榨菜發(fā)酵過程中原核微生物群落結(jié)構(gòu)及其理化因子的動態(tài)演替

吳曉紅，高生平，蔣彩云，王清政

1(江蘇經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京，211168) 2(南京工業(yè)大學(xué) 浦江學(xué)院，江蘇 南京，211134)

榨菜是我國主要的腌制加工蔬菜，是世界三大醬腌菜之一，通常作為配菜或開胃菜。榨菜的傳統(tǒng)制作工藝用鹽量高，抑制了高品質(zhì)的乳酸菌活性，同時對產(chǎn)品的風(fēng)味、營養(yǎng)及安全性等品質(zhì)產(chǎn)生諸多不良影響[1-2]。而低鹽腌制榨菜不僅可以改善榨菜的品質(zhì)、安全性及營養(yǎng)價值，同時也符合當今世界蔬菜腌制向營養(yǎng)、天然和綠色方向發(fā)展的趨勢[3]。

近年來，分子生物學(xué)免培養(yǎng)技術(shù)被廣泛用于研究傳統(tǒng)釀造食品的微生物群落組成。LIANG等[4]采用高通量測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)乳酸菌是榨菜發(fā)酵過程中最為重要的微生物之一，呈先迅速增加后維持穩(wěn)定的變化趨勢，且在前期以明串珠菌屬(Leuconostoc)和魏斯氏菌屬(Weissella)為主，中期以乳桿菌屬(Lactobacillus)為主，而后期則以乳桿菌屬和片球菌屬(Pediococcus)為主。此外，張銳等[5]利用單鏈構(gòu)象多態(tài)性技術(shù)發(fā)現(xiàn)腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)為榨菜發(fā)酵初期的優(yōu)勢茵種，隨著發(fā)酵環(huán)境條件的變化，乳桿菌屬為榨菜發(fā)酵中后期的優(yōu)勢茵群。乳酸菌可能來源于發(fā)酵原料和自然環(huán)境，其可將原料中的小分子糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為酸類化合物，從而賦予榨菜柔和的酸感；部分糖類物質(zhì)可被轉(zhuǎn)化為醇類化合物，這些醇類物質(zhì)和酸類代謝物反應(yīng)形成酯類物質(zhì)，進而賦予產(chǎn)品具有酯香和醇香的特征[6]。乳酸菌通過蛋白水解系統(tǒng)將發(fā)酵基質(zhì)中的可溶性蛋白分解成短肽和氨基酸等小分子代謝產(chǎn)物，從而賦予產(chǎn)品獨特的鮮味特征[7]。目前，很多乳酸菌，如腸膜明串珠菌、短乳桿菌和植物乳桿菌，已被用作發(fā)酵劑，以加快榨菜的發(fā)酵過程，提高產(chǎn)品品質(zhì)[8-10]。

本研究采用16S rRNA高通量測序技術(shù)全面解析榨菜發(fā)酵過程中原核微生物群落的演替規(guī)律，并基于冗余分析探究影響微生物菌群變化的理化因素，以期揭示榨菜發(fā)酵過程不同時期原核微生物群落形成原因。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品：取四川省某調(diào)味品有限公司2個不同發(fā)酵池發(fā)酵1、7、14、21、35、50、65和80 d的榨菜發(fā)酵液，將每個發(fā)酵池的發(fā)酵液分為2份，于-20 ℃下貯藏，1份用于理化指標分析，1份用于DNA提取。

試劑：NaOH、酚酞、鄰苯二甲酸氫鉀、鹽酸萘乙二胺等(分析純)，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；乳酸、丙酮酸、檸檬酸、蘋果酸、乙酸、酒石酸、琥珀酸、草酸等(色譜純)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；E.Z.N.A.?水樣DNA 提取試劑盒,美國Omega公司。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外可見分光光度計(UV BlueStar A)，北京萊伯泰科儀器股份有限公司；pH計(PB-10)，德國Sartorius公司；高速冷凍離心機(TGL-20M)，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；高效液相色譜儀(1260)，美國Agilent公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 理化性質(zhì)分析

