靜電紡絲在組織工程學(xué)中的應(yīng)用進(jìn)展

趙守進(jìn)，劉哲鵬，付子讓?zhuān)愳`鈺

上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院(上海，200093)

0 引言

目前，靜電紡絲纖維已成為一種新型的細(xì)胞支架，通過(guò)高壓靜電在電紡絲噴頭和接收裝置之間施加電場(chǎng)，可以獲得尺寸從幾百納米到幾微米不等的電紡絲纖維。獲得的紡絲纖維無(wú)需進(jìn)一步的處理，它的溶劑在電場(chǎng)作用下完全揮發(fā)。靜電紡絲技術(shù)在組織工程系統(tǒng)中有著巨大的優(yōu)勢(shì)，而且靜電紡絲操作簡(jiǎn)單，材料選擇性廣，在傷口愈合、術(shù)后抗黏連、引導(dǎo)骨再生和體內(nèi)局部藥物遞送中有良好的發(fā)展前景。

組織工程領(lǐng)域試圖從細(xì)胞、生物分子和支架3個(gè)方面來(lái)恢復(fù)或再生受損組織和器官的功能。組織工程支架可為因疾病、損傷或先天缺陷而受損的細(xì)胞提供生長(zhǎng)所需的三維環(huán)境。靜電紡絲的多功能性決定了其可以制備細(xì)胞支架。

1 組織工程學(xué)的作用

20世紀(jì)80年代，JOSEPH 和ROBERT教授首先提出組織工程學(xué)這一概念。從機(jī)體獲取少量的活體組織，用特殊的酶或其他方法將細(xì)胞從組織中分離出來(lái),并在體外進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增的細(xì)胞與具有良好生物相容性和可降解性的生物支架按一定的比例混合，使細(xì)胞黏附在生物材料支架上形成細(xì)胞-材料復(fù)合物；然后將該復(fù)合物植入機(jī)體的組織或器官病損部位，隨著生物材料在體內(nèi)逐漸降解和被吸收，植入的細(xì)胞在體內(nèi)不斷增殖并分泌細(xì)胞外基質(zhì)，最終形成相應(yīng)的組織或器官，從而達(dá)到修復(fù)創(chuàng)傷的目的。在植入到病變部位后，生物材料支架所形成的三維結(jié)構(gòu)為細(xì)胞獲取營(yíng)養(yǎng)、生長(zhǎng)和代謝提供了一個(gè)良好的環(huán)境［1］。目前組織工程技術(shù)可應(yīng)用于各種組織再生，如肌肉、骨骼、軟骨、肌腱、韌帶、人工血管和皮膚等；在生物人工器官的研發(fā)中也有所發(fā)展，如人工胰臟、肝臟、腎臟等；同時(shí)也可以運(yùn)用于神經(jīng)假體和藥物傳輸?shù)龋?］。

常見(jiàn)的組織工程支架制備方式有自組裝、3D打印、靜電紡絲等。自組裝是通過(guò)分子或組分在基于非共價(jià)鍵的相互作用下自發(fā)的組織或聚集為纖維的過(guò)程。雖然自組裝方式在智能神經(jīng)納米支架方面取得了許多進(jìn)展，但是其產(chǎn)生的不良反應(yīng)較多，而且其形貌外觀可控性較差［3］。3D打印是一種簡(jiǎn)單的材料工程方法，設(shè)計(jì)多樣化，能夠精準(zhǔn)的復(fù)制設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)，但是對(duì)材料要求較高，部分材料無(wú)法使用該方法，且微納米級(jí)的3D打印設(shè)備價(jià)格高昂［4］。而與其他幾種方法相比，靜電紡絲可以制備出均勻連續(xù)的微米或納米纖維，且制備方法簡(jiǎn)單，纖維尺寸可控，對(duì)于材料的要求不高，是一種良好的支架制備方式。

2 靜電紡絲技術(shù)

