SPE-GC-MS/MS法測定茶葉中的76種農(nóng)藥殘留

陳昌梅，林明霞，蘭元

福建省茶葉質(zhì)量檢測與技術(shù)推廣中心 黃財標(biāo)技能大師工作室，福建 福州350001

福建是我國茶葉種植、生產(chǎn)和進(jìn)出口貿(mào)易大省，茶葉品類多，六大茶類中的烏龍茶、紅茶、白茶、綠茶以及再加工茶類茉莉花茶均在福建茶區(qū)較大規(guī)模種植和生產(chǎn)。福建茶區(qū)的茶葉品質(zhì)優(yōu)良，飲茶文化盛行，人們對茶葉衛(wèi)生質(zhì)量和安全也格外關(guān)注，其中關(guān)注度最高的是農(nóng)藥殘留[1]。2019年8月15日，國家市場監(jiān)督管理總局、國家衛(wèi)生健康委員會和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部聯(lián)合發(fā)布了《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763—2019）[2]，其中涉及茶葉的限量有65項，標(biāo)準(zhǔn)中對除特丁硫磷、丁醚脲、草銨膦和氯噻啉等4項農(nóng)藥組分外的61項推薦了26個檢測方法標(biāo)準(zhǔn)，這些檢測方法標(biāo)準(zhǔn)大多為農(nóng)藥多殘留檢測方法。

近年來，越來越多的學(xué)者針對茶葉中農(nóng)藥多殘留的檢測技術(shù)進(jìn)行探索研究[3-4]，氣相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS/MS）因具有選擇性高、靈敏度高、定性準(zhǔn)確性高和抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)勢越來越受青睞[5-7]。因茶葉中含有數(shù)百種化學(xué)成分、基質(zhì)相對復(fù)雜，對茶葉中的農(nóng)藥殘留進(jìn)行檢測時，容易受到基質(zhì)干擾。因此，前處理方法的選擇尤為重要。QuEChERS 前處理技術(shù)具有簡便快速的優(yōu)點，但鑒于茶葉基質(zhì)的復(fù)雜性，固相萃取法（SPE）對茶葉樣品的凈化更為完全，回收率也高。本文以福建省內(nèi)生產(chǎn)的綠茶、白茶、烏龍茶及紅茶等四大茶類（再加工茶類茉莉花茶的茶坯為綠茶）為研究對象，提供了一種基于SPE技術(shù)的可靠、簡便的GC-MS/MS 檢測方法，對GB 2763—2019標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的使用氣相色譜儀、氣相質(zhì)譜儀及氣相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測的39種農(nóng)殘項目，以及其他農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)定的茶園禁用的農(nóng)藥項目同時進(jìn)行定性篩查和準(zhǔn)確定量檢測。

一、材料與方法

1.試驗材料

（1）試劑

乙腈（色譜純，購自美國Merck公司）；甲苯（色譜純，購自上海安譜有限公司）；丙酮（色譜純，購自美國TEDIA 公司）；氯化鈉（優(yōu)級純，購自天津科密歐化學(xué)試劑廠）；無水硫酸鎂（優(yōu)級純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；實驗用水為超純水機(jī)制得的一級水。

（2）材料

固相萃取柱：石墨化炭黑-氨基復(fù)合柱（購自島津上海實驗器材有限公司，貨號5010-81804），微孔濾膜（有機(jī)相，尼龍）：13 mm × 0.22 μm，2 mL的一次性針筒。

（3）標(biāo)準(zhǔn)品

環(huán)氧七氯B 內(nèi)標(biāo)和其他農(nóng)藥及代謝物標(biāo)準(zhǔn)品均購自農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所和北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司。

2.儀器設(shè)備

三重四級桿氣相色譜儀-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀TQ-8050 （日本島津公司），配有電子轟擊源（EI）；高速粉碎儀（A11，德國IKA）；渦旋振蕩儀（VORTEX 3， 德 國IKA）； 旋 轉(zhuǎn) 蒸 發(fā) 儀（RV 10，德國IKA）；低速離心機(jī)（SC-3610，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；全自動氮吹儀（美國Turbo Vap Ⅱ）；電子天平（BS-224S，德國Sartorius）。

3.試驗方法

（1）溶液配制

乙腈-甲苯溶液：量取100 mL 甲苯和300 mL乙腈置于500 mL儲液瓶中，混勻。

內(nèi)標(biāo)溶液：將購置的100 mg/L 內(nèi)標(biāo)儲備液用丙酮稀釋至5 mg/L作為內(nèi)標(biāo)溶液，冷藏備用。

混合農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)中間液：將購置的100 mg/L各農(nóng)藥及代謝物儲備液移入2 mL 棕色瓶中避光0～4 ℃保存，配制中間液時吸取六六六、滴滴涕和聯(lián)苯菊酯各50 μL，其余組分各100 μL 置于10 mL 的棕色容量瓶中，用丙酮定容至刻度，混合均勻后移入20 mL 棕色儲液瓶中，避光0～4 ℃保存。