用pH計測定酸菜發(fā)酵液樣品的pH；使用滴定法測定總酸含量[11]；采用菲林試劑滴定法測定還原糖含量[12]；采用鹽酸萘乙二胺法測定亞硝酸鹽含量[13]。

采用高效液相色譜儀檢測有機酸含量。取適量酸菜發(fā)酵液，加入等體積的硫酸鋅和亞鐵氰化鉀，搖勻，10 000 r/min離心20 min，保留上清液過0.45 μm水系濾膜后待用。色譜條件：進樣量10 μL；流動相為0.02 mol/L的NaH2PO4溶液；柱流速 0.7 mL/min；檢測波長210 nm；柱溫30 ℃[14]。

1.3.2 DNA提取與Illumina高通量測序

使用DNA 提取試劑盒對發(fā)酵液樣品進行總DNA提取。使用Qubit 2.0熒光定量儀測定其溶度和純度。將合格的DNA委托南京諾唯贊生物科技有限公司完成建庫及Illumina Miseq 雙端測序。其中16S rDNA擴增子引物對為338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，擴增區(qū)域為16S rDNA擴增子的V3～V4區(qū)。

1.3.3 測序數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計學(xué)分析

采用FLASH軟件[15]對測序的原始數(shù)據(jù)進行拼接，利用QIIME軟件[16]對低質(zhì)量的拼接序列進行過濾，使用UCHIME軟件[17]去除嵌合體，得到優(yōu)質(zhì)序列。根據(jù)UCLUST軟件[18]在相似性97%的水平上對優(yōu)質(zhì)序列進行聚類，得到各可操作分類單元(operational taxonomic unit, OTU)，以各OTU中豐度最高的序列作為代表序列。在80%置信水平下，通過Silva 132數(shù)據(jù)庫[19]對OTU進行分類學(xué)注釋，將藍藻門和不能注釋到門水平的OTU刪除。基于OTU得到分析結(jié)果，采用隨機抽平的方法，利用QIIME軟件[16]對樣品進行多樣性分析。基于OTU的主坐標分析、樣本聚類分析、Venn圖繪制、熱圖繪制、冗余分析均通過R軟件實現(xiàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 榨菜發(fā)酵過程中理化因子變化

如圖1所示，隨著發(fā)酵的啟動，榨菜發(fā)酵液的pH值在發(fā)酵1～35 d內(nèi)迅速降低，從pH 6.31下降至pH 3.78；此后，pH值隨發(fā)酵時間的延長而緩慢下降，于發(fā)酵80 d穩(wěn)定在pH 3.61，其結(jié)果與杜書等[7]研究結(jié)果相似。此外，總酸含量則與pH值的變化呈相反的趨勢，在整個發(fā)酵過程中持續(xù)上升，于發(fā)酵65 d達到穩(wěn)定，其含量為10.81 g/L。酸性環(huán)境不僅會影響不耐酸的微生物生長繁殖，還可促進部分抗酸微生物的繁殖，導(dǎo)致總酸含量持續(xù)增加，賦予榨菜具有柔和的酸味[6]。

圖1 榨菜發(fā)酵過程中pH、總酸含量、還原糖含量及 亞硝酸鹽含量的動態(tài)變化Fig.1 Dynamic changes of pH and the contents of total acid, reducing sugar and nitrite during the fermentation of Zhacai

還原糖是微生物生長繁殖主要的能源物質(zhì)之一，而榨菜發(fā)酵是將原料中的還原糖生成醇、酸和酯等風(fēng)味物質(zhì)的過程。由圖1可知，還原糖含量的變化趨勢與pH值的變化相一致，在整個發(fā)酵過程中持續(xù)下降。發(fā)酵1～35 d，還原糖含量快速降低；隨后還原糖含量隨發(fā)酵的持續(xù)進行而緩慢降低，于發(fā)酵65 d達到穩(wěn)定，維持在0.5 g/L左右。說明較高的還原糖含量可使微生物大量繁殖，將還原糖轉(zhuǎn)化為酸、醇和酯等風(fēng)味物質(zhì)[20]。發(fā)酵原料及發(fā)酵器具中含有的腸桿菌科、假單胞菌屬和黃桿菌屬等革蘭氏陰性菌會分泌硝酸還原酶，可將植物體內(nèi)的硝酸鹽轉(zhuǎn)變?yōu)閬喯跛猁}[21]。榨菜發(fā)酵液中亞硝酸鹽含量在整個發(fā)酵過程中呈先升后降的趨勢，于發(fā)酵14 d達到最大值，為53.16 mg/L，50～80 d達到穩(wěn)定，含量維持在2.31～2.53 mg/L，遠低于國標規(guī)定泡菜中的亞硝酸鹽含量為20 mg/kg的限量標準[22]。