靜電紡絲技術(shù)最早出現(xiàn)于19世紀(jì)科學(xué)家FOLMHALS申報(bào)的一系列專(zhuān)利中，以乙酸纖維素為研究對(duì)象，詳細(xì)闡述了溶液的性質(zhì)對(duì)收集板上帶電纖維的影響。由于基礎(chǔ)知識(shí)的匱乏，該技術(shù)的研究進(jìn)展十分緩慢。19世紀(jì)70年代，Taylor通過(guò)對(duì)電紡射流過(guò)程的研究發(fā)現(xiàn)，只有當(dāng)紡絲頭形成的錐體錐角為49.3°時(shí)，紡絲才能穩(wěn)定噴出，并命名為“泰勒錐”。Simons發(fā)現(xiàn)紡絲纖維直徑與溶液的濃度有較大關(guān)系，Baumgarten制備了丙烯酸樹(shù)脂纖維，并考察了纖維直徑與溶液黏度、溶液進(jìn)料速度、環(huán)境之間的關(guān)系。2000年靜電紡絲技術(shù)的研究進(jìn)度得到空前的提升，Reneker小組利用該技術(shù)制備了20多種聚合物紡絲，其直徑最低為40 nm，并且通過(guò)對(duì)靜電紡絲機(jī)理的研究，提出了彎曲不穩(wěn)定機(jī)理。

2.1 靜電紡絲原理

靜電紡絲技術(shù)是指聚合物在熔融或者溶解的狀態(tài)下，通過(guò)高壓靜電場(chǎng)的作用，最終形成纖維的過(guò)程。當(dāng)電場(chǎng)施加在紡絲針頭時(shí)，高分子的表面在高壓下產(chǎn)生大量靜電電荷，紡絲頭尖端的液滴在靜電力的作用下克服其表面張力，形成泰勒錐。當(dāng)電場(chǎng)繼續(xù)增大到其臨界值時(shí)，流體表面受到的靜電力大于其表面張力，帶電的液滴會(huì)從泰勒錐的頂端噴射出去，形成帶電的直線(xiàn)射流［5］。這個(gè)臨界值被稱(chēng)為臨界電壓，即形成射流的臨界電壓。由于外加電場(chǎng)的干擾，噴射出的直線(xiàn)射流會(huì)經(jīng)過(guò)一個(gè)突然加速的過(guò)程。在此過(guò)程中紡絲液中的溶媒揮發(fā)或者熔融狀態(tài)的高聚物冷卻固化，最終形成了高分子纖維，纖維經(jīng)過(guò)高度拉伸而發(fā)生細(xì)化，最后被接地的接收器收集。

2.2 影響靜電紡絲纖維的因素

靜電紡絲制備過(guò)程受到多方面因素的影響。①聚合物自身的性質(zhì)：聚合物的分子量、溶液或熔融體的導(dǎo)電能力、溶液的黏度及表面張力等［6］；②實(shí)驗(yàn)參數(shù)：電場(chǎng)強(qiáng)度、溶液流速、紡絲頭的直徑和材質(zhì)、纖維的接收距離、接收裝置的材質(zhì)等［7］；③環(huán)境參數(shù)：環(huán)境溫度、濕度、空氣流速等［8］，這些因素相互交織共同影響紡絲過(guò)程，進(jìn)而對(duì)紡絲的形貌和結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。

3 靜電紡絲在組織工程學(xué)中的發(fā)展

3.1 皮膚組織工程學(xué)

最初研究人員研究纖維結(jié)構(gòu)對(duì)皮膚組織再生的影響。Choi等［4］考察了紡絲排列順序?qū)Υ笫笊掀ぜ?xì)胞的再生的影響，結(jié)果表明，隨著紡絲有序化的增加，肌動(dòng)蛋白的生長(zhǎng)更加迅速。體內(nèi)研究表明，與隨機(jī)電紡纖維對(duì)照組相比，定向排列的電紡纖維加速了傷口愈合和膠原纖維排列、血管化和再上皮化。材料的選擇對(duì)皮膚再生也十分重要，與原始材料相比，殼聚糖與膠原蛋白或絲素蛋白混合能夠更好地誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和促進(jìn)傷口愈合［9］。Ma等［10］將川芎嗪加入絲素蛋白電紡支架中，發(fā)現(xiàn)其具有促進(jìn)傷口止血、抗炎的作用。為了改善電紡生物材料的機(jī)械性能，Tian等［11］將生物活性玻璃加入到電紡魚(yú)膠原蛋白納米纖維中。比純魚(yú)膠原蛋白納米纖維具有更高的拉伸強(qiáng)度和抗金黃色葡萄球菌，能促進(jìn)了人皮膚成纖維細(xì)胞的黏附和增殖。Xian等［12］制備了具有廣譜抗菌活性的5種季銨鹽殼聚糖電紡支架，具有良好的生物相容性，能止血、促進(jìn)傷口愈合。

3.2 血管組織工程學(xué)

