酪蛋白酸鈉-大豆油乳化體系的影響因素

彭松林，張伊儂，趙紫悅，李懿璇，康夢(mèng)瑤，尚永彪,2,3*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715)2(農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(重慶)，重慶，400715) 3(重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶，400715)

在肉糜類制品中添加外源性油脂能夠起到增進(jìn)風(fēng)味、改善營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)等作用。但若在肉糜制備的過(guò)程中直接添加外源油脂，容易出現(xiàn)油脂析出等質(zhì)量缺陷。與其他物料斬拌混合前，先以適量蛋白質(zhì)溶液與外源油脂進(jìn)行乳化，使蛋白質(zhì)分散并包裹和吸附在油脂顆粒的表面，這樣就能夠緩解肉糜在熱處理時(shí)油脂流失的問(wèn)題。顯然，外源油脂的乳化效果對(duì)產(chǎn)品的保油性有著重要的影響，乳化效果好則產(chǎn)品的保油性就好。影響乳化效果的因素有油水混合非均相體系條件以及物理處理方法等[1-3]。蛋白質(zhì)的添加量一定程度上會(huì)影響乳液液滴粒徑的大小，從而影響乳液的穩(wěn)定性，但若添加量過(guò)多，兩相界面的蛋白吸附量超過(guò)臨界值，乳液中可能會(huì)發(fā)生排斥絮凝[4]，影響后續(xù)加工過(guò)程中與肉糜等物料的混合，可能不利于產(chǎn)品口感。而且隨著蛋白質(zhì)含量增加，產(chǎn)品硬度增加、多汁性降低[5]。油脂與水分作為乳化液的主要組成部分，兩者的比例對(duì)乳液的性質(zhì)也有很大的影響。TANG等[6]利用大豆分離蛋白納米顆粒制備乳化液時(shí)，發(fā)現(xiàn)體系中油相體積的增加能夠使乳液更加穩(wěn)定，不易分層。DICKINSON等[7]研究高脂水比乳化液時(shí)有相同結(jié)論，并指出乳液剪切黏度的增加與油滴的堆疊程度有關(guān)。pH與NaCl濃度是蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的重要影響因素，對(duì)蛋白質(zhì)的乳化性及乳化穩(wěn)定性有著顯著的影響[8]。LIANG等[9]在研究豌豆蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn)，pH為3時(shí)所制備的水包油(oil in water,O/W)型乳狀液表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性。朱振寶等[10]發(fā)現(xiàn),體系中NaCl濃度的變化對(duì)乳清蛋白及酪蛋白的乳化液穩(wěn)定性都有很大影響。除了油水混合非均相體系條件外，物理處理方法如超聲波輔助處理[11]、微波輔助處理[12]、高壓微射流均質(zhì)處理[13-14]等對(duì)乳化效果也有顯著的影響。

本研究以大豆油為外源油脂、以酪蛋白酸鈉為乳化劑，研究不同的蛋白添加量、脂水體積比、體系pH環(huán)境及NaCl濃度變化對(duì)所制得乳化液其乳液黏度、界面蛋白吸附量、乳化液滴粒徑及分布和微觀結(jié)構(gòu)、zeta-電位指標(biāo)等的影響，探討不同體系條件對(duì)油脂乳化效果的影響及其原理，為其在后續(xù)工藝中的應(yīng)用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酪蛋白酸鈉(蛋白質(zhì)含量≥90.00%)，萬(wàn)利達(dá)生物科技有限公司；大豆油，九三非轉(zhuǎn)基因一級(jí)大豆油；純凈水；NaOH、HCl、NaCl、NaH2PO4、Na2HPO4、SDS,均為分析純,成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

XHF-D內(nèi)切式勻漿機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；PHS-4C+酸度計(jì)，成都世紀(jì)方舟科技有限公司；5810型臺(tái)式高速離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；MCR302流變儀，奧地利安東帕公司；BX53熒光正置顯微鏡，日本OLYMPUS公司；ZEN3690馬爾文激光粒度分析儀，英國(guó)馬爾文儀器公司；JT1001 N電子稱、FA2004A電子天平，上海精天電子儀器有限公司；DW-25 W518冰箱，青島海爾電器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 乳化液的制備

取50 mL燒杯，乳化液總體積為30 mL，將酪蛋白酸鈉、大豆油、純凈水混合，采用內(nèi)切式勻漿機(jī)在6 000 r/min條件下進(jìn)行乳化均質(zhì)，時(shí)間為30 s，間隔30 s，勻漿3次。每個(gè)處理組做3個(gè)重復(fù)。

