酸棗仁提取物與茶氨酸復(fù)合配方對(duì)睡眠的改善作用

陳瓊，陳朋，李俊穎，徐旻珺

(仙樂健康科技股份有限公司，廣東 汕頭，515041)

失眠是最常見的睡眠障礙疾病，我國每年有超過1/3的成年人睡眠質(zhì)量低下[1]。目前用于治療失眠的藥物有很多，如唑吡坦、佐匹克隆等。鎮(zhèn)靜催眠藥物已經(jīng)發(fā)展到了第3代，療效不斷提升，但使用催眠鎮(zhèn)靜藥物會(huì)產(chǎn)生乏力、頭暈等不可避免的副作用[2]，以食療代替藥物改善睡眠質(zhì)量的方法受到越來越多的關(guān)注。文獻(xiàn)報(bào)道酸棗仁、茶氨酸均有改善睡眠的作用[3-4]。酸棗仁是臨床常用于治療失眠的一味中藥，最早用于漢代名醫(yī)張仲景所寫的《金匱要略·血脾虛勞病脈證》，具有清熱養(yǎng)血、安神除煩的功效[5]。酸棗仁中的有效成分已經(jīng)被學(xué)者所發(fā)現(xiàn)，對(duì)其改善睡眠的作用機(jī)制的研究也越來越深入。L-茶氨酸是一種在20世紀(jì)90年代由日本科學(xué)家發(fā)現(xiàn)于茶葉中的非蛋白質(zhì)游離氨基酸，具有改善睡眠的功效[6]。由于酸棗仁已被錄入藥食同源名單，茶氨酸被批準(zhǔn)為新資源食品，作為食品原料安全性佳，必然會(huì)受到市場廣泛關(guān)注。目前，關(guān)于酸棗仁改善睡眠的研究很多，但尚未見將酸棗仁與茶氨酸聯(lián)用的報(bào)道。本研究在對(duì)這2種原料研究的基礎(chǔ)上，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探尋酸棗仁與茶氨酸聯(lián)用的合適用量，并探究它們與小鼠部分血液和腦組織指標(biāo)的關(guān)系，為助眠產(chǎn)品的研發(fā)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸棗仁提取物，楊凌萃健生物工程技術(shù)有限公司；茶氨酸，湖南金農(nóng)生物資源股份有限公司；戊巴比妥鈉、巴比妥鈉，德國Sigma公司；小鼠色氨酸、小鼠5-羥色胺、小鼠β-內(nèi)啡肽ELISA試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

一次性注射器，江西洪達(dá)醫(yī)療器械集團(tuán)；XS1003S型電子天平，瑞士Mettler Toledo公司；Centrifuge 5425離心機(jī)，德國Eppendorf公司；Synergy H1酶標(biāo)儀，美國Biotek公司。

1.3 動(dòng)物與分組

SPF級(jí)Balb-c健康雄性小鼠120只(8周齡，18～20 g)，小鼠隨機(jī)分為4批，每批30只。各批間體質(zhì)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。第1批用于直接睡眠以及延長戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間實(shí)驗(yàn);第2批用于戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn);第3批用于縮短巴比妥鈉睡眠潛伏期時(shí)間實(shí)驗(yàn);第4批用于小鼠血液中色氨酸、5-羥色胺含量，腦組織中5-羥色胺、β-內(nèi)啡肽含量的測定。

1.4 配方與劑量

每批小鼠隨機(jī)分成3組，每組各10只小鼠，分為空白對(duì)照組，低劑量組和高劑量組。空白對(duì)照組以與實(shí)驗(yàn)組同體積蒸餾水進(jìn)行灌胃；低劑量組為酸棗仁提取物105 mg/(kg·d)，茶氨酸58 mg/(kg·d)，高劑量組為酸棗仁提取物158 mg/(kg·d)，茶氨酸87 mg/(kg·d)，依據(jù)劑量分別配制灌胃液，灌胃體積為0.2 mL/10 g，每日1次。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 直接睡眠實(shí)驗(yàn)

將第1批小鼠按1.4中方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，連續(xù)給樣品30 d，末次以動(dòng)物的翻正反射消失為入睡指標(biāo)觀察小鼠睡眠情況。

1.5.2 延長戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間實(shí)驗(yàn)

