基于GEO數(shù)據(jù)庫探究RACGAP1表達(dá)與膀胱癌患者臨床病理和預(yù)后的關(guān)系

張文杰 熊巧華 陳思超 朱家永 張冉 翁鴻 曾憲濤

膀胱癌是全球第十二位常見的惡性腫瘤，同時(shí)也是泌尿系統(tǒng)第一常見的惡性腫瘤[1]。在我國(guó)，膀胱癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)發(fā)病率第二高的腫瘤，居男性惡性腫瘤第七位，近年來隨著我國(guó)人口結(jié)構(gòu)與生活習(xí)慣的變化，膀胱癌的發(fā)病率也不斷升高[2]。目前治療非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌的主要手段是行經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)輔以術(shù)后輔助治療，肌層浸潤(rùn)性膀胱癌主要是行根治性膀胱切除術(shù)。術(shù)后輔助治療主要包括化療和免疫治療[3]，不良反應(yīng)均較多，且高?；颊咝g(shù)后前2年每3個(gè)月需行1次膀胱鏡檢查，增加了患者痛苦及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，膀胱癌的標(biāo)志物和潛在靶點(diǎn)研究極為重要。

Ras同源物家族鳥苷三磷酸(GTP)酶是一組分子量為20～25 kD的小分子GTP結(jié)合蛋白，具有GTP酶的活性，以及調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、存活、運(yùn)動(dòng)、黏附及分化等多種細(xì)胞功能[4]。Rac GTP酶活性蛋白1(Rac GTPase activating protein 1, RACGAP1)是GTP酶活性蛋白家族的一員，其基因位于染色體12q13內(nèi)，可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、胞質(zhì)分裂、細(xì)胞分化及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，作為細(xì)胞增殖的標(biāo)志物在細(xì)胞分裂、增殖的過程中起重要作用[4-6]。近年來對(duì)RACGAP1在腫瘤相關(guān)領(lǐng)域研究的報(bào)道不斷增多，該基因現(xiàn)已被證實(shí)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，如乳腺癌[7]、胃癌[8]、前列腺癌[9]等。但極少有關(guān)于RACGAP1表達(dá)與膀胱癌臨床病理參數(shù)及預(yù)后關(guān)系方面的報(bào)道。有鑒于此，本研究經(jīng)篩選后選取基因表達(dá)匯編(Gene Expression Omnibus, GEO)數(shù)據(jù)庫中膀胱癌在線數(shù)據(jù)集，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，并對(duì)RACGAP1表達(dá)與膀胱癌患者臨床病理和預(yù)后的關(guān)系展開研究，進(jìn)一步探究其對(duì)膀胱癌的可能作用機(jī)制。

對(duì)象與方法

一、一般資料

從NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中下載表達(dá)譜數(shù)據(jù)集GSE13507(非配對(duì)樣本，其中原發(fā)性膀胱癌165例、正常組織樣本68例，均為韓國(guó)人群數(shù)據(jù))，并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。采用Illumina公司的人類表達(dá)芯片(Illumina human-6 v2.0 expression beadchip)GPL6102對(duì)GSE13507進(jìn)行注釋(RACGAP1基因?qū)?yīng)的探針為ILMN_1702140)。同時(shí)下載臨床病理數(shù)據(jù)集，包含165例原發(fā)性膀胱癌患者的性別、年齡、腫瘤侵襲性、T分期、N分期、M分期、分級(jí)(WHO 2004分級(jí)法)及復(fù)發(fā)進(jìn)展情況。165例膀胱癌患者的一般資料見表1。

二、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)正常組織與膀胱癌組織中RACGAP1表達(dá)水平行t檢驗(yàn)，分析其差異性。同時(shí)為探究RACGAP1表達(dá)水平與臨床病理特征和復(fù)發(fā)進(jìn)展的關(guān)系，行卡方檢驗(yàn)。去除臨床信息缺失的樣本后，進(jìn)行預(yù)后分析。依據(jù)基因表達(dá)譜的數(shù)據(jù)，將數(shù)據(jù)集GSE13507中的165例原發(fā)性膀胱癌患者樣本按RACGAP1的表達(dá)量由低到高排序，以中位值為界值將樣本分為低表達(dá)組(<中位值)和高表達(dá)組(≥中位值)。對(duì)RACGAP1表達(dá)與臨床病理特征進(jìn)行單因素、多因素Logistic回歸分析，分析RACGAP1表達(dá)的危險(xiǎn)因素。采用Kaplan-Meier法行Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行生存分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用GSEA 3.0版本對(duì)樣本數(shù)據(jù)集GSE13507中的膀胱癌組織樣本進(jìn)行基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis， GSEA) 。選取GSEA網(wǎng)站msigdb數(shù)據(jù)庫中內(nèi)置的hallmark gene sets數(shù)據(jù)集(http://software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp)為參照基因集，對(duì)該樣本數(shù)據(jù)集按照默認(rèn)加權(quán)富集統(tǒng)計(jì)的方法進(jìn)行分析，每次分析重復(fù)1 000次。以P<0.05及錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率<0.05的基因集作為顯著富集基因集。

結(jié) 果

一、RACGAP1的表達(dá)情況

對(duì)樣本數(shù)據(jù)集GSE13507中的基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示正常膀胱組織中RACGAP1水平為7.557±0.020，低于膀胱癌組織(7.790±0.028)，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；膀胱癌組織中RACGAP1水平的中位值為7.700，以此為界值分組，165例膀胱癌患者中82例為低表達(dá)組，83例為高表達(dá)組。

二、RACGAP1表達(dá)與膀胱癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

在膀胱癌樣本數(shù)據(jù)集GSE13507中，卡方檢驗(yàn)結(jié)果顯示膀胱癌組織中RACGAP1表達(dá)水平與患者性別、腫瘤M分期和進(jìn)展無關(guān)(P>0.05)，但與患者年齡、腫瘤侵襲性、T分期、N分期、分級(jí)和復(fù)發(fā)有關(guān)(P<0.05)，見表1。單因素、多因素Logistic回歸分析結(jié)果表明，患者年齡及腫瘤分級(jí)為RACGAP1表達(dá)的危險(xiǎn)因素，見表2。RACGAP1低表達(dá)患者的平均年齡為(61.87±13.14)歲，RACGAP1高表達(dá)患者的平均年齡為(68.46±9.71)歲，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

表1 RACGAP1表達(dá)水平與膀胱癌臨床病理特征的關(guān)系

表2 RACGAP1表達(dá)的危險(xiǎn)因素