1.3.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.2.1 酪蛋白酸鈉添加量對(duì)乳化液乳化效果的影響

在50 mL燒杯中加入15 mL大豆油，15 mL純凈水(脂水體積比為1∶1)，添加酪蛋白酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，室溫下操作，將混合液勻漿均質(zhì)，測(cè)定乳化液的相關(guān)指標(biāo)，評(píng)價(jià)乳化效果。

1.3.2.2 脂水比對(duì)乳化液乳化效果的影響

分別將30 mL脂水比為1∶1，1∶2，2∶1，2∶3，3∶2的混合物添加到50 mL的燒杯中，添加0.3%酪蛋白酸鈉，將混合液勻漿均質(zhì)，測(cè)定乳化液的相關(guān)指標(biāo)，評(píng)價(jià)乳化效果。

1.3.2.3 pH對(duì)乳化液乳化效果的影響

在50 mL燒杯中加入30 mL脂水比為1∶1的混合物、0.3%酪蛋白酸鈉，配制成乳化液。使用0.1 mol/L HCl溶液和0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)乳液pH分別為3、5、7、9、11，測(cè)定乳化液的相關(guān)指標(biāo)，評(píng)價(jià)pH對(duì)乳化液乳化效果的影響。

1.3.2.4 NaCl濃度對(duì)乳化液乳化效果的影響

在50 mL燒杯中加入30 mL脂水比為1∶1的混合物、0.3%酪蛋白酸鈉，配制成乳化液。然后加入NaCl，將NaCl濃度分別調(diào)至0、0.06、0.12、0.36、0.6、0.84 mol/L，充分振蕩溶解并混勻，測(cè)定乳化液的相關(guān)指標(biāo)，評(píng)價(jià)NaCl對(duì)乳化液乳化效果的影響。

1.3.3 乳化液黏度的測(cè)定

采用流變儀測(cè)定乳液黏度。取適量樣品置于50 mm平板上，使其均勻分布并防止氣泡產(chǎn)生。具體測(cè)定參數(shù)參考PICOTTI等[15]的方法：測(cè)試溫度25 ℃，剪切速率1～1 000 s-1，總剪切時(shí)間310 s。

1.3.4 界面蛋白吸附量的測(cè)定

參考李超[16]的測(cè)定方法并稍作改動(dòng)。將制好的新鮮乳液立即倒入50 mL離心管中，在4 ℃條件下10 000 r/min離心30 min。用注射器將下層清液取出，測(cè)定清液中的蛋白質(zhì)濃度。乳液界面蛋白吸附量按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：AP，乳液界面蛋白吸附量；Cinitial，溶液的蛋白質(zhì)初始濃度；Caq，離心后下層清液中的蛋白質(zhì)濃度。

1.3.5 油滴粒徑大小與分布的測(cè)定

使用Image J軟件對(duì)圖像中油滴粒徑大小進(jìn)行測(cè)量。每個(gè)樣品選取3張不同放大倍數(shù)的照片，每張照片選取100個(gè)較清晰的油滴進(jìn)行測(cè)量，總計(jì)300個(gè)。油滴平均粒徑取平均值，根據(jù)所得的測(cè)量數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析樣品油滴的粒徑分布[17]。

1.3.6 微觀結(jié)構(gòu)分析

用移液槍吸取1 mL乳化液加入到3 mL SDS溶液中進(jìn)行稀釋，混勻后吸取20 μL樣液滴到載玻片上，立即蓋上蓋玻片，選擇10倍目鏡，并分別用4倍、20倍、40倍物鏡觀察樣品，選擇視野清晰、乳滴分布較均勻的區(qū)域進(jìn)行拍照記錄。

1.3.7 zeta-電位的測(cè)定

采用馬爾文激光粒度分析儀對(duì)pH、NaCl乳化液表面電位進(jìn)行測(cè)定。參考孔靜[18]的方法，測(cè)定前先用10 mmol/L pH 7的磷酸緩沖液將樣品稀釋。上樣體積為1 mL，測(cè)量溫度25 ℃，平衡時(shí)間為1 min，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，取平均值。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次，每次實(shí)驗(yàn)的每個(gè)處理有3個(gè)平行樣。數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用Origin 2018軟件進(jìn)行繪圖，用SPSS Statistics 17.0進(jìn)行顯著性分析，P<0.05表明結(jié)果具有差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白添加量對(duì)乳化液乳化效果的影響

