子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞對小鼠模型薄型子宮內(nèi)膜的修復作用

李瑞嬌，張汝月，郭興萍，張引紅，李紅霞

(山西省生殖科學研究所，出生缺陷與細胞再生山西省重點實驗室，太原 030006)

近年來，隨著不孕癥發(fā)生率的逐年上升[1]，輔助生殖技術廣受關注。子宮內(nèi)膜作為胚胎著床的重要場所，狀態(tài)好壞直接影響著手術的成敗。數(shù)據(jù)顯示，子宮內(nèi)膜厚度≥8 mm是胚胎成功著床的關鍵指標，小于6 mm時著床成功率則會發(fā)生明顯下降[2]。對于成功妊娠的最低子宮內(nèi)膜厚度下限，目前尚無統(tǒng)一說法，但通常將低于7 mm的子宮內(nèi)膜稱為薄型子宮內(nèi)膜[3]。薄型子宮內(nèi)膜的發(fā)生大多表現(xiàn)為藥物流產(chǎn)、刮宮等宮腔操作手術的后續(xù)反應，此外部分患者會出現(xiàn)伴隨著年齡增加而子宮內(nèi)膜變薄的情況[4]。研究發(fā)現(xiàn)，薄型子宮內(nèi)膜通常伴隨著動脈血流壓力增大，血供不足，血管內(nèi)皮生長因子表達下調(diào)，腺上皮細胞增殖受限等[5]。針對薄型子宮內(nèi)膜的臨床治療方法較多，例如內(nèi)膜局部搔刮、激素補充、藥物刺激、電刺激等，但都效果有限，且個體差異較為明顯[6]。

干細胞是一種具有強大自我復制能力和多向分化潛能的細胞[7]。子宮內(nèi)膜干細胞作為基于子宮內(nèi)膜本身的自體干細胞，有著易于定向分化和低免疫原性的優(yōu)勢[8]。本實驗將小鼠子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞移植至制作好的薄型子宮內(nèi)膜小鼠模型中，獲得了明顯的修復效果，為臨床薄型子宮內(nèi)膜的修復提供思路。

材料與方法

一、實驗動物

雌性C57BL/6J小鼠288只，SPF級，8周齡(性成熟且未交配)，體重19～22 g；雄性C57BL/6J小鼠36只，SPF級，10周齡(預實驗已確定有生育能力)，體重22～25 g。均由山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供[SCXK(晉)2015-0001]。飼養(yǎng)條件：山西醫(yī)科大學實驗動物中心屏障環(huán)境，每5只一籠，溫度(25±2)℃，濕度(55±2)%，光照明暗時間比為12 h/12 h，自由獲取食物和水。本實驗操作經(jīng)本單位倫理委員會批準，遵循實驗動物倫理學要求。

二、實驗試劑及儀器

細胞培養(yǎng)液MesenCultTMExpansion Kit(Mouse)、L-Glutamine(STEMCELL，加拿大)；戊巴比妥鈉(Ceres Chemical，美國)；無水乙醇、甲醛、二甲苯(上海國藥試劑)；生理鹽水(山東華魯制藥)；伊紅、蘇木素、中性樹脂(武漢Bioswamp)；SP Rabbit & Mouse HRP Kit(DAB)(北京康為世紀)；pan-cytpkeratin(H-240)：sc-15367(Santa cruz，美國)、ERα(hc-20)：sc-543(Santa cruz，美國)、monoclonalanti-vimentin：V-6630(Sigma，美國)、VEGF antibody(VG-1)：ab1316(Abcam，英國)。

研究級正置顯微鏡(Olympus IX51，日本)；組織脫水機(湖北康強醫(yī)療器械)；石蠟包埋機(湖北泰維科技)；石蠟切片機(Leica，德國)；攤片烤片機(湖北康強醫(yī)療器械)；細胞培養(yǎng)箱(ThermoForma，美國)；倒置顯微鏡(Leica，德國)。

三、實驗方法

1.小鼠子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞分離培養(yǎng)：基于間充質(zhì)干細胞具有相似特性，采用加拿大STEMCELL公司特配的小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞富集培養(yǎng)液以貼壁培養(yǎng)的方法對C57BL/6J小鼠子宮細胞進行富集培養(yǎng)；并利用流式細胞儀對所獲干細胞進行表面標記鑒定，包括CD29/CD45/CD73/CD90/CD105。將生長狀態(tài)良好的P5細胞從培養(yǎng)瓶消化下來，消化方法參見文獻[9]。將消化所得酶液和細胞混合液轉(zhuǎn)移至無菌的15 ml離心管中，1 000 r/min，離心5 min，棄上清，收集沉淀。加入PBS調(diào)整細胞濃度，終濃度為5×105/ml，備用。具體操作參見本課題組已發(fā)表文獻[9]。