有機酸不僅是榨菜發(fā)酵主要的呈味物質(zhì)，也是指示發(fā)酵進程的一個重要指標。由圖2可知，在榨菜發(fā)酵過程中檢測到8種有機酸，分別為草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸和丙酮酸，并監(jiān)測其在整個發(fā)酵過程中的動態(tài)變化。在發(fā)酵1 d時，草酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸和丙酮酸是主要的有機酸，占整個有機酸的97%，但隨著發(fā)酵的不斷進行，除丙酮酸外其他 4種有機酸的含量均在逐漸增加，在發(fā)酵80 d時可分別達到0.88、0.73、1.31和0.26 g/L。此外，乳酸、蘋果酸和酒石酸的含量在整個發(fā)酵過程也呈增加的趨勢，分別從0.006、0.01和0.001 g/L增加至7.25、1.17和0.25 g/L，其中乳酸含量的變化最顯著，增加了12 082倍之多。在發(fā)酵80 d時，乳酸含量占整個有機酸比例的60.79%，說明乳酸是影響榨菜口感的主要有機酸，且具有酸味柔和、濃厚等特征。

圖2 榨菜發(fā)酵過程中有機酸含量的動態(tài)變化Fig.2 Dynamic changes of organic acid contents during the fermentation of Zhacai

2.2 榨菜發(fā)酵過程中原核微生物群落α多樣性分析

如圖3所示，當測序深度超過10 000條時，稀釋曲線進入平臺期。由于本研究測序深度(≥33 798條)遠大于10 000條且覆蓋率均超過97%(表1)，說明本次測序深度足夠覆蓋整個榨菜發(fā)酵的群落，從而獲得絕大多數(shù)微生物信息。

圖3 基于榨菜微生物群落OTUs 觀察的稀釋曲線Fig.3 Rarefaction curves of Zhacai microbial communities based on observed OTUs 注：不同顏色的曲線代表不同的發(fā)酵時間；同一顏色的曲線分別代表 兩個不同發(fā)酵池的樣品，_1代表發(fā)酵池1，_2代表發(fā)酵池2(下同)

由表1可知，利用Illumina Miseq高通量測序技術(shù)可得到620 685條優(yōu)質(zhì)序列，平均33 798～42 358條/樣本。根據(jù)樣本的最低序列數(shù)對所有樣本進行抽平，并進行后續(xù)分析。通過OTU聚類(97%相似度)后可得到364個OTU，OTU平均91～151個/樣本。Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Pielou指數(shù)是評價群落多樣性、豐富度和均勻度的常用指數(shù)。在整個發(fā)酵過程中，樣品中原核微生物群落的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Pielou指數(shù)均呈先增后降的變化趨勢，且都在發(fā)酵14 d時達到最大，分別為3.04、0.92和0.65，說明該發(fā)酵時間的群落多樣性和均勻度最高。上述結(jié)果說明發(fā)酵原料、器具及環(huán)境中的原核微生物可快速適應(yīng)低鹽和低酸的發(fā)酵環(huán)境，從而迅速生長繁殖，搶占有利生態(tài)位。隨著發(fā)酵的不斷進行，發(fā)酵環(huán)境逐漸酸化，pH不斷減低，樣品中原核微生物群落的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Pielou指數(shù)均逐漸下降。

表1 榨菜發(fā)酵過程中原核微生物群落序列 數(shù)量和α多樣性參數(shù)Table 1 Sequence numbers and α-diversity indices of prokaryotic microbial communities during the fermentation of Zhacai

這種現(xiàn)象主要是與榨菜發(fā)酵環(huán)境有關(guān)，由于pH和總酸是影響釀造原核微生物群落α多樣性(Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Pielou指數(shù))的主要因素，pH和總酸會顯著影響微生物群落結(jié)構(gòu)，從而改變?nèi)郝洇炼鄻有訹23]。說明酸性環(huán)境會抑制大部分微生物的生長繁殖，但不會影響某些耐酸微生物的生長繁殖，這些耐酸微生物在群落中的比例逐漸增大，從而造成微生物多樣性和均勻度的下降。本研究中的榨菜發(fā)酵液的pH從6.31下降至3.61、總酸從0.4 g/L增加至10.81 g/L，這可能是導(dǎo)致不同發(fā)酵時間原核微生物群落α多樣性差異的主要原因。