2.1.1 蛋白添加量對(duì)乳液黏度的影響

黏度是影響乳化液穩(wěn)定性的重要因素，通常乳液的黏度越大，越有利于保持乳化體系的穩(wěn)定。由圖1可見(jiàn)，剪切初期，隨著蛋白添加量增加，乳化液初始黏度顯著升高，且增長(zhǎng)速率不斷加大。隨著剪切速率的增加，乳化液黏度變稀，各組之間黏度差距逐漸減小，最終趨于平穩(wěn)。剪切變稀現(xiàn)象說(shuō)明乳液為假塑形流體[19]，而當(dāng)剪切速率增加到足夠克服其中的布朗運(yùn)動(dòng)，以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)或者蛋白質(zhì)-油脂之間弱鍵產(chǎn)生的綜合效應(yīng)時(shí)[20]，乳化液滴在流場(chǎng)作用下變得更加有序，從而剪切抗性降低，黏度下降[21-22]。

乳液黏度越大，液滴運(yùn)動(dòng)需要沖破的阻力也就越多，因此乳液失穩(wěn)的速度會(huì)隨著蛋白添加量的增加而減緩。李成倍等[23]研究表明，酪蛋白酸鈉水溶液會(huì)隨著蛋白濃度的增加而明顯增稠，因此當(dāng)油相分散在水相后，酪蛋白酸鈉溶液自身黏度越大，越能限制油滴運(yùn)動(dòng)，阻礙其遷移或聚集。另外，蛋白添加量越多，體系中有足夠的蛋白可以吸附在油滴表面將其包裹住，故油滴聚合的趨勢(shì)減弱。油水界面吸附更多的蛋白質(zhì)有利于分子間相互作用，使這些小油滴相互橋聯(lián)形成較為致密的類三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[24]，更有利于乳化體系的穩(wěn)定。

圖1 蛋白添加量對(duì)乳化液黏度的影響Fig.1 Effect of protein content on viscosity of emulsion

2.1.2 蛋白添加量對(duì)界面蛋白吸附量的影響

由于脂水比一定，蛋白添加量不同直接導(dǎo)致初始蛋白濃度不同，因此本文在測(cè)出蛋白吸附百分比(AP%)的基礎(chǔ)上還計(jì)算了實(shí)際的蛋白吸附質(zhì)量(mg)予以參考。由圖2可知，蛋白添加量從0.1%增加到0.3%，其界面蛋白的吸附量(AP%)從19.25%升至33.71%，增長(zhǎng)速率較快；而繼續(xù)增加蛋白添加量至0.5%，AP%僅為38.56%，增長(zhǎng)速率減慢。在上述范圍內(nèi)，隨著蛋白添加量增加，油水界面實(shí)際吸附蛋白量幾乎呈直線增長(zhǎng)，說(shuō)明界面蛋白吸附量可能尚未達(dá)到飽和。若單考慮蛋白顆粒吸附在油水界面的過(guò)程，低濃度時(shí)，吸附的蛋白數(shù)量不足以完全包裹住油滴；隨著濃度的增加，吸附的蛋白越來(lái)越多，直至油滴表面被單層顆粒覆蓋；濃度繼續(xù)增加，蛋白間的相互作用則會(huì)使更多的蛋白顆粒聚集在界面上，從而形成多層吸附[25]，使界面膜強(qiáng)度及乳液黏彈性得以提高，因此乳化液呈越來(lái)越穩(wěn)定的趨勢(shì)。但需要注意蛋白吸附量的臨界值，蛋白添加量過(guò)多可能會(huì)造成乳滴排斥絮凝。

圖2 蛋白添加量對(duì)界面蛋白吸附量的影響Fig.2 Effect of protein addition on interfacial protein adsorption 注：組間不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.1.3 蛋白添加量對(duì)乳液油滴平均粒徑與分布的影響