2.薄型子宮內(nèi)膜動物模型的建立：采用宮腔注射95%乙醇的方法，并通過形態(tài)觀察、子宮內(nèi)膜厚度測定、HE染色、免疫組化、生育力評估對模型進行鑒定。具體操作參見本課題組已發(fā)表文獻[10-11]。

3.分組處理：288只小鼠隨機分為空白對照組、模型對照組、干細胞移植組，每組96只?？瞻讓φ战M不做任何處理；模型對照組宮腔注射95%乙醇損傷后立即原位注射PBS 0.1 ml，3 d后尾靜脈注射PBS 1 ml；干細胞移植組宮腔注射95%乙醇損傷后立即原位注射子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞0.1 ml，3 d后尾靜脈注射子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞1 ml。此時記為第0天，分別于第3、7、14、30天取樣及合籠。

每組根據(jù)取樣時間(3 d、7 d、14 d、30 d)不同分為4小組。取樣當日，半數(shù)小鼠麻醉后獲取子宮組織后立即放入4%多聚甲醛中固定；半數(shù)小鼠通過合籠懷孕情況，進行生育力評估。

4.子宮內(nèi)膜形態(tài)學觀察(HE染色)：取出固定好的子宮，脫水透明后用石蠟豎直包埋，包埋好后可見圓形宮腔，切片，厚度為5 μm。HE染色后顯微鏡下觀察子宮內(nèi)膜組織結(jié)構(gòu)，并使用Leica Qwin plus圖像處理軟件對子宮內(nèi)膜厚度進行測量，測量位置為子宮內(nèi)膜上皮層至肌層的垂直距離，每個樣本取3個不同位置進行測量，求均值。

5.子宮內(nèi)膜再生評估：以免疫組化染色方法檢測子宮內(nèi)膜中角蛋白(Cytokeratin，CK)、波形蛋白(Vimentin，Vim)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、雌激素受體α(ERα)的表達，以評價子宮內(nèi)膜細胞的再生情況[10-11]，實驗方法參考SP Rabbit & Mouse HRP Kit(DAB)試劑盒說明書進行。其中CK一抗pan-cytpkeratin(H-240)：sc-15367稀釋倍數(shù)為1∶50，抗原修復方法為檸檬酸鈉緩沖液高壓修復10 min；Vim一抗monoclonalanti-vimentin：V-6630稀釋倍數(shù)為1∶200，抗原修復方法同樣為檸檬酸鈉緩沖液高壓修復10 min；VEGF一抗antibody(VG-1)：ab1316稀釋倍數(shù)為1∶150，抗原修復方法為EDTA緩沖液高壓修復10 min；ERα一抗(hc-20)：sc-543稀釋倍數(shù)為1∶100，抗原修復方法為檸檬酸鈉緩沖液高壓修復20 min。評價指標采用平均光密度法，使用Imagepro-plus圖像分析系統(tǒng)對各組免疫組化切片進行分析，平均光密度(AOD meandensity)=IOD(integrated optical density)累積光密度/area。每張切片選擇3個高倍鏡視野，求均值。圖片放大倍數(shù)為200倍。

6.生育力評估：每天下午17：30以雌雄2∶1的比例將實驗小鼠與確定有生殖能力的雄鼠進行合籠交配。每天早上08：00觀察陰栓，以確定是否成功交配。

若交配成功，即將雌、雄小鼠分開飼養(yǎng)，并進行標記。若交配不成功，繼續(xù)合籠，但合籠大約2周后，停止合籠。觀察到陰栓約16.5 d后，將雌性小鼠頸椎脫臼處死以確定懷孕情況。暴露子宮，觀察小鼠子宮妊娠情況，記錄并分析[11]。

四、數(shù)據(jù)分析

結(jié) 果

一、子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞

圖1 第三代小鼠子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞(×100)

二、子宮形態(tài)變化圖

因小鼠為雙子宮動物，考慮單側(cè)實驗便于與另一側(cè)作為對照，所以每次實驗選擇單側(cè)損傷，單側(cè)修復。經(jīng)過損傷(及處理)后30 d，與空白對照組(圖2A)相比，模型對照組針孔上方有明顯結(jié)節(jié)，頂部皺縮(圖2B)，有一定程度的宮腔粘連，猜測為宮腔炎癥所導致。干細胞移植組形態(tài)明顯較為規(guī)則，外觀流暢，恢復較好(圖2C)。