將用于直接睡眠實(shí)驗(yàn)的各組小鼠在末次給受試物后20 min經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉0.2 mL/20 g，以動(dòng)物的翻正反射消失為指標(biāo)，觀察樣品能否延長戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間。

1.5.3 戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn)

將第2批小鼠按1.4中方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，連續(xù)給樣品30 d，末次給樣品20 min后經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉30 mg/(kg·d)，以動(dòng)物的翻正反射消失為指標(biāo)，觀察30 min內(nèi)小鼠睡眠情況。

1.5.4 巴比妥鈉睡眠潛伏期實(shí)驗(yàn)

將第3批小鼠按1.4中方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，連續(xù)給樣品30 d后。末次給樣品20 min后經(jīng)腹腔注射巴比妥鈉0.2 mL/20 g，以翻正反射消失為指標(biāo)，觀察樣品對(duì)巴比妥鈉睡眠潛伏期的影響。

1.5.5 小鼠血液中色氨酸、5-羥色胺含量檢測

將第4批小鼠按1.4中方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，連續(xù)給樣品30 d后，將小鼠處死后取血，放置1 h待血液凝固，5 000 r/min下離心10 min,得到血清，嚴(yán)格按照小鼠色氨酸、小鼠5-羥色胺ELISA檢測試劑盒說明書方法，對(duì)小鼠血液中色氨酸、5-羥色胺含量進(jìn)行檢測。

1.5.6 小鼠腦組織5-羥色胺、β-內(nèi)啡肽含量檢測

將1.5.5中實(shí)驗(yàn)小鼠腦組織取出，參照杜正彩等[7]的方法制成勻漿液進(jìn)行離心后備用，嚴(yán)格按照小鼠5-羥色胺、小鼠β-內(nèi)啡肽ELISA試劑盒說明書方法，對(duì)小鼠腦組織中5-羥色胺，β-內(nèi)啡肽含量進(jìn)行測定。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SAS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，延長戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間實(shí)驗(yàn)、巴比妥鈉睡眠潛伏期實(shí)驗(yàn)、小鼠血液中色氨酸、5-羥色胺含量和腦組織5-羥色胺、β-內(nèi)啡肽含量的組間顯著性比較采用單因素方差分析，數(shù)據(jù)以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn)的組間顯著性比較采用卡方檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果與分析

酸棗仁提取物與茶氨酸復(fù)合配方作用于小鼠的各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)與分析如下文所示。

2.1 對(duì)小鼠直接睡眠的影響

3組小鼠在給予樣品之后均未出現(xiàn)翻正反射消失的現(xiàn)象，表明酸棗仁提取物與茶氨酸復(fù)合配方高低劑量組均無直接睡眠作用。

2.2 對(duì)戊巴比妥鈉誘導(dǎo)睡眠實(shí)驗(yàn)小鼠睡眠時(shí)間的影響

延長戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間實(shí)驗(yàn)方法結(jié)果如圖1-a所示，與對(duì)照組相比，在經(jīng)戊巴比妥鈉誘導(dǎo)后，低劑量組小鼠睡眠時(shí)間并無增加，高劑量組小鼠睡眠時(shí)間較對(duì)照組顯著增長(P<0.01)。

2.3 對(duì)戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn)小鼠入睡率的影響

戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1-b所示，對(duì)照組入睡發(fā)生率僅為10%。與對(duì)照組相比，高低劑量組均顯著提升了小鼠的入睡發(fā)生率，高劑量組入睡發(fā)生率上升尤為明顯(P<0.01)。

2.4 對(duì)巴比妥鈉實(shí)驗(yàn)小鼠睡眠潛伏期時(shí)間的影響

巴比妥鈉睡眠潛伏期實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1-c所示，與對(duì)照組相比，低劑量組小鼠睡眠潛伏時(shí)間有縮短趨勢，但是不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性，高劑量組小鼠睡眠潛伏時(shí)間則顯著縮短(P<0.01)。

2.5 對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

對(duì)3項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中高低劑量組小鼠在0、7、14、21、30 天進(jìn)行體質(zhì)量測量后進(jìn)行統(tǒng)一分析，結(jié)果如表1所示。實(shí)驗(yàn)前各組小鼠初始體質(zhì)量無明顯差異(P>0.05)，在給予樣品后，各組小鼠體質(zhì)量也不呈現(xiàn)顯著性差異(P>0.05)，表明高、低劑量組均對(duì)小鼠體質(zhì)量無明顯影響。