由圖3-a可知，隨著蛋白添加量的增加，乳液平均粒徑降低速度先快后慢。添加量≤0.3%時(shí)，每增加0.1%的蛋白質(zhì)，乳液平均粒徑都能降低20 μm左右，變化十分顯著；而添加量為0.4%和0.5%的樣品組，乳液平均粒徑分別為9.34 μm和7.28 μm，減小的速率明顯減緩，說(shuō)明此時(shí)蛋白濃度不再是影響平均粒徑的主要因素，若繼續(xù)添加更多的蛋白，乳液粒徑不會(huì)再明顯減小，甚至可能出現(xiàn)因乳液黏度過(guò)高，不利于乳液均質(zhì)的現(xiàn)象。若需進(jìn)一步降低乳液粒徑，則需要調(diào)整剪切強(qiáng)度、延長(zhǎng)均質(zhì)時(shí)間或者采用其他處理來(lái)實(shí)現(xiàn)。由圖3-b可知，隨著蛋白添加量的增加，乳液的粒徑分布范圍有明顯變小、變窄、變均勻的趨勢(shì)。添加量為0.1%時(shí)，粒徑分布跨度很大，呈幾微米到幾百微米的多分散狀態(tài)，說(shuō)明此時(shí)蛋白添加量不足，乳液中油滴聚合現(xiàn)象很嚴(yán)重。添加量≥0.4%時(shí)，油滴粒徑分布主要集中在20 μm以下，乳滴分散相對(duì)均勻，沒(méi)有明顯聚合的大油滴出現(xiàn)，有利于乳化體系的穩(wěn)定。

圖3 蛋白添加量對(duì)乳化液油滴平均粒徑(a) 及分布(b)的影響Fig.3 Effect of protein content on average particle size (a) and distribution (b) of oil droplets in emulsion

2.2 脂水比對(duì)乳化液乳化效果的影響

2.2.1 脂水比對(duì)乳液黏度的影響

由圖4可見(jiàn)，隨著脂水比的增加，乳液黏度呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，尤其是脂水比>1∶1的2個(gè)組較其他組黏度更大，其剪切初期黏度為1∶1樣品組的4.5～6倍，這與TANG等[6]研究結(jié)論一致。乳液黏度升高的原因可能是,油相作為分散相，分布在體積較小的水相中油滴分布空間受限，液滴間需要緊湊排列甚至被壓縮，從而導(dǎo)致體系剪切黏度上升[7]。此外，蛋白包裹的油滴可看作乳液體系中形成的類凝膠網(wǎng)絡(luò)的填充物，而油滴上吸附的蛋白顆粒間的相互聯(lián)結(jié)作用，加強(qiáng)了類凝膠網(wǎng)絡(luò)的緊密程度，使體系黏度升高[26-27]。

圖4 脂水比對(duì)乳化液黏度的影響Fig.4 Effect of lipid-water ratio on viscosity of emulsion

2.2.2 脂水比對(duì)界面蛋白吸附量的影響

由圖5可知，隨脂水比的增加，界面蛋白吸附量(AP%)總體上顯著增加。其中脂水比2∶3組與1∶1組AP%差別不大，甚至略高于后者。目前尚未有明確的油水比例界限劃分乳液類型是O/W還是W/O，本研究中，脂水比3∶2和2∶1 兩個(gè)樣品組，雖然油相體積大于水相體積，但觀察到的乳液體系依然為O/W型。因此乳液均質(zhì)后油水界面濃度隨脂水比的增加而增大，為蛋白質(zhì)的吸附提供了更多的面積，蛋白吸附量也相應(yīng)增多。但實(shí)際上蛋白質(zhì)在油水界面的吸附并不簡(jiǎn)單，除蛋白質(zhì)本身濃度影響外，蛋白在界面的展開(kāi)速率與其吸附效果等也有一定關(guān)系[28]。

圖5 脂水比對(duì)乳化液蛋白吸附量的影響Fig.5 Effect of lipid to water ratio on protein adsorption in emulsion

2.2.3 脂水比對(duì)乳液油滴平均粒徑與分布的影響

由圖6可知，隨著脂水比的升高，油滴平均粒徑先減小后又有所增加。

圖6 脂水比對(duì)乳化液油滴平均粒徑(a) 及分布(b)的影響Fig.6 Effect of lipid-water ratio on average particle size (a) and distribution (b) of oil droplets in emulsion