三、子宮內(nèi)膜厚度分析

隨著時間延長，空白對照組子宮內(nèi)膜變化無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；模型對照組子宮內(nèi)膜輕微增厚，但3 d和7 d兩個時間點比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，14 d和30 d兩個時間點見部分樣本纖維化，無法準確統(tǒng)計；干細胞移植組隨著時間延長，子宮內(nèi)膜逐漸增厚，各時間點比較均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，其中7～14 d增幅較大，而3～7 d、14～30 d增幅較緩(表1)。

模型對照組可測量厚度的兩個時間點內(nèi)膜厚度均顯著薄于對應時間點的空白對照組(P<0.05)，且顯著薄于對應時間點的干細胞移植組(P<0.05)；干細胞移植組與同時間點空白對照組比較，仍有顯著差異(P<0.05)(表1)。

A：空白對照組；B：模型對照組；C：干細胞移植組圖2 不同組別小鼠30 d亞組子宮大體形態(tài)圖

表1 不同組別不同時間點子宮內(nèi)膜厚度分析[μm，(-±s)]

四、子宮內(nèi)膜形態(tài)學分析

隨著近年來的經(jīng)濟社會發(fā)展，基層農(nóng)村在農(nóng)業(yè)建設和農(nóng)業(yè)開發(fā)領域取得了令人矚目的成就，農(nóng)業(yè)機械化進程也在不斷推進。但由于各地農(nóng)業(yè)發(fā)展基礎不一，與全面實現(xiàn)農(nóng)業(yè)機械化和現(xiàn)代化建設還有差距，特別是當前基層農(nóng)機的管理服務上，還無法實現(xiàn)全面保障服務，影響了部分地區(qū)的農(nóng)業(yè)效率和農(nóng)業(yè)發(fā)展步伐，面對當前農(nóng)業(yè)發(fā)展的必然要求，必須要扎實解決好基層農(nóng)機綜合管理服務問題，確保農(nóng)業(yè)生產(chǎn)有效進行，發(fā)揮農(nóng)業(yè)機械化發(fā)展的現(xiàn)實優(yōu)勢，促進我國從農(nóng)業(yè)大國向農(nóng)業(yè)強國的邁進。

空白對照組子宮內(nèi)膜較厚，上皮層細胞圓潤飽滿，基質(zhì)層細胞均勻分布，各時間點內(nèi)膜層、基質(zhì)層厚度均無明顯差異(圖3A1～4)。模型對照組子宮損傷明顯，上皮細胞扁平，內(nèi)膜層、基質(zhì)層均見明顯變薄，隨時間延長自身修復不明顯；14～30 d纖維化程度逐漸嚴重，比例增多(圖3B1～4)。干細胞移植組3 d時子宮內(nèi)膜有了輕微改善，上皮面出現(xiàn)弧度；7 d時上皮層及基質(zhì)層厚度均增加，至30 d子宮內(nèi)膜逐漸增厚，內(nèi)膜層、基質(zhì)層均可見明顯修復，但與正常對照組相比，仍有一定差距(圖3C1～4)。

A：空白對照組；B：模型對照組；C：干細胞移植組；1～4分別示取材時間點3 d、7 d、14 d、30 d圖3 不同組別小鼠子宮組織形態(tài)(HE染色 ×40)

高倍率圖片顯示各組30 d的子宮組織形態(tài)(圖4)?？汕逦吹娇瞻讓φ战M上皮層完整，上皮面弧度多樣，腺體豐富；而模型對照組均為實質(zhì)性細胞，無明顯上皮基質(zhì)區(qū)分，腺體幾乎不可見；干細胞移植組細胞密度略低于空白對照組，但上皮細胞體積增大，柱狀緊密排列，腺體增加，相比模型對照組有明顯改善。

A：空白對照組；B：模型對照組；C：干細胞移植組；箭頭示子宮內(nèi)膜上皮層，五角星示腺體增加圖4 不同組別小鼠30 d亞組子宮組織形態(tài)(HE染色 ×200)

五、免疫組化數(shù)據(jù)分析及圖片觀察

參照小鼠薄型子宮內(nèi)膜模型建立[10-11]指標選取相關于子宮內(nèi)膜再生的分子標記物進行評估，包括角蛋白(CK)、波形蛋白(Vim)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、雌激素受體(ERα)。