心血管疾病造成每年的死亡人數(shù)一直居高不下，血管移植是現(xiàn)在治療血管疾病的常用方法，而臨床上血管移植物往往供不應(yīng)求。在這一前提下，許多組織工程師正在開(kāi)發(fā)電紡可吸收的小直徑血管移植物引導(dǎo)血管再生。一些研究小組在使用肝素和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)來(lái)減少血栓形成和改善內(nèi)皮化并取得了顯著成就。Huang等［13］采用同軸靜電紡絲法制備了含肝素的聚乳酸-己內(nèi)酯支架。當(dāng)支架植入狗的股動(dòng)脈時(shí)，肝素充當(dāng)抗凝劑，用以改善血管通暢性。內(nèi)皮祖細(xì)胞稱(chēng)為成血管細(xì)胞,在生理或病理因素刺激下,可從骨髓到外周血管參與損傷血管的修復(fù)。為了促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖，Li等［14］通過(guò)乳液靜電紡絲將VEGF包被到含肝素的支架中。并控釋肝素和VEGF，該支架具有良好的抗凝血和促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖的作用。

為了進(jìn)一步提高血管移植物的生物相容性，可以在電紡支架中加入天然聚合物。Yin等［15］將膠原和殼聚糖與P(LLA-CL)共混，并與P(LLACL)紡絲比較，發(fā)現(xiàn)膠原和殼聚糖組顯著的促進(jìn)了內(nèi)皮細(xì)胞增殖，表明支架的生物相容性得到改善。Kuang等［16］通過(guò)同軸靜電紡絲制備了雙層血管移植物，其中內(nèi)層含有肝素，外殼含有負(fù)載介孔二氧化硅納米顆粒(mesoporous silica nanoparticles，MSN)的丹酚酸B(salvianolicacids B，SAB)。肝素和SAB可持續(xù)釋放近30 d，它們協(xié)同促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)生長(zhǎng)。Zhao等［17］通過(guò)相分離和冷凍干燥的方法制備聚乳酸-己內(nèi)酯[poly(DL-lactide-ε-caprolactone)]，PLCL 單層支架、雙層支架和三層圓柱形支架。經(jīng)過(guò)1周細(xì)胞培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，PLCL多層支架上的細(xì)胞增殖更加明顯。這項(xiàng)研究表明多層支架具有潛在的血管組織工程應(yīng)用前景。

3.3 神經(jīng)組織工程學(xué)

神經(jīng)損傷是一種全球普遍性疾病，影響著全世界數(shù)百萬(wàn)人，這種疾病可能會(huì)使人們患有認(rèn)知運(yùn)動(dòng)或精神上的永久殘疾，加重人們的生活負(fù)擔(dān)，降低生活質(zhì)量。近些年，人們通過(guò)電紡絲制備神經(jīng)支架。由于材料的變化，紡絲神經(jīng)支架已從簡(jiǎn)單的中空管演變成更復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，它被稱(chēng)為神經(jīng)導(dǎo)管 (nerveguide conduit，NGC)［18］。簡(jiǎn)單的空心NGC為再生神經(jīng)提供了生長(zhǎng)的管腔，同時(shí)限制了周?chē)M織的生長(zhǎng)。選擇正確的材料十分重要，它會(huì)影響神經(jīng)再生的潛力。絲素蛋白已被證明具有生物相容性并能促進(jìn)細(xì)胞增殖［19］。Xue等［20］通過(guò)靜電紡絲法制備了絲素蛋白纖維支架作為神經(jīng)導(dǎo)管進(jìn)行手術(shù)移植，用于治療大鼠周?chē)窠?jīng)損傷。手術(shù)12個(gè)月后，絕大多數(shù)導(dǎo)管降解并被具有神經(jīng)樣外觀的組織取代，通過(guò)Walkway?步態(tài)分析系統(tǒng)獲得對(duì)稱(chēng)和步行步態(tài)參數(shù)，用于綜合評(píng)估狗的后肢運(yùn)動(dòng)功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與非移植組相比，移植組表現(xiàn)出更好的站立穩(wěn)定性和運(yùn)動(dòng)機(jī)能，而移植組內(nèi)部對(duì)比并沒(méi)有顯著性差異。這足以表明SF-支架促使受傷后肢的行為恢復(fù)幾乎等同于自體移植物。