脂水比<1∶1時(shí)，乳液液滴的平均粒徑及分布差別不大，可能是不同油相體積和相應(yīng)初始蛋白濃度的協(xié)同作用恰好使乳化體系達(dá)成相似狀態(tài)。脂水比繼續(xù)增大至3∶2，均質(zhì)后分散在水相中的油滴數(shù)量增多，且體系相對(duì)增加的蛋白濃度能夠較快地將它們包裹住，維持乳滴穩(wěn)定，因此液滴粒徑呈減小趨勢(shì)。當(dāng)脂水比為2∶1時(shí)，乳化液粒徑又有所增加，可能是此時(shí)乳液黏度過(guò)高，蛋白在油水界面的吸附速率變緩而無(wú)法及時(shí)將油滴包裹，形成部分較大粒徑乳滴，從而提高了粒徑的均值；還有可能是因?yàn)橛拖囿w積的增加，使油滴排列過(guò)于緊密相互擠壓甚至發(fā)生形變，使油滴不再是圓形，而變成多邊形，如圖7紅圈所示，此時(shí)蛋白膜強(qiáng)度較弱的油滴可能會(huì)發(fā)生破乳重聚，導(dǎo)致較大粒徑油滴出現(xiàn)。劉洋[24]研究發(fā)現(xiàn)，乳液中油相體積分?jǐn)?shù)增大到一定程度時(shí)，油滴間空隙很小、相互緊連，若有未吸附的界面會(huì)很容易發(fā)生油滴的聚結(jié)。

2.2.4 脂水比對(duì)乳液微觀結(jié)構(gòu)的影響

由圖7可見(jiàn)，脂水比≤1∶1的3組樣品乳化液的分散性較高，但存在油滴聚合成大乳滴的現(xiàn)象。而脂水比>1∶1的2組樣品乳化液滴呈緊密的堆疊狀態(tài)。從這2組的微觀結(jié)構(gòu)來(lái)看，乳化體系的類型在非嚴(yán)格意義上仍屬于O/W型，只不過(guò)由于作為連續(xù)相的水相體積太少，分散相油滴間距離非常緊湊，形成致密的三維類網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，這驗(yàn)證了2.2.3的猜測(cè)。脂水比為3∶2時(shí)，油滴的粒徑大小明顯比其他組更均勻，這與其粒徑分布范圍較其他組窄的結(jié)果一致。但是，當(dāng)脂水比高達(dá)2∶1時(shí)，使油滴數(shù)量進(jìn)一步增加，連續(xù)相持續(xù)減少，各油滴相互擠壓，導(dǎo)致部分油滴變形甚至破乳，形成許多較大的油脂聚集體。

圖7 不同脂水比乳化液的微觀結(jié)構(gòu)Fig.7 Micro-structure of different lipid-water ratio pre-emulsions

2.3 pH值對(duì)乳化液乳化效果的影響

2.3.1 pH值對(duì)界面蛋白吸附量的影響

由圖8可知，在pH大于酪蛋白酸鈉等電點(diǎn)時(shí)(pH>5)，界面蛋白吸附量隨pH值的升高而增加，pH為9時(shí)AP%達(dá)到最大值，pH為11時(shí)蛋白吸附量比pH 9時(shí)低1.37%，差異不顯著。堿性條件下，蛋白質(zhì)分子間靜電斥力增加，使離散雙電層加厚，溶液界面膜增厚，乳化性也得到提高[29]。當(dāng)pH接近等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)溶解度最小，體系中能起到乳化作用的可溶性蛋白含量減少[30]；另外，也可能是有一部分吸附的蛋白發(fā)生變性沉降[31]，從油滴表面脫落，造成蛋白吸附量降低。隨著pH值進(jìn)一步降低，此時(shí)蛋白質(zhì)的溶解度又有所增加，體系中可利用的蛋白質(zhì)含量增多，可通過(guò)蛋白質(zhì)間相互作用重新吸附到界面蛋白膜上，故AP%又有所增加。

圖8 pH對(duì)乳化液蛋白吸附量的影響Fig.8 Effect of pH on protein adsorption in emulsion

2.3.2 pH對(duì)乳液黏度的影響

由圖9可知，pH值從3增至11，乳液初始黏度先增加后保持平穩(wěn)，且各實(shí)驗(yàn)組均呈剪切變稀現(xiàn)象，說(shuō)明乳滴間發(fā)生了絮凝[32-33]。剪切速率為1 s-1時(shí)，乳化液的pH從酸性升高至中性，其初始表觀黏度從50.6 mPa增加至 82.2 mPa，達(dá)到最大值；當(dāng)乳化液體系pH從中性轉(zhuǎn)變?yōu)閴A性， pH 9、pH 11乳化液初始表觀黏度分別為81.2和79.8 mPa，與pH 7差別不大。但隨著剪切速率的增加，剪切變稀后pH 9的乳液最終黏度比pH 7的乳液更高，表現(xiàn)出較好的剪切抗性，可能是因?yàn)槠浣缑娴鞍椎膹?qiáng)度與彈性較好。在實(shí)際應(yīng)用中，乳化液加入到肉糜中后需要進(jìn)一步地滾揉、均質(zhì)、混勻，因此無(wú)法避免繼續(xù)經(jīng)受剪切作用力。pH 9的乳化液抗剪切能力較其他組好，在實(shí)際應(yīng)用中可能更能發(fā)揮保油的作用。pH對(duì)乳化液黏度的影響，可能是通過(guò)影響體系中蛋白質(zhì)特性來(lái)實(shí)現(xiàn)。蛋白質(zhì)所帶凈電荷隨體系環(huán)境pH變化而改變，而其表面凈電荷的數(shù)量又會(huì)影響蛋白質(zhì)在溶液中的三維結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響其溶解度[32]。

