玉米須多糖的乙醇沉淀分離及體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)作用研究

宮春宇，劉羽婷，單佳明，徐碩，邢悅

1(齊齊哈爾大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾，161006) 2(黑龍江省果蔬雜糧飲品工程技術(shù)研究中心，黑龍江 齊齊哈爾，161006)

玉米須(Stigmamaydis)是禾本科植物玉蜀黍ZeamaysL.的花柱和柱頭，是一種藥食兩用材料[1]。玉米須因具有豐富的生理功能，如降血糖、抗氧化、提高免疫力和利尿排毒[2-4]等，而受到廣泛關(guān)注。玉米須多糖是玉米須最重要的活性成分之一，具有含量高、功效廣泛等優(yōu)點(diǎn)，但目前開(kāi)發(fā)利用非常有限，這使得有關(guān)玉米須多糖的研究成為熱點(diǎn)。目前玉米須多糖的研究主要集中在粗多糖的制備方法，脫蛋白、脫色素[5-6]等領(lǐng)域，而關(guān)于玉米須多糖的體內(nèi)功效研究相對(duì)比較薄弱。鄭鴻雁等[7]報(bào)道醇沉制備多糖可以提高小鼠抗體生成脾細(xì)胞數(shù)并一定程度上調(diào)節(jié)小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬功能，但純化對(duì)玉米須多糖體內(nèi)活性的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究分析了多糖純化中常采用的乙醇沉淀分離對(duì)玉米須多糖體內(nèi)免疫活性的影響，為玉米須多糖的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)原料

玉米須，安徽亳州中藥材批發(fā)市場(chǎng)，經(jīng)清洗、烘干、粉碎備用。

1.1.2 主要試劑

膠原蛋白維生素C維生素E粉，湯臣倍健公司；小牛血清，分析純，北京博爾西科技有限公司；Giemsa染液、Hank’s液、阿氏液，分析純，北京博奧拓達(dá)科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器

XSZ-G顯微鏡，上海儀圓顯微鏡公司；UF-20中空纖維超濾裝置，大城縣華泰凈化技術(shù)有限公司；722 N可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海箐華科技儀器有限公司；PYX-DHS-500BS隔水電熱培養(yǎng)箱，北京市永光明醫(yī)療儀器廠。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明小鼠，長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 玉米須多糖制備

玉米須粉熱水煮沸2 h，3 000 r/min離心分離上清液，玉米須殘?jiān)ㄔ偬崛∫淮?，合?次上清液，使用超濾膜分離小分子物質(zhì)(分子質(zhì)量<10 kDa)，收集超濾濃縮液，進(jìn)一步濃縮后烘干至恒重，獲得玉米須超濾多糖(corn silk polysaccharide,CSP)，保存于干燥器中備用。

1.2.2 玉米須多糖乙醇沉淀分離

40%乙醇沉淀多糖(CSP-1)：將CSP研磨后制備成質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%多糖溶液，向多糖液中加入無(wú)水乙醇至乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到40%，4 ℃沉淀24 h，10 000 r/min離心20 min，分離上清液和沉淀，測(cè)量上清液體積用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，沉淀烘干至恒重，即為CSP-1。

80%乙醇沉淀多糖(CSP-2)：向CSP-1分離得到的上清液中繼續(xù)加入無(wú)水乙醇至溶液乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%，4 ℃沉淀24 h，4 000 r/min離心15 min，分離上清液和沉淀，將沉淀烘干至恒重，即為CSP-2。

上清多糖(CSP-3)：將從CSP-2分離得到上清液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，烘干至恒重，即為CSP-3。各多糖得率按公式(1)計(jì)算：

(1)

1.2.3 玉米須多糖成分分析

多糖測(cè)定采用苯酚-硫酸法[8]；蛋白質(zhì)測(cè)定采用凱氏定氮法[9]；總黃酮測(cè)定采用三氯化鋁分光光度法[10]。

1.2.4 體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)作用研究[11]

1.2.4.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明小鼠體質(zhì)量，18～22 g，雌雄各半，每組10只。

1.2.4.2 實(shí)驗(yàn)多糖配制

設(shè)計(jì)14個(gè)實(shí)驗(yàn)組：陰性對(duì)照組(蒸餾水)、陽(yáng)性對(duì)照組(湯臣倍健膠原蛋白維生素C維生素E粉，500 mg/kg)、CSP、CSP-1、CSP-2和CSP-3的低、中、高劑量組(100、200、300 mg/kg)。玉米須多糖溶液經(jīng)巴氏殺菌，冷卻至室溫后，用于灌胃，每只小鼠每天灌胃0.4 mL，實(shí)驗(yàn)時(shí)間為30 d。