除了簡(jiǎn)單的神經(jīng)支架能夠誘導(dǎo)神經(jīng)再生之外，神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)也能夠促進(jìn)中樞神經(jīng)元和外周神經(jīng)元的發(fā)育、生長(zhǎng)、分化和成熟。NGF在維持正常神經(jīng)功能、加速神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)等方面發(fā)揮重要作用。因此，Kui等［21］通過(guò)同軸靜電紡絲將NGF摻入電紡纖維中以促進(jìn)神經(jīng)再生。在這項(xiàng)研究中，NGF從電紡支架中緩慢釋放，并且能夠保持活性超過(guò)60 d，這對(duì)其長(zhǎng)期釋放控制神經(jīng)再生有著重要的意義。此外，與對(duì)照組相比，含有NGF的支架經(jīng)過(guò)12周的體內(nèi)釋放，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，含NGF的神經(jīng)支架有效地促進(jìn)了神經(jīng)再生。Wang等［22］研究了NGF在PLGA殼層纖維中的應(yīng)用，將所得定向收集的紡絲支架包裹在不銹鋼棒上，并用尼龍絲密封形成NGC。將所得NGC移植在大鼠13 mm坐骨神經(jīng)缺損處，修復(fù)12周之后，支架促進(jìn)了神經(jīng)再生，通過(guò)電生理學(xué)和肌肉重量測(cè)試顯示，與未含有NGF生長(zhǎng)因子的對(duì)照組相比，再生神經(jīng)的功能恢復(fù)有明顯的改善。這些研究表明，NGF在促進(jìn)受損周?chē)窠?jīng)修復(fù)中起重要作用。

3.4 骨組織工程學(xué)

世界上由于骨感染引起的骨缺損發(fā)生率很高，因此對(duì)骨移植有巨大的臨床需求［23］。自身骨移植被認(rèn)為是修復(fù)骨缺損的最好方法，因?yàn)樗哂酗@著的骨誘導(dǎo)和骨傳導(dǎo)能力，且沒(méi)有不良免疫反應(yīng)。然而，自身骨和同種異體骨的臨床應(yīng)用都有很多的限制。因此，使用組織工程學(xué)來(lái)再生骨是一種很有前途的方法。骨組織工程支架應(yīng)具有生物相容性、生物可降解性、生物活性以及對(duì)骨環(huán)境具有足夠的力學(xué)性能。為了滿(mǎn)足這些要求，以有機(jī)和無(wú)機(jī)雜化納米纖維等復(fù)合材料為基礎(chǔ)，負(fù)載了骨形態(tài)發(fā)生蛋白、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β3(Transforming growth factor-β3，TGF-β3)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和銀納米顆粒等功能因子的納米纖維支架成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)［24］。Ye等［25］將纖維支架切碎成小段，通過(guò)冷凍干燥、熱交聯(lián)等方法，形成三維類(lèi)骨支架，并制成含有骨的主要礦物成分（納米羥基磷灰石）的復(fù)合支架。然后將合成的骨形態(tài)發(fā)生蛋白 -2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）衍生多肽固定在表面，并在大鼠顱骨缺損模型中對(duì)支架進(jìn)行體外和體內(nèi)評(píng)估。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，納米羥基磷灰石和BMP-2的存在增加了干細(xì)胞成骨分化相關(guān)基因的表達(dá)，BMP-2肽的釋放可維持21 d。與對(duì)照組相比，支架能夠更好誘導(dǎo)骨分化。

在試圖調(diào)節(jié)骨重建過(guò)程中，Yi等［26］設(shè)計(jì)了一種電紡支架，支架包被MSNs和阿侖膦酸鈉，前者可加速骨形成，后者可抑制骨吸收。該支架可將骨愈合時(shí)間從12周縮短到4周。隨著愈合持續(xù)到12周，該支架的骨成熟度評(píng)分幾乎是沒(méi)有MSNs和阿侖膦酸鈉的對(duì)照組支架的2倍，并且骨血管化程度明顯增加。這些結(jié)果表明，負(fù)載MSNs和阿侖膦酸鈉的電紡納米纖維支架調(diào)節(jié)了骨重建過(guò)程，并促進(jìn)了血管形成，這為骨再生提供了充足的營(yíng)養(yǎng)。

為了促進(jìn)細(xì)胞黏附，Gutiérrez-Sanchez 等［27］采用靜電紡絲法制備了含有淀粉的聚乳酸(polylactic acid，PLA)納米纖維，并將精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(arginine-glycine-aspatic acid，RGD)肽吸附到表面。與對(duì)照組相比，RGD修飾的支架具有更好的細(xì)胞黏附性，顯示出引導(dǎo)骨再生的潛力。

3.5 軟骨組織工程學(xué)