空白對照組的各個時間點CK、Vim、VEGF、ERα表達均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；模型對照組組內(nèi)不同時間點，CK表達無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，而30 d時Vim、VEGF、ERα 均與3 d組有統(tǒng)計學差異(P<0.05)?？梢婋S時間延長，子宮內(nèi)膜有一定自我修復，但對于損傷至基底層的模型而言，修復效果甚微；干細胞移植組隨時間延長各組數(shù)據(jù)均在逐漸改善，3 d與7 d、7 d與14 d、14 d與30 d比較發(fā)現(xiàn)，各組表達均具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。其中CK、Vim、ERα表達在7 d至14 d組差異最為明顯，VEGF表達則在14 d至30 d組達到最大差異(表2、圖5)。

組間比較發(fā)現(xiàn)，同一時間點模型對照組各檢測指標均顯著低于空白對照組(P<0.05)，且7 d、14 d、30 d三個時間點各檢測指標均顯著低于干細胞移植組(P<0.05)；干細胞移植組各檢測指標與同時間點空白對照組相比，同樣具有顯著差異(P<0.05)。由此可見，干細胞移植后的子宮內(nèi)膜狀態(tài)雖與空白對照組子宮的完好生理狀態(tài)有一定差距，但對子宮內(nèi)膜的損傷后修復亦有明顯作用(表2、圖5)

表2 不同組別小鼠子宮內(nèi)膜再生相關分子表達結(jié)果比較[(-±s)，n=12)

A：空白對照組；B：模型對照組；C：干細胞移植組圖5 不同組別小鼠處理后30 d子宮內(nèi)膜組織再生相關分子的表達(免疫組化染色 ×200)

六、生育力評估

子宮內(nèi)膜的厚度是子宮形態(tài)是否正常的一個重要指標，但只有懷孕并娩出才真正意味著生育力的修復[12]。本實驗中，模型對照組懷孕率接近為0，僅30 d組懷孕一例；干細胞移植組隨時間延長，懷孕率逐漸增加，30 d后最終懷孕率達50%，與空白對照組的66.7%雖還有一定差距，但也明顯高于模型對照組，足以證明干細胞對薄型子宮內(nèi)膜的修復具有一定效果(表3)。

表3 各組小鼠妊娠情況[n(%)]

討 論

近年來，隨著干細胞技術的大力發(fā)展及再生醫(yī)學的興起，干細胞對各種疾病的治療研究也越來越多，幾乎遍布全身各大組織系統(tǒng)[13]。例如慢性腎臟病[14]、變應性鼻炎[15]、糖尿病輔助治療[16]、支氣管胸膜瘺[17]、骨關節(jié)炎[18]等，都取得了不同程度的進展。在子宮損傷修復領域，干細胞的探索也獲得了眾多成果[19]。研究顯示，對薄型子宮內(nèi)膜進行不同來源的干細胞移植，出現(xiàn)不同程度的子宮內(nèi)膜增厚、腺體增加、血管再生，懷孕率上升等[20]。目前針對干細胞對薄型子宮可能的的修復機制尚不明確，主要包括細胞遷移、再生、分化、免疫調(diào)節(jié)、旁分泌作用等多種認知。傳統(tǒng)的研究認為，干細胞有著相當高的增殖能力及多方向分化潛能，因此對子宮內(nèi)膜的再生主要體現(xiàn)在干細胞移植后的增殖和分化。研究發(fā)現(xiàn)來源于雄鼠的骨髓間充質(zhì)干細胞移植進入雌鼠體內(nèi)后，可被誘導分化為子宮內(nèi)膜細胞，并形成子宮內(nèi)膜組織，使得懷孕率明顯提高[21]。然而另外的研究發(fā)現(xiàn)，在移植干細胞并得到修復的受損子宮中，僅能檢測到低于0.01%干細胞存在，提示干細胞的移植數(shù)量及體內(nèi)增殖可能并不是修復的主要手段[3]。Santamaria等[22]將自體來源的CD133+骨髓間充質(zhì)干細胞移植至子宮受損患者體內(nèi)，通過對術后6個月的子宮內(nèi)膜厚度、宮腔粘附狀態(tài)、血管再生及懷孕狀態(tài)評估，所有患者的子宮狀態(tài)均得到良好改善，半數(shù)患者甚至恢復到受損前狀態(tài)，多名患者自然受孕，胚胎移植成功率高達50%。王燕華等[23]將帶EGFP標記的小鼠胚胎干細胞移植至受損的小鼠子宮，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胚胎干細胞定植于損傷側(cè)子宮，后續(xù)子宮形態(tài)恢復較好，且嚴重纖維化發(fā)生例數(shù)減少，但存在成瘤風險。Corradetti等[24]研究發(fā)現(xiàn)來源于羊膜的間充質(zhì)干細胞與子宮來源的細胞擁有大量重疊的基因表達譜，而且體外共培養(yǎng)時，子宮來源的間質(zhì)細胞增殖速度明顯增加。Xu等[25]注射復合膠原支架的臍帶間充質(zhì)干細胞于已建立好的大鼠子宮瘢痕模型中，實驗發(fā)現(xiàn)復合移植組有明顯的膠原降解，修復后妊娠率也明顯高于對照組。然而，細胞來源不同，移植方式不同，細胞的歸巢效率是不一樣的，干細胞歸巢是其發(fā)揮修復作用的重要前提[26]。因此選擇合適的細胞來源、恰當?shù)囊浦矔r機、移植位置、移植劑量都非常重要。子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞存在于基底層與肌層的連接處，不僅擁有干細胞共有的高效增殖速率和多能分化特性，且獲得方式較為容易，無倫理學困擾，獨有的定位優(yōu)勢和低免疫原性也使之成為子宮組織損傷修復當仁不讓的首選。