1.2.4.3 血清溶血素的測(cè)定

免疫動(dòng)物及血清分離:用生理鹽水配成體積分?jǐn)?shù)2%的綿羊紅細(xì)胞(sheep red blood cell,SRBC)懸液，每只鼠腹腔注射0.2 mL進(jìn)行免疫，4～5 d后摘除眼球取血于離心管中，放置5 h，使血清充分析出，3 000 r/min離心15 min，分離血清，用于凝集實(shí)驗(yàn)。

凝集反應(yīng):用生理鹽水將血清倍比稀釋?zhuān)瑢⒉煌♂尪鹊难宸謩e置于微量血凝實(shí)驗(yàn)板內(nèi)，每孔100 μL，再加入100 μL體積分?jǐn)?shù)0.5%的SRBC懸液，混勻，放入帶有濕潤(rùn)紗布的平盤(pán)內(nèi)，加蓋，于37 ℃溫箱孵育3 h，觀察血球凝集程度。

1.2.4.4 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)(滴片法)

實(shí)驗(yàn)前4～5 d給每只小鼠腹腔注射體積分?jǐn)?shù)2%壓積SRBC 0.2 mL進(jìn)行免疫，頸椎脫臼處死小鼠，每只小鼠腹腔注射含有體積分?jǐn)?shù)5%小牛血清的Hank’s液4 mL，輕輕按揉腹部20次，以充分洗出腹腔巨噬細(xì)胞，然后用注射器吸取腹腔洗液，取0.5 mL洗液加入盛有0.5 mL體積分?jǐn)?shù)1%雞紅細(xì)胞懸液的離心管中，混勻。吸取0.5 mL混合液加入事先做好的載玻片瓊脂圈內(nèi)。將載玻片放入帶有濕潤(rùn)紗布的平盤(pán)中，放置于溫箱內(nèi)37 ℃孵育15～20 min，孵育結(jié)束后迅速用生理鹽水將未貼壁細(xì)胞沖掉，加入甲醇固定10 min，再用Giemsa液染色15 min，用蒸餾水沖洗干凈，晾干。在10×40倍顯微鏡下觀察巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞情況，計(jì)數(shù)。

吞噬率為每100個(gè)巨噬細(xì)胞中，吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞所占的百分率按公式(2)計(jì)算；吞噬指數(shù)為平均每個(gè)巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的個(gè)數(shù)按公式(3)計(jì)算:

(2)

(3)

1.2.4.5 免疫器官指數(shù)的測(cè)定

剖解小鼠，取脾臟、胸腺、腦、肝、腎、心臟和肺并稱(chēng)取質(zhì)量，按公式(4)計(jì)算臟器指數(shù)。

臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)

(4)

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用 Excel 2010 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。Duncan法進(jìn)行多組樣本間差異顯著性分析，LSD法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米須多糖組成分析

超濾法制備的玉米須多糖CSP(復(fù)溶率為95.2%)經(jīng)不同體積分?jǐn)?shù)乙醇沉淀分離后，獲得3個(gè)多糖組分CSP-1、CSP-2和CSP-3，得率分別為23.01%、41.41%和28.02%，其中CSP-2得率遠(yuǎn)高于其他2個(gè)多糖。它們的多糖含量基本相當(dāng)，其中CSP-2和CSP-3略高。3個(gè)組分的多糖絕對(duì)含量(指各組分多糖的得率與其多糖含量之積)之和為32.03%，和初始母多糖CSP相近(35.43%)，其中CSP-2絕對(duì)多糖含量最高為14.68%，占到CSP的41.43%，其次是CSP-3為10.05%，占28.37%，CSP-1最少為7.29%，占20.58%。綜上分析，可見(jiàn)玉米須超濾多糖主要為不溶于體積分?jǐn)?shù)80%乙醇的高分子量多糖，占多糖總量的近一半。同時(shí)CSP-2中蛋白質(zhì)含量是3個(gè)組分中最低的，可見(jiàn)高濃度乙醇沉淀可以有效降低玉米須多糖中蛋白質(zhì)含量，可能有利于后續(xù)純化。體積分?jǐn)?shù)80%乙醇沉淀多糖時(shí)沉淀物成絮狀，4 000 r/min 離心即可，且離心后沉淀結(jié)實(shí)，容易與上清液分離；而體積分?jǐn)?shù)40%乙醇沉淀多糖時(shí)，沉淀物顆粒較小，需10 000 r/min離心，離心后沉淀不結(jié)實(shí)，但可以與上清液較好地分離，沉淀成泥狀。