基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：將1 mL空白基質(zhì)溶液置于40 ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，加入20 μL 內(nèi)標(biāo)溶液，再加入1 mL上述中間液稀釋成相應(yīng)濃度的混合農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)工作液復(fù)溶，過微孔濾膜，裝入加有0.5 mL內(nèi)插管的棕色樣品瓶，現(xiàn)配現(xiàn)用。

基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液的配制：用基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液配制一系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液2 μg/L、5 μg/L、10 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L、500 μg/L，并加入20 μL 內(nèi)標(biāo)溶液，其中六六六、滴滴涕和聯(lián)苯菊酯組分在儀器上具有較高的響應(yīng)，配制成相應(yīng)較低的濃度系列0.5 μg/L、1.25 μg/L、2.5μg/L、5 μg/L、12.5 μg/L、25 μg/L、50 μg/L、125 μg/L。

經(jīng)GC-MS/MS 測定，以農(nóng)藥定量離子峰面積與內(nèi)標(biāo)定量離子峰面積的比值為縱坐標(biāo)（Y）、農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與內(nèi)標(biāo)濃度的比值為橫坐標(biāo)（X）線性擬合，得到各農(nóng)藥組分的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

（2）試樣制備

用四分法分取茶樣250 g，用高速粉碎儀粉碎，直至全部過425 目的篩網(wǎng)，混勻后于密封袋中保存待測。

（3）樣品前處理

提?。悍Q取上述茶樣粉末2.00 g（精確至0.01 g）于50 mL 塑料離心管中，加4 mL 水渦旋混勻，于4 ℃冷藏冰箱靜置30 min。加入8 mL 乙腈，用渦旋振蕩儀渦旋提取5 min，加入2.0～2.5 g氯化鈉劇烈渦旋1 min，冰浴超聲振蕩5 min 后5 000 r/min離心5 min，上清液即提取液，待凈化。

凈化：在固相萃取柱中加入約1 cm 高的無水硫酸鎂，用5 mL乙腈-甲苯預(yù)洗固相萃取柱，棄去流出液，待液面接近填料，關(guān)閉控制閥，接入100 mL茄形瓶，準(zhǔn)確移取茶樣提取液2 mL于固相萃取柱中，在柱上安裝25 mL 儲液器，待液面接近填料，加入10 mL 乙腈-甲苯溶液淋洗小柱，收集所有流出液于40 ℃水浴旋轉(zhuǎn)濃縮至近干，加入20 μL內(nèi)標(biāo)溶液，1.0 mL 丙酮渦旋振蕩復(fù)溶，過微孔濾膜，上機(jī)檢測。

（4）測定參數(shù)

氣相色譜條件：色譜柱Agilent DB-5ms（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）；載氣為氦氣（≥99.999%），流速1.65 mL/min；進(jìn)樣口溫度250 ℃，進(jìn)樣量1.0 μL，不分流進(jìn)樣；柱溫50 ℃保持1 min，以25 ℃/min 的速率升至125 ℃，再以10 ℃/min的速率升至300 ℃，保持13.5 min。

質(zhì)譜條件：離子源溫度200 ℃，接口溫度280 ℃，溶劑延遲時間3 min，檢測器電壓為相對于調(diào)諧結(jié)果+0.5 kV。多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式：每種農(nóng)藥分別選擇1 對定量離子、1 ～2 對定性離子。

特征離子的選擇：在氣相色譜條件下，質(zhì)譜采用Q3 Scan 模式在45～500 m/z 范圍內(nèi)對農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全掃描，對照美國技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)研究院（NIST）譜庫識別各農(nóng)藥組分，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行產(chǎn)物離子掃描，并優(yōu)化碰撞電壓，將優(yōu)化結(jié)果注冊到島津SmartDatebase 數(shù)據(jù)庫中，選擇響應(yīng)較高的離子依次作為定量和定性離子，由此建立MRM檢測方法。

每種農(nóng)藥的保留時間、定量定性離子對和碰撞電壓見表1。

（5）基質(zhì)效應(yīng)試驗

購買市售有機(jī)紅茶、有機(jī)烏龍茶、有機(jī)綠茶和有機(jī)白茶樣品，分別按照樣品前處理過程進(jìn)行處理后上機(jī)檢測，在儀器參考條件下，4種茶樣在農(nóng)藥組分出峰處均未檢出，故選擇這4 種茶葉混合樣品作為茶葉空白基質(zhì)。