軟骨損傷一直是困擾著人們的大問(wèn)題。運(yùn)動(dòng)創(chuàng)傷和人體衰老都會(huì)對(duì)關(guān)節(jié)軟骨造成損傷，這些創(chuàng)傷會(huì)導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)疼痛等疾病。雖然自身移植可用于治療輕微的損傷，但用于移植的軟骨是有限的，而且自體軟骨移植在治療嚴(yán)重的軟骨缺損時(shí)效果不佳。因此，使用電紡支架的組織工程方法是治療輕微和嚴(yán)重軟骨缺損以減少骨關(guān)節(jié)炎的一種很好的方案［28］。

為了研究PVA/CMC復(fù)合材料對(duì)支架網(wǎng)內(nèi)孔隙形成和軟骨組織發(fā)育的影響。Namkaew等［29］將聚乙烯醇(polyvinyl alcohol，PVA)與羧甲基纖維素(carboxymethyl cellulose，CMC)復(fù)合，形成用于制備多孔支架的共聚物溶液。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在聚合物溶液中加入羧甲基纖維素可以調(diào)節(jié)支架的結(jié)構(gòu)和溶脹能力。細(xì)胞接種后14 d，軟骨細(xì)胞活性良好。表明PVA/CMC多孔支架可用于軟骨組織修復(fù)，是一種具有潛力的支架。

除了關(guān)節(jié)軟骨，其他用于治療先天性缺陷、創(chuàng)傷或疾病的透明軟骨再生的紡絲支架也正在研究當(dāng)中。由于耳朵和鼻子透明軟骨的獨(dú)特形態(tài)，可以將靜電紡絲與3D打印相結(jié)合，構(gòu)建有利于透明軟骨再生的支架形狀。Chen等［30］開(kāi)發(fā)了一種用于3D打印的墨水，該墨水由透明質(zhì)酸和聚氧化乙烯(polyethylene oxidized，PEO)溶液和切碎的靜電紡絲膜組成，靜電紡絲包含PLGA/明膠。該支架可在30 s內(nèi)快速恢復(fù)形狀，可用于體內(nèi)復(fù)雜軟骨結(jié)構(gòu)的再生。

4 展望

電紡為組織工程支架的制備提供了一個(gè)簡(jiǎn)單可靠的方法。目前，隨著組織工程支架的發(fā)展，靜電紡絲工藝也發(fā)生了許多新變化，衍生出同軸電紡絲、乳液電紡絲和動(dòng)態(tài)液體電紡絲，而且可以將生物活性物質(zhì)和信號(hào)分子包裹在紡絲內(nèi)。此外，電紡可以與其他研究工藝相結(jié)合，如冷凍和3D打印，以創(chuàng)建具有復(fù)雜3D特征的納米纖維支架。

各種各樣的天然聚合物、合成聚合物和它們的混合物已經(jīng)被用來(lái)制造電紡支架，并用于皮膚、骨、軟骨、神經(jīng)、血管等組織工程當(dāng)中。已有數(shù)種電紡纖維支架商業(yè)化生產(chǎn)，用于治療各種疾病。例如，廣州美普林再生醫(yī)療技術(shù)有限公司開(kāi)發(fā)了PLA納米纖維藥物產(chǎn)品，用于人體硬腦膜的再生，已在多年前就通過(guò)了歐洲CE和中國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（CFDA)認(rèn)證。上海松利生物科技有限公司開(kāi)發(fā)了用于治療疝氣的纖維蛋白原/PLCL納米纖維疝貼產(chǎn)品，于2018年獲得CFDA證書(shū)。山東漢方藥業(yè)有限公司開(kāi)發(fā)了一種用于傷口敷料的絲素/PLCL納米纖維膜，也于2019年獲得了CFDA證書(shū)。此外，仍有許多生物醫(yī)學(xué)公司正在開(kāi)發(fā)其他生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的纖維支架，在不久的將來(lái)，會(huì)有更多商業(yè)化的納米纖維醫(yī)療產(chǎn)品面市，電紡和電紡納米纖維支架的進(jìn)一步發(fā)展為各種組織工程應(yīng)用帶來(lái)了希望，并可能改善世界各地患者的生活質(zhì)量。

靜電紡絲在未來(lái)的組織工程學(xué)中能夠廣泛地應(yīng)用，其將來(lái)發(fā)展的重點(diǎn)有：①紡絲材料：高聚物種類(lèi)繁多，通過(guò)對(duì)不同材料組合或者對(duì)材料進(jìn)行功能化，可以獲得更好性能的電紡材料。②紡絲產(chǎn)量：紡絲產(chǎn)量較低是一問(wèn)題，完善靜電紡絲各種參數(shù)，可以進(jìn)行多通道電紡提高紡絲產(chǎn)量。