表1 不同玉米須多糖組成成分Table 1 Component analysis different corn silk polysaccharides

2.2 玉米須多糖對(duì)小鼠血清溶血素的影響

溶血素是一種體液免疫物質(zhì)。由表2可知，4種玉米須多糖的3個(gè)實(shí)驗(yàn)劑量組小鼠產(chǎn)生的抗體都明顯高于陰性對(duì)照組，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)效果顯著，4種玉米須多糖都可以提高小鼠血清中抗體的產(chǎn)生量，具有激活體液免疫能力[11]。通過(guò)組內(nèi)比較發(fā)現(xiàn)，CSP低、中、高劑量組之間抗體水平無(wú)顯著差異，表明CSP對(duì)小鼠體液免疫的激活作用沒(méi)有劑量依賴(lài)性，只需100 mg/kg玉米須多糖，即可達(dá)到激活體液免疫作用。但在另一個(gè)同類(lèi)型實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)CSP低劑量時(shí)表現(xiàn)出劑量依賴(lài)性，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定出入，但也僅限于低濃度是否有劑量依賴(lài)性上，不影響對(duì)其提高體液免疫能力的判斷。CSP-1中和高劑量明顯優(yōu)于低劑量，可見(jiàn)其低濃度時(shí)呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性，但繼續(xù)升高濃度到300 mg/kg對(duì)活性沒(méi)有明顯提升作用。CSP-2 低劑量活性優(yōu)于中和高劑量，說(shuō)明其只需較低濃度即可發(fā)揮激活體液免疫的作用，但濃度過(guò)高反而會(huì)使活性降低，可能是由于其含有一定的起負(fù)面效應(yīng)的物質(zhì)，當(dāng)濃度升高時(shí)，其對(duì)多糖的綜合效果影響增大，導(dǎo)致整體活性下降。隨著濃度的升高,CSP-3的活性先升高后降低，最佳的濃度是200 mg/kg。在組間活性表現(xiàn)上，CSP和CSP-1的所有實(shí)驗(yàn)劑量組都優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組，CSP-2的低劑量和CSP-3的中劑量組優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組，其他劑量與陽(yáng)性對(duì)照組活性相當(dāng)，表明CSP和CSP-1對(duì)小鼠體液免疫的激活作用優(yōu)于市售具有提高免疫功能保健食品的效果，CSP-2和CSP-3不遜于市售陽(yáng)性保健食品的效果；相同劑量比較，CSP-1至少有2個(gè)劑量抗體水平高于CSP-2和CSP-3，表明CSP純化后的3個(gè)組分中活性最好的是CSP-1，其活性與CSP相當(dāng)。

表2 小鼠血清溶血素生成量Table 2 Yields of serum emolysin with different polysaccharides

2.3 玉米須多糖對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬作用影響

巨噬細(xì)胞在細(xì)胞免疫中發(fā)揮重要作用。由表3可知，經(jīng)灌胃后，CSP 三個(gè)劑量、CSP-1中、高劑量和CSP-2 三個(gè)實(shí)驗(yàn)劑量的巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)明顯高于陰性對(duì)照組，表明CSP、CSP-1和CSP-2可提高小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)(P<0.05)，依據(jù)“保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范(2003版)”[11]結(jié)果判定原則(實(shí)驗(yàn)組中任意2個(gè)劑量陽(yáng)性，可判定該功能測(cè)定實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性)，具有提高細(xì)胞免疫功能活性。CSP-3沒(méi)有提高細(xì)胞免疫功能活性。組內(nèi)比較中，發(fā)現(xiàn)CSP高劑量組活性優(yōu)于低、中劑量組，表明對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞的激活作用，在濃度達(dá)到200 mg/kg以上時(shí)具有劑量依賴(lài)性。但在另一個(gè)同類(lèi)型實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)CSP低劑量時(shí)(200 mg/kg以下)表現(xiàn)出劑量依賴(lài)性，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定出入，但2次實(shí)驗(yàn)都證實(shí)CSP有提高細(xì)胞免疫功能活性，僅在不同濃度間活性表現(xiàn)不一致，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步驗(yàn)證。CSP-1的活性呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性，隨著濃度升高，活性提高。CSP-2 低和中劑量活性優(yōu)于高劑量，表明其只需較低濃度即可發(fā)揮激活體液免疫的作用，但濃度過(guò)高(達(dá)到300 mg/kg時(shí))反而會(huì)使活性降低。在組間活性表現(xiàn)上，CSP的所有實(shí)驗(yàn)劑量都與陽(yáng)性對(duì)照組相當(dāng)，CSP-1的高劑量組優(yōu)于陽(yáng)性，中和低劑量與陽(yáng)性相當(dāng)，而CSP-2的低和中劑量組優(yōu)于陽(yáng)性，高劑量組和陽(yáng)性相當(dāng)，說(shuō)明CSP-2對(duì)小鼠細(xì)胞免疫功能的激活作用優(yōu)于市售宣稱(chēng)具有提高免疫功能的保健食品和前體多糖CSP，而CSP-1與陽(yáng)性對(duì)照相當(dāng)?？梢?jiàn)經(jīng)乙醇沉淀純化后CSP-2的調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫功能得到強(qiáng)化和提升。