2.3 榨菜發(fā)酵過程中原核微生物群落β多樣性分析

基于OTU組成對16個榨菜發(fā)酵液樣品進行層次聚類分析。如圖4所示，這些榨菜發(fā)酵液樣品被劃為2個簇，發(fā)酵1～7 d的樣品單獨聚為1簇(Ⅰ)，其他發(fā)酵時間的樣品聚為另一簇(Ⅱ)；第Ⅱ簇又可以分為兩個亞簇，發(fā)酵14～35 d的樣品聚在第ⅰ亞簇，發(fā)酵50～80 d的樣品聚在第ⅱ亞簇，故可將整個榨菜發(fā)酵分為3個不同的階段，分別為發(fā)酵前期、發(fā)酵中期和發(fā)酵后期。上述結(jié)果表明不同發(fā)酵時間的發(fā)酵液樣品中原核微生物群落呈現(xiàn)出顯著的時間異質(zhì)性。這可能是由于發(fā)酵環(huán)境逐漸酸化(圖1)，LIU等[24]研究結(jié)果表明總酸會顯著影響泡菜發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)。此外，還發(fā)現(xiàn)2個不同發(fā)酵池的原核微生物群落變化具有一致性，說明榨菜發(fā)酵具備較強的批次穩(wěn)定性。只有穩(wěn)定的微生物群落變化才能造就產(chǎn)品口感、品質(zhì)及功能的穩(wěn)定。因此，進一步解析不同發(fā)酵時間的榨菜發(fā)酵液樣品中原核微生物群落組成有助于深入揭示榨菜微生物群落時間異質(zhì)性的形成原因。

圖4 榨菜發(fā)酵過程中不同發(fā)酵時間樣品的層次聚類Fig.4 Hierarchical clustering of samples with different fermentation time during the fermentation of Zhacai

2.4 榨菜發(fā)酵過程中原核微生物群落結(jié)構(gòu)和演替分析

線經(jīng)OTU注釋，所有樣品中共檢測到12個可鑒定門。如圖5所示，4個優(yōu)勢菌門(至少在2個樣品中相對豐度 > 1%的門)，占每個樣品總相對豐度的99%以上。在整個發(fā)酵過程中，變形菌門(Proteobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)的平均相對豐度持續(xù)降低，分別從74.49%和4.33%降低至6.01%和0.37%；而厚壁菌門(Firmicutes)的平均相對豐度持續(xù)升高，從15.59%升高至92.77%。結(jié)果說明厚壁菌門主導(dǎo)了榨菜發(fā)酵的成熟。

圖5 榨菜發(fā)酵過程中原核微生物群落在門水平的演替Fig.5 Succession of prokaryotic microbial communities in samples at phylum level during the fermentation of Zhacai