2.6 對(duì)小鼠血液指標(biāo)(色氨酸、5-羥色胺)的影響

小鼠血液中色氨酸、5-羥色胺含量如圖2所示，與對(duì)照組相比，在灌胃酸棗仁提取物茶氨酸復(fù)合配方30 d后，低劑量組血清色氨酸含量有增加趨勢，但不具有顯著性；高劑量組血清色氨酸含量顯著提高(P<0.05)。此外，高低劑量組血液中5-羥色胺的含量與對(duì)照組相比并無顯著差異。

a-延長戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間;b-戊巴比妥鈉閾下劑量實(shí)驗(yàn)小鼠入睡率;c-巴比妥鈉實(shí)驗(yàn)睡眠潛伏期時(shí)間圖1 酸棗仁提取物與茶氨酸復(fù)合配方對(duì)小鼠睡眠的影響Fig.1 Effect of Semen Ziziphi Spinosae extract and theanine compound formula on the sleep quality of mice 注：*表示與對(duì)照組相比，具有顯著性差異(P<0.05)；**表示與對(duì)照組相比，具有顯著性差異(P<0.01)(下同)

表1 酸棗仁提取物與茶氨酸復(fù)合配方對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響 單位：g

2.7 對(duì)小鼠腦組織指標(biāo)(5-羥色胺、β-內(nèi)啡肽)的影響

小鼠腦組織中5-羥色胺、β-內(nèi)啡肽含量如圖3所示。與對(duì)照組相比，給予樣品后低劑量組與高劑量組小鼠腦組織中5-羥色胺的含量均顯著升高(P<0.01)，且具有一定的量效關(guān)系。與之相反，在服食樣品后，與對(duì)照組相比，高低劑量組小鼠腦組織中β-內(nèi)啡肽含量均顯著性降低，且高劑量組更具顯著性(P<0.01)。

a-血清色氨酸;b-血清5-羥色胺圖2 酸棗仁提取物-茶氨酸對(duì)小鼠血液中色氨酸、 5-羥色胺的影響Fig.2 Effect of Semen Ziziphi Spinosae extract and theanine on tryptophan and 5-hydroxytryptamine in mouse blood

a-5-羥色胺;b-β-內(nèi)啡肽圖3 酸棗仁提取物-茶氨酸對(duì)小鼠腦組織中 5-羥色胺和β-內(nèi)啡肽的影響Fig.3 Effect of Semen Ziziphi Spinosae extract and theanine compound formula on 5-hydroxytryptamine and β-endorphin in mouse brain