表3 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of phagocytosis of chicken red blood cells by mouse peritoneal macrophages.

2.4 玉米須多糖對(duì)小鼠免疫器官的影響

胸腺和脾臟作為重要的免疫器官，其器官質(zhì)量及臟器指數(shù)可一定程度上反映機(jī)體免疫功能的強(qiáng)弱。由表4可見(jiàn)，體內(nèi)灌胃30 d后，4種玉米須多糖和陽(yáng)性對(duì)照可明顯提升脾臟指數(shù)，表明它們可以促進(jìn)小鼠脾臟生長(zhǎng)。組內(nèi)和組間比較發(fā)現(xiàn)，除CSP中劑量組和CSP-3低劑量組的脾指數(shù)明顯升高外，其他實(shí)驗(yàn)組間沒(méi)有差異，因此初步認(rèn)為4種多糖和陽(yáng)性保健食品對(duì)小鼠脾臟的生長(zhǎng)促進(jìn)作用無(wú)顯著差異。對(duì)于胸腺指數(shù)，除CSP-2中和高劑量組沒(méi)有明顯升高外，其他多糖至少有2個(gè)劑量組有明顯升高，表明CSP、CSP-1、CSP-3和市售保健食品對(duì)小鼠胸腺的生長(zhǎng)有明顯促進(jìn)作用，但CSP-2沒(méi)有促進(jìn)作用。CSP、CSP-1、CSP-3和陽(yáng)性對(duì)照比較，分別都有2個(gè)劑量組沒(méi)表現(xiàn)出差異。表明CSP、CSP-1、CSP-3和陽(yáng)性保健食品對(duì)小鼠胸腺的生長(zhǎng)促進(jìn)作用沒(méi)有明顯差異。

2.5 玉米須多糖對(duì)小鼠其他主要器官的影響

CSP、CSP-1、CSP-2和CSP-3對(duì)小鼠其他主要器官生長(zhǎng)的影響研究發(fā)現(xiàn)，它們和陽(yáng)性保健食品對(duì)心臟、腎、肺、肝和腦的生長(zhǎng)沒(méi)有顯著影響(相關(guān)數(shù)據(jù)略)。

表4 玉米須多糖對(duì)小鼠胸腺和脾臟的影響Table 4 Effects of polysaccharide from Stigma maydis on thymus and spleen in mice

3 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)采用超濾法制備的玉米須多糖(CSP)主要為不溶于體積分?jǐn)?shù)80%乙醇的高分子量多糖(CSP-2)，占多糖總量的近一半。小鼠體內(nèi)免疫活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，多糖CSP、CSP-1和CSP-2在細(xì)胞免疫功能和體液免疫功能實(shí)驗(yàn)中均為陽(yáng)性，可判定3種多糖具有調(diào)節(jié)免疫功能作用[11]，其中CSP-1表現(xiàn)出劑量依賴(lài)性，CSP-2在低濃度時(shí)活性更佳，且3種多糖對(duì)體液免疫功能調(diào)節(jié)作用優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照市售保健食品；幾種多糖間比較發(fā)現(xiàn)CSP-1調(diào)節(jié)體液免疫功能優(yōu)于CSP-2和CSP-3，與CSP相當(dāng)，而CSP-2對(duì)細(xì)胞免疫功能的調(diào)劑作用明顯優(yōu)于CSP和市售保健品(陽(yáng)性對(duì)照)，可見(jiàn)經(jīng)純化后80%乙醇沉淀級(jí)分的調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫功能得到強(qiáng)化和提升。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，CSP、CSP-1和CSP-3可促進(jìn)脾臟和胸腺生長(zhǎng)，3種多糖作用效果沒(méi)有明顯差異和市售保健食品相當(dāng)，而CSP-2只對(duì)小鼠脾臟的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，幾種實(shí)驗(yàn)多糖對(duì)小鼠心臟、腎、肺、肝和腦的生長(zhǎng)沒(méi)有顯著影響。