所有樣品中共檢測到134個屬，其中發(fā)酵7 d的樣品屬水平微生物數(shù)量最少(28個)，發(fā)酵50 d的樣品屬水平微生物數(shù)量最多(77個)。柱狀圖進一步展示了19個優(yōu)勢屬在榨菜發(fā)酵過程中的動態(tài)變化。由圖6可知，檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、Cobetia、腸桿菌屬(Enterobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium)和魏斯氏菌屬(Weissella)主要在發(fā)酵1 d樣品中富集，隨著發(fā)酵的不斷進行，這些微生物的平均相對豐度逐漸降低。其中假單胞菌屬在發(fā)酵1 d的平均相對豐度可達39%之高，而腸桿菌屬的平均相對豐度為1%左右，說明假單胞菌屬和腸桿菌屬存在于新鮮蔬菜和發(fā)酵器具中，生存能力強，適應(yīng)環(huán)境范圍廣[25]。正是由于這些具有硝酸還原酶的革蘭氏陰性菌存在，導(dǎo)致榨菜發(fā)酵前期亞硝酸鹽含量增加。此外，明串珠菌屬(Leuconostoc)在發(fā)酵1 d的平均相對豐度可達3.61%，其在整個發(fā)酵過程中呈先增后降的變化趨勢,與張銳等[5]研究結(jié)果相一致，說明明串珠菌屬是附著在新鮮榨菜上的主要乳酸菌。在低鹽的環(huán)境下，榨菜表面滲出的汁液非常適合明串珠菌屬的生長繁殖，其產(chǎn)生的CO2和酸使pH迅速下降，從而阻止其他有害微生物的生長繁殖[5]。同時，明串珠菌屬可將多余的糖轉(zhuǎn)化為甘露醇和葡聚糖，而這2種物質(zhì)非常適合乳酸菌的發(fā)酵[26]。明串珠菌屬的生長繁殖可迅速改變發(fā)酵環(huán)境，更適宜其他乳酸菌按一定的順序生長，從而起到發(fā)酵啟動劑的作用[5]。不動桿菌屬(Acinetobacter)、乳球菌屬(Lactococcus)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)、鹽弧菌屬(Salinivibrio)和弧菌屬(Vibrio)的平均相對豐度的變化趨勢和明串珠菌屬的變化相一致。其中乳球菌屬在發(fā)酵35 d的平均相對豐度最高，可達21.43%，說明乳球菌屬可在該發(fā)酵環(huán)境中迅速生長繁殖，占領(lǐng)足夠多的生態(tài)位，且可與明串珠菌屬互利共生。此外，芽孢桿菌屬(Bacillus)、鹽單胞菌屬(Halomonas)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、Oceanobacillus、片球菌屬(Pediococcus)和四聯(lián)球菌屬(Tetragenococcus)的平均相對豐度在整個發(fā)酵過程中持續(xù)增加，尤其是乳桿菌屬的平均相對豐度從0.92%增加至74.77%，說明乳桿菌屬對榨菜發(fā)酵起著主導(dǎo)作用，且這些微生物均可以和乳桿菌屬互利共生。鹽單胞菌屬和片球菌屬具有耐鹽的特性，能分解葡萄糖，產(chǎn)生多種風(fēng)味物質(zhì)，推測具存在與生產(chǎn)泡菜“鹽漬”這一步驟有關(guān)[27]。四聯(lián)球菌屬廣泛存在與含鹽的腌制類發(fā)酵食品中，可參與氨基酸的合成及生成醛、醇、酮和酯等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，從而提升發(fā)酵食品的風(fēng)味和口感[28]。

圖6 榨菜發(fā)酵過程中原核微生物群落在屬水平的演替Fig.6 Succession of prokaryotic microbial communities in samples at genus level during the fermentation of Zhacai

由圖7可知，整個發(fā)酵過程中共有的OTU數(shù)為78個，但隨著發(fā)酵的不斷進行，不同發(fā)酵階段之間的共有微生物和特有微生物的數(shù)量逐漸增加，彰顯榨菜發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和特殊性。上述結(jié)果說明有些微生物只能在特定的環(huán)境下才能激活其生長繁殖，而在其他環(huán)境下處于休眠的狀態(tài)。

圖7 榨菜發(fā)酵過程中不同發(fā)酵階段的原核微生物群 落在OTU水平的Venn圖Fig.7 Venn diagram of prokaryotic microbial communities in samples of different fermentation stages at OTU level during the fermentation of Zhacai

2.5 榨菜發(fā)酵過程中不同發(fā)酵階段標志性微生物分析

線性判別分析效應(yīng)大小(linear discriminant analysis effect size，LEfSe)是一種用于發(fā)現(xiàn)和解釋高維度數(shù)據(jù)生物標識的分析工具，用于發(fā)現(xiàn)不同生物條件或環(huán)境下的多組樣本中最能解釋組間差異的物種特征，以及這些特征對組間差異的影響程度。因此，使用LEfSe分析鑒定出不同發(fā)酵階段的標志性微生物。由圖8可知，發(fā)酵前期的樣品中標志性微生物有5個，分別來自鞘氨醇桿菌屬、魏斯氏菌屬、Cobetia、弧菌屬和假單胞菌屬；發(fā)酵中期的樣品中標志性微生物也有5個，分別來自氣微菌屬(Aeromicrobium)、上地桿菌屬(Pedobacter)、明串珠菌屬、乳球菌屬和不動桿菌屬；而發(fā)酵后期的樣品中標志性微生物同樣也有5個，分別來自芽孢桿菌屬、四聯(lián)球菌屬、乳桿菌屬、片球菌屬和鹽單胞菌屬。這些標志性微生物的鑒定結(jié)果與圖6中的變化規(guī)律一致。