由于茶葉中復(fù)雜成分可能會對儀器的進(jìn)樣口、檢測器等產(chǎn)生干擾，從而影響方法的檢出限和靈敏度[8]，因此，為考察茶葉基質(zhì)對測定結(jié)果的影響，分別以丙酮和上述茶葉空白基質(zhì)溶液按5%、10%、30%、50%、100%的比例稀釋為10 μg/L、50 μg/L、200 μg/L 系列農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液，上機(jī)測定。

表1 農(nóng)藥的保留時間、定量定性離子對和碰撞電壓

續(xù)表1

二、結(jié)果與分析

1.基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)常常對分析物的分析過程有顯著的干擾，并影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，復(fù)雜的茶樣基質(zhì)對不同的農(nóng)藥組分表現(xiàn)出不同程度的增強(qiáng)或抑制效應(yīng)，部分農(nóng)藥組分如樂果、西瑪津、莠去津在基質(zhì)比例為30%時峰面積就達(dá)到峰值并隨著基質(zhì)比例的增加保持穩(wěn)定，部分農(nóng)藥組分如五氯硝基苯、噻螨酮、對硫磷隨著基質(zhì)比例的增加峰面積不斷增加，直至全基質(zhì)（100%比例）時達(dá)到峰值。

按照公式基質(zhì)效應(yīng)（%） =（A2-A1）/ A1×100[8]計算基質(zhì)效應(yīng)，其中A1為丙酮溶液中農(nóng)藥的峰響應(yīng)，A2為茶葉空白基質(zhì)溶液中農(nóng)藥的峰響應(yīng)，得到農(nóng)藥組分受基質(zhì)影響的總體情況見圖1。從圖1可見，使用純?nèi)軇┡渲频臉?biāo)準(zhǔn)曲線不能準(zhǔn)確地對樣品中農(nóng)藥組分進(jìn)行定量，因此，本研究選擇茶葉空白全基質(zhì)配制的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行定量分析。

圖1 農(nóng)藥組分受基質(zhì)影響情況分布圖

2. 線性關(guān)系和檢出限、定量限

各農(nóng)藥組分在相應(yīng)線性范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.994 4～0.999 9（表2），滿足分析測定要求。以3倍信噪比（S/N=3）和10倍信噪比（S/N=10） 分別作為方法的檢出限（LOD）和定量限（LOQ），結(jié)果（表2）表明本方法具有較高的檢測靈敏度。

表2 各農(nóng)藥組分線性相關(guān)系數(shù)、檢出限（S/N=3）與定量限（S/N=10）

續(xù)表2

3.回收率與精密度實驗

為考察檢測方法的準(zhǔn)確度與精密度，對茶葉空白基質(zhì)分別進(jìn)行0.05 mg/kg、0.10 mg/kg、0.50 mg/kg 3個水平的加標(biāo)實驗，加標(biāo)回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）見表3。結(jié)果顯示，除甲胺磷、乙酰甲胺磷外，茶葉樣品3 個水平的農(nóng)藥加標(biāo) 回 收 率 分 別 為82.7% ～119.5% 、 78.6% ～114.2%、80.4%～109.3%，并且精密度滿足檢測方法的要求。茶葉空白基質(zhì)、基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品加標(biāo)回收色譜圖如圖2。

表3 加標(biāo)回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

續(xù)表3

續(xù)表3

圖2 總離子色譜圖

4.實際茶葉樣品的檢測

應(yīng)用本文所建立的方法對100 份茶葉樣品（7份綠茶、56份白茶、15份烏龍茶、22份紅茶）進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，所有檢出農(nóng)藥組分的濃度范圍均未超出《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763—2019）所規(guī)定的限量值，供試茶葉樣品中其他農(nóng)藥組分均未檢出，合格率為100%（表4）。

表4 實際樣品農(nóng)殘檢出情況一覽表

三、小結(jié)與討論

本研究建立了茶葉樣品中76 種農(nóng)藥組分的檢測方法，該方法采用固相萃取凈化技術(shù)，不需進(jìn)行耗時耗試劑的均質(zhì)提取，僅需1 次蒸發(fā)濃縮，靈敏度高，準(zhǔn)確度與精密度好，能夠滿足茶葉基質(zhì)中多種農(nóng)藥組分的痕量檢測，可作為GB 2763—2019 中針對茶葉提出的部分使用氣相色譜或氣質(zhì)聯(lián)用方法的檢測項目和其他農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)定的茶園禁用農(nóng)藥提供一種準(zhǔn)確可靠、簡便快捷的檢測方法，具有實際的參考應(yīng)用價值。對于甲胺磷、乙酰甲胺磷等極性較強(qiáng)的有機(jī)磷類農(nóng)藥，采用本方法選擇的色譜柱檢測會受基質(zhì)干擾而影響分離，導(dǎo)致二者的加標(biāo)回收率偏低，對此可在今后的研究中進(jìn)一步改進(jìn)。