本實驗選擇實驗室已培養(yǎng)鑒定好的小鼠子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞的第五代進行干細胞移植，PBS注射作為模型對照組?？紤]到開腹手術對鼠體本身健康的傷害，本實驗選擇將懸浮好的子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞于損傷當時移植進入受損子宮，對其進行修復，并在術后第3天通過尾靜脈再次注射干細胞，以期增加歸巢干細胞數(shù)，提高修復效果。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干細胞移植組子宮內(nèi)膜厚度明顯增加，上皮細胞及基質(zhì)細胞形態(tài)逐漸恢復，數(shù)量增多，腺體豐富。同時，我們選擇免疫組化檢測CK、Vim、VEGF、ERα四種蛋白，通過其表達量的變化來進一步明確修復程度。臨床顯示子宮內(nèi)膜薄通常表現(xiàn)為腺上皮生長緩慢，動脈血流阻力增高[27]。角蛋白作為上皮細胞的標志性蛋白，主要表達于腺上皮和腔上皮細胞[28]。角蛋白的高表達，意味著上皮細胞狀態(tài)良好，形態(tài)完整。因此在子宮內(nèi)膜修復過程中，修復組相比損傷組的角蛋白表達上調(diào)，修復組隨著時間延長角蛋白表達不斷增加，無一不在提示著上皮細胞的良好再生。波形蛋白主要表達于子宮內(nèi)膜的間質(zhì)細胞，對間質(zhì)細胞結(jié)構(gòu)的完整性維持有著非常關鍵的作用[29]。修復組波形蛋白表達上調(diào)，意味著受損子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞的有效增殖。VEGF是血管內(nèi)皮生長因子，在血管通透性的調(diào)整，新生血管的形成和維護過程中發(fā)揮重要作用[30]。子宮內(nèi)膜受損導致動脈血流阻力加大，VEGF的表達下降，而VEGF表達上調(diào)，則意味著血管生成得到改善，血流通暢，最終誘導子宮內(nèi)膜增殖，狀態(tài)改善。通常認為，雌激素受體主要分為ERα和ERβ兩種，其中主要存在于生殖系統(tǒng)中與雌激素作用的受體是ERα，二者相互作用介導下游相關因子轉(zhuǎn)錄從而影響子宮內(nèi)膜的生長發(fā)育[31]。雌激素受體表達的上升或下降，指示著子宮內(nèi)膜的增生與蛻膜化。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，四種蛋白均出現(xiàn)了不同程度的上調(diào)，說明子宮內(nèi)膜確實得到了修復，并且在7 d到14 d中間，出現(xiàn)了較高的增長，是一個非常有意義的指征。

本實驗結(jié)果預后較好，干細胞移植組雖然與空白對照組相比尚有差距，但相對模型對照組來說，已有了明確的改善。但本研究沒有對干細胞進行標記，從而進一步跟蹤子宮間充質(zhì)干細胞進入體內(nèi)的歸巢情況，進而探索子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞修復的機制，是本實驗的局限。希望通過后續(xù)對本實驗的進一步完善及深入，明確修復機理，進一步提升修復效果，為臨床子宮內(nèi)膜干細胞的使用及薄型子宮的治療打下夯實的基礎。