圖9 pH對(duì)乳化液黏度的影響Fig.9 Effect of pH on viscosity of emulsion

2.3.3 pH對(duì)乳化液zeta-電位的影響

zeta-電位廣泛用于描述膠體微粒之間的靜電相互作用，是表征膠體體系穩(wěn)定性的重要指標(biāo)。其表示帶電微粒的雙電子層中靠近緊密層和擴(kuò)散層的交界面上的電勢(shì)，是由微粒表面電荷和周圍溶液環(huán)境條件共同決定的[34]。其中正負(fù)號(hào)與電荷數(shù)量無(wú)關(guān)，只表示乳液所帶的是正電荷還是負(fù)電荷，zeta-電位的絕對(duì)值代表乳液所帶凈電荷數(shù)量，一般情況下，該值越大越有利于乳化體系的穩(wěn)定[31]。

由圖10可知，pH 7的中性環(huán)境中，由于質(zhì)子從堿性與酸性功能基上被移除[35]，酪蛋白酸鈉乳液本身帶負(fù)電，電位為-20.15 mV。隨著pH降低，體系中H+使得蛋白表面凈負(fù)電荷量減少，且越接近酪蛋白酸鈉的等電點(diǎn)(4.5～5.2)，蛋白包裹的乳滴表面凈電荷越少，zeta-電位越接近于0，乳滴間的靜電斥力也相應(yīng)減小，易發(fā)生聚集。當(dāng)pH進(jìn)一步下降到酪蛋白酸鈉等電點(diǎn)以下后，乳滴表面開(kāi)始帶正凈電荷。堿性環(huán)境中，隨著pH的升高，zeta-電位負(fù)值增大，OH-作用加速了蛋白質(zhì)氨基酸側(cè)鏈解離，-COO-增多，從而能夠產(chǎn)生促進(jìn)乳狀液穩(wěn)定的靜電斥力[35-36]。

圖10 pH對(duì)乳化液zeta-電位的影響Fig.10 Effect of pH on zeta-potential of emulsion

2.3.4 pH對(duì)乳液油滴平均粒徑及分布的影響

按理論預(yù)期來(lái)說(shuō)，pH 5時(shí)接近蛋白質(zhì)等電點(diǎn)，所制得乳液的油滴粒徑應(yīng)該最大。但圖11可見(jiàn)，pH 3時(shí)乳化液的平均粒徑高達(dá)55.76 μm，遠(yuǎn)超其他幾組，說(shuō)明在pH 3體系中乳滴間發(fā)生的聚合現(xiàn)象最為嚴(yán)重。其原因可能是乳液調(diào)整pH到3的過(guò)程中，經(jīng)過(guò)了蛋白質(zhì)等電點(diǎn)，且調(diào)節(jié)pH耗時(shí)相對(duì)較長(zhǎng)，為蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)發(fā)生變化影響乳液特性提供了反應(yīng)時(shí)間。當(dāng)pH處于等電點(diǎn)附近時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度最小，有可能發(fā)生變性沉降[31]，從而使蛋白膜的強(qiáng)度和黏彈性受到影響，此時(shí)乳液zeta-電位值接近于0，乳滴之間幾乎不存在靜電斥力，受外力作用乳滴間容易發(fā)生碰撞而聚結(jié)成大油滴，且聚結(jié)過(guò)程不可逆，不會(huì)隨著體系pH值繼續(xù)降低遠(yuǎn)離等電點(diǎn)而恢復(fù)。因此，pH 3組的乳滴平均粒徑最大，其粒徑分布也說(shuō)明了乳化液失穩(wěn)現(xiàn)象嚴(yán)重，將近24%聚合成粒徑80 μm以上的油滴。pH 5乳化液平均粒徑為45.28 μm，pH 7、pH 9兩組乳化液平均粒徑都在19 μm左右，pH 11乳化液的平均粒徑最小，只有13.19 μm。整體來(lái)看，隨著pH值的增大，乳化液平均粒徑呈減小的趨勢(shì)，且粒徑分布范圍也逐漸變窄，油相分散越來(lái)越均勻，這與崔珊珊[32]、李超[16]、ZHANG等[37]研究結(jié)論一致，說(shuō)明在非長(zhǎng)期放置情況下堿性環(huán)境有利于形成乳滴粒徑更小、更均一的乳化液。