3 結(jié)論與討論

睡眠-覺醒的機(jī)制是一個(gè)十分復(fù)雜的過程，受到多種因素的調(diào)控[8]，其中色氨酸在誘導(dǎo)睡眠的機(jī)制中起著重要的作用。色氨酸在血液中多以與白蛋白結(jié)合的形態(tài)存在，然而血液中的游離脂肪酸也競爭同樣的結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)血漿中游離脂肪酸水平升高時(shí)，會(huì)導(dǎo)致色氨酸與白蛋白分離，進(jìn)而使血液中游離色氨酸含量上升。過量的游離色氨酸搭乘L-氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白穿過血腦屏障進(jìn)入大腦，之后分別通過2條路徑誘導(dǎo)睡眠：(1)合成5-羥色胺，當(dāng)腦內(nèi)5-羥色胺的濃度升高，就會(huì)使機(jī)體產(chǎn)生疲勞感和睡意，更容易進(jìn)入睡眠狀態(tài)[9]，同時(shí)5-羥色胺作為褪黑素的前體也會(huì)促進(jìn)褪黑素的形成[10]，褪黑素是一種調(diào)節(jié)生物節(jié)律的激素，常用作治療睡眠障礙；(2)激活色氨酸-犬尿酸通路，與神經(jīng)元膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元突觸上的色氨酸、犬尿酸受體結(jié)合，誘發(fā)神經(jīng)性疲勞，最終達(dá)到誘導(dǎo)睡眠的目的[11]。酸棗仁作為一種臨床上治療失眠的中藥，包含多種活性成分，其中脂肪酸種類達(dá)41種，含量達(dá)32%，因此服用酸棗仁可引起瞬時(shí)的血漿游離脂肪酸濃度升高[12-13]，進(jìn)而使色氨酸和白蛋白解離，上調(diào)血漿色氨酸濃度。與此相一致，本文結(jié)果也顯示高劑量組可顯著升高小鼠血液中色氨酸的濃度(圖2-a)，進(jìn)而上調(diào)腦中5-羥色胺濃度(圖3-a)，且與劑量呈現(xiàn)出正相關(guān)關(guān)系。同樣，WANG等[14]發(fā)現(xiàn)酸棗仁中斯皮諾素能顯著抑制5-HT1A激動(dòng)劑，并作為5-HT1A受體拮抗劑延長大鼠的睡眠時(shí)間；LIANG等[15]研究發(fā)現(xiàn)酸棗仁皂苷成分能顯著提高小鼠額葉皮層和海馬中的5-羥色胺水平，與本實(shí)驗(yàn)相一致。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果還證明，酸棗仁提取物與茶氨酸聯(lián)用，在劑量低時(shí)在延長小鼠睡眠時(shí)間和減少睡眠潛伏時(shí)間方面均無改善的趨勢，只增加了入睡率。在劑量高時(shí)則顯現(xiàn)出明顯的改善睡眠作用。茶氨酸的結(jié)構(gòu)與谷氨酸很相似，能在神經(jīng)系統(tǒng)中與谷氨酸受體進(jìn)行競爭性結(jié)合[16]，有研究表明，茶氨酸能促進(jìn)大腦中特別是紋狀體多巴胺的釋放[17]，之后一部分茶氨酸會(huì)被分解成谷氨酸進(jìn)入血液循環(huán)，另一部分則成為合成γ-氨基丁酸的原料[18]。但是，從李靚等[19]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知，當(dāng)茶氨酸劑量為50 mg/(kg·d)時(shí)，也不體現(xiàn)出改善睡眠效果。同樣，配方中所用酸棗仁量的不同，對(duì)小鼠睡眠的干預(yù)效果也有很大的差異[20-21]。本實(shí)驗(yàn)中低劑量組酸棗仁提取物用量為105 mg/(kg·d)，茶氨酸劑量為58 mg/(kg·d)，無法達(dá)到改善睡眠的效果。此外，本實(shí)驗(yàn)中小鼠大腦中β-內(nèi)啡肽的濃度隨著酸棗仁提取物和茶氨酸劑量的升高而降低(圖3-b)。β-內(nèi)啡肽的濃度與睡眠有關(guān)，有文獻(xiàn)報(bào)道貓服用β-內(nèi)啡肽后會(huì)出現(xiàn)失眠癥狀[22]，也有人體實(shí)驗(yàn)證實(shí)體內(nèi)β-內(nèi)啡肽的減少，能夠改善其失眠癥狀[23]，不過尚未有文獻(xiàn)探究酸棗仁或者茶氨酸與β-內(nèi)啡肽間的聯(lián)系，從結(jié)果推測,酸棗仁與茶氨酸聯(lián)用可降低腦組織中β-內(nèi)啡肽的濃度，并且具有量效關(guān)系，對(duì)改善小鼠睡眠也有一定作用。

綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，酸棗仁提取物與茶氨酸復(fù)合配方高劑量組顯著延長戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間、增加戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn)入睡率和減少巴比妥鈉睡眠潛伏實(shí)驗(yàn)睡眠潛伏時(shí)間,且無直接睡眠作用。根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范實(shí)施手冊(cè)》[24]改善睡眠評(píng)價(jià)方法，酸棗仁提取物與茶氨酸復(fù)合配方在酸棗仁提取物158 mg/(kg·d)、茶氨酸87 mg/(kg·d)時(shí)，能顯現(xiàn)出良好的協(xié)同效果，具有明顯的改善睡眠作用，這種作用可能是通過提高血漿色氨酸濃度以及腦中色氨酸代謝產(chǎn)物含量和降低β-內(nèi)啡肽含量來實(shí)現(xiàn)的。