)修飾定點(diǎn)修飾率有大幅提高，約為傳統(tǒng)修飾的1.7 倍。陽離子交換層析顯示，實(shí)驗(yàn)中所選擇洗脫條件及溶液對(duì)β-LG-MAL單修飾產(chǎn)物分離純化效果較好，收集純化產(chǎn)物對(duì)樣品純度進(jìn)行鑒定，所得樣品純度達(dá)94%。通過電泳聯(lián)合巰基含量檢測(cè)對(duì)修飾位點(diǎn)進(jìn)行鑒定確定β-LG第121位游離巰基與mPEG-MAL發(fā)生特異性結(jié)合。

β-LG-MAL抗原性測(cè)定結(jié)果前期實(shí)驗(yàn)截然不同，與前期不同位點(diǎn)修飾進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)共價(jià)位點(diǎn)對(duì)蛋白抗原性的影響顯著高于PEG鏈對(duì)抗原決定簇的屏蔽作用。經(jīng)巰基修飾后β-LG抗原性提升25.9%，抗原性的提升可能由于修飾后原處于蛋白內(nèi)部的致敏位點(diǎn)暴露，或者是新蛋白構(gòu)象致敏表位的形成。本實(shí)驗(yàn)說明與普通共價(jià)修飾相比，PEG定點(diǎn)修飾能有效探究不同位點(diǎn)對(duì)β-LG抗原性的影響，而對(duì)于巰基修飾致使β-LG抗原性提升的機(jī)理驗(yàn)證，還需下一步對(duì)修飾前后β-LG構(gòu)象變化等進(jìn)行探究以確定β-LG構(gòu)象、結(jié)合位點(diǎn)與抗原性之間的關(guān)系。