2.6 榨菜發(fā)酵過程中理化因子與原核微生物群落的冗余分析

根據(jù)冗余分析可將19個優(yōu)勢屬大致分為3個類群(圖9-a陰影區(qū)域)，每個類群對應(yīng)不同發(fā)酵階段的榨菜發(fā)酵液樣品(圖9-b)。結(jié)合圖6和圖8發(fā)現(xiàn)每個類群在其對應(yīng)發(fā)酵階段中的相對豐度最高，如圖9-a中藍色陰影區(qū)域的8個屬的相對豐度在發(fā)酵前期最高；黃色陰影區(qū)域的5個屬的相對豐度則在發(fā)酵中期最高；紫色陰影區(qū)域的6個屬的相對豐度則在發(fā)酵后期最高。榨菜發(fā)酵過程中理化因子對優(yōu)勢屬菌群結(jié)構(gòu)的總解釋貢獻度為91.23%(圖9)，其中RDA1軸的貢獻度為72.67%，可將發(fā)酵前期和發(fā)酵后期這2個階段的樣品較好的區(qū)分開；RDA2軸的貢獻度為18.56%，可將發(fā)酵中期與其他兩個階段的樣品較好的區(qū)分開。根據(jù)圖9-b可知，多個理化因子共同影響榨菜發(fā)酵過程中原核微生物的群落結(jié)構(gòu)，如發(fā)酵前期的微生物群落與pH和還原糖呈正相關(guān)，與總酸和其它有機酸呈負相關(guān)；發(fā)酵中期的微生物群落與亞硝酸鹽、丙酮酸和琥珀酸呈正相關(guān)；而發(fā)酵后期的微生物群落與總酸和大部分有機酸呈正相關(guān)。

圖8 榨菜發(fā)酵過程中不同發(fā)酵階段生物標志性微生物的分析Fig.8 Analysis of biomarker microorganism in different fermentation stage during the fermentation of Zhacai

圖9 酸菜發(fā)酵過程中理化因子分別與優(yōu)勢屬及 樣品的RDA關(guān)系圖Fig.9 Redundancy analysis between physicochemical factors and dominant genera and samples during the fermentation of Zhacai 注：a-不同顏色的陰影區(qū)域代表不同的類群；b-不同顏色的 陰影區(qū)域代表不同的發(fā)酵階段，與圖7和圖8的顏色標識相一致； 不同類型的符合代表不同發(fā)酵時間的樣品，與圖4中的標識相一致

利用條件限制分析揭示每個理化因子對榨菜發(fā)酵過程中原核微生物群落結(jié)構(gòu)的影響程度，其中乳酸(9.55%)和pH(9.33%)對菌群的影響較大，其他理化因子均都在6%以上，說明多個理化因子共同決定榨菜發(fā)酵微生物群落的變化。此外，相關(guān)研究表明乳酸和乙酸與中國辣白菜的微生物群落進行呈顯著正相關(guān)[24]。綜上，榨菜發(fā)酵過程中原核微生物群落受多種理化因子的共同影響，這些理化因子共同驅(qū)動了群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，從而保證榨菜的品質(zhì)和口感。

3 結(jié)論

本研究利用16S rRNA高通量測序技術(shù)揭示榨菜發(fā)酵過程中原核微生物群落的組成和演替規(guī)律，同時分析發(fā)酵過程中理化因子的變化。隨發(fā)酵的不斷進行，pH和還原糖含量下降，總酸含量上升，而亞硝酸鹽含量呈先增后減的變化趨勢。乳酸是其主要的有機酸，占總有機酸的60%之多。原核微生物群落的多樣性和均勻性均呈先增后降的變化趨勢。根據(jù)微生物群落的信息，可將發(fā)酵過程分為3個不同的階段，且每個階段的標志性微生物均不同。乳桿菌屬是發(fā)酵過程中處于絕對優(yōu)勢微生物，其相對豐度從0.92%增加至74.77%。此外，冗余分析表明：發(fā)酵初期的群落與pH及還原糖含量呈正相關(guān)；發(fā)酵中期的群落與亞硝酸鹽、丙酮酸和琥珀酸含量呈正相關(guān)；而發(fā)酵后期的群落與總酸和其他有機酸含量呈正相關(guān)。本研究為進一步精確人工調(diào)控提供理論依據(jù)和篩選特性菌種提供了參考。