圖11 pH對(duì)乳化液油滴平均粒徑(a)及分布(b)的影響Fig.11 Effect of pH on average particle size (a) and distribution (b) of oil droplets in emulsion

2.4 NaCl濃度對(duì)乳化液乳化效果的影響

2.4.1 NaCl濃度對(duì)界面蛋白吸附量的影響

由圖12可見(jiàn)，對(duì)照組AP%僅為34.56%，而僅將NaCl濃度增加至0.06 mol/L，AP%增加至82.86%，吸附量提高近50%。繼續(xù)增加NaCl濃度，蛋白吸附量變化不大(P>0.05)，但是所有添加NaCl的乳化液其AP%值均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，說(shuō)明蛋白質(zhì)利用率大大提高。這可能是因?yàn)辂}的加入使蛋白質(zhì)的溶解性提高，體系中發(fā)揮作用的蛋白質(zhì)增多。另外，NaCl的加入使乳液界面吸附蛋白量顯著提高，這也驗(yàn)證了2.4.3中對(duì)于zeta-電位變化原因的推測(cè)。

圖12 NaCl濃度對(duì)乳化液蛋白吸附量的影響Fig.12 Effect of NaCl concentration on protein adsorption in emulsion

2.4.2 NaCl濃度對(duì)乳液黏度的影響

由圖13可知，隨著離子濃度的不斷增加，黏度呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，NaCl濃度為0.84 mol/L時(shí)乳液黏度最高，從對(duì)照組的83.3 mPa增加到125.5 mPa。隨著剪切速率的增加，各組呈剪切變稀現(xiàn)象，說(shuō)明乳液發(fā)生了絮凝。當(dāng)剪切速率增大，絮凝體會(huì)發(fā)生形變，沿剪切方向排列；當(dāng)剪切力超過(guò)液滴間的聚合力時(shí)，聚集體被破壞,發(fā)生解聚，體系剪切黏度下降[24]。趙正濤等[38]認(rèn)為，NaCl的加入一定程度上爭(zhēng)奪了蛋白質(zhì)的水分，使蛋白質(zhì)濃度間接升高，因此NaCl能顯著增加體系的黏度值，與本研究結(jié)果一致。另外，鹽離子濃度會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的溶解性及表面疏水性產(chǎn)生作用，進(jìn)而影響?zhàn)ざ?。添加了Na+的乳化液初始表觀黏度雖然比對(duì)照組的大得多，但是鹽離子會(huì)使蛋白質(zhì)膠體的水化層變薄[32]，在剪切過(guò)程中，蛋白質(zhì)更容易出現(xiàn)凝聚現(xiàn)象，因此鹽離子濃度越高的乳化液，出現(xiàn)剪切變稀的程度越嚴(yán)重，所以最終各組的黏度差距縮小。

圖13 NaCl濃度對(duì)乳化液黏度的影響Fig.13 Effect of NaCl concentration on viscosity of emulsion

2.4.3 NaCl濃度對(duì)乳液zeta-電位的影響

由圖14可知，除對(duì)照組，隨著NaCl濃度的增加，zeta-電位絕對(duì)值逐漸減小，這與葉進(jìn)富[34]、曹燦[39]等研究結(jié)果一致。NaCl濃度為0.06和0.12 mol/L時(shí)，乳化液所帶凈電荷數(shù)量高于對(duì)照組，原因可能是因?yàn)镹aCl的加入使界面蛋白膜變得更加致密，蛋白吸附量升高，R基帶負(fù)電的蛋白增加，而此時(shí)低Na+濃度對(duì)zeta-電位的影響較弱，因此總體表現(xiàn)為zeta-電位負(fù)值增長(zhǎng)。但隨著NaCl濃度進(jìn)一步增加，界面蛋白吸附量不再顯著變化，帶正電的 Na+成為影響zeta-電位的主要因素。由雙電層理論可知，帶電微粒表面緊密吸附的反離子到達(dá)上限后，其他反離子雖然仍繼續(xù)被微粒吸引，但同時(shí)也會(huì)受到“緊密層”相同離子的排斥作用，因此只能在緊密層外部，即距離微粒較遠(yuǎn)處形成擴(kuò)散層[34]。由此可推測(cè)，本研究中NaCl濃度達(dá)到0.36 mol/L時(shí)，乳滴表面緊密吸附的Na+可能已接近臨界值，因此NaCl濃度繼續(xù)增加后，其對(duì)乳液zeta-電位的影響程度相對(duì)減小，表現(xiàn)為電位絕對(duì)值下降稍顯緩慢。

圖14 NaCl濃度對(duì)乳化液zeta-電位的影響Fig.14 Effect of NaCl concentration on potential of pre-emulsion

2.4.4 NaCl濃度對(duì)乳液油滴平均粒徑及分布的影響

如圖15-a所示，隨著NaCl濃度的增加，乳化液平均粒徑先減小后增加，在NaCl濃度0.12 mol/L時(shí)達(dá)到最小值，約為15.36 μm，NaCl濃度為0.06、0.36和0.6 mol/L時(shí)，平均粒徑相差不大，均在19 μm左右，均小于對(duì)照組。這說(shuō)明在一定范圍內(nèi)，加入NaCl可以降低乳液液滴的平均粒徑。結(jié)合圖15-b， NaCl濃度為0.06～0.6 mol/L時(shí)，小粒徑的乳滴占比較對(duì)照組明顯提高，因此乳液整體的平均粒徑下降。但NaCl濃度為0.84 mol/L時(shí)，乳滴平均粒徑上升，并且超過(guò)對(duì)照組。前文提到，NaCl濃度為0.06和0.12 mol/L時(shí)，乳化液所帶凈電荷數(shù)量高于對(duì)照組，少量的NaCl使蛋白吸附量升高，R基帶負(fù)電的蛋白增加，zeta-電位表現(xiàn)為負(fù)增長(zhǎng)。隨著NaCl濃度進(jìn)一步增加，界面蛋白吸附量不再顯著變化，帶正電的 Na+成為影響zeta-電位的主要因素。由雙電層理論推測(cè)，本研究中NaCl濃度達(dá)到0.36 mol/L時(shí)，該組乳液中粒徑在30 μm以上的乳滴占比明顯增大，說(shuō)明小乳滴發(fā)生聚合變大，原因可能是此時(shí)較多NaCl競(jìng)爭(zhēng)吸附水分，使蛋白質(zhì)水化層遭到一定程度地破壞，導(dǎo)致部分乳滴聚合[38]。

圖15 NaCl濃度對(duì)乳化液平均粒徑(a)及分布(b)的影響Fig.15 Effects of NaCl concentration on mean particle size (a) and distribution (b) of emulsion

3 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)，大豆油乳化效果與體系條件(蛋白添加量、脂水比、pH、NaCl)密切相關(guān)。蛋白添加量的增加使乳液黏度及界面蛋白吸附量均顯著提高；液滴平均粒徑由60 μm下降至7.28 μm，粒徑分布范圍變窄，得到更加均一、穩(wěn)定的乳液。在脂水比1∶2～2∶1范圍內(nèi)，隨著脂水比增加，乳液黏度增大；除了脂水比2∶3和1∶1變化不顯著外，乳液的界面蛋白吸附量呈上升趨勢(shì)；在脂水比<1∶1時(shí),乳滴粒徑和分布差別不大，隨后粒徑先減小后又有所增加。乳液pH在3～11范圍內(nèi)，乳液在pH為7、9時(shí)黏度較高；pH為3、5時(shí)乳滴聚集嚴(yán)重，平均粒徑及分布范圍較其他組高，在pH為7、9時(shí)粒徑較小且分布均勻。NaCl可以顯著提高乳液黏度和界面蛋白吸附量，NaCl濃度≤0.6 mol/L時(shí)，乳液粒徑均小于對(duì)照組，濃度為0.12 mol/L時(shí)達(dá)到最小值，在NaCl濃度為0.84 mol/L時(shí)，乳滴中出現(xiàn)較大粒徑乳滴，NaCl濃度≥0.36 mol/L時(shí)，乳液zeta-電位絕對(duì)值較對(duì)照組小。綜上，乳化的適宜條件為：酪蛋白添加量0.5%，脂水比3∶2， pH 7～9， NaCl濃度≤0.6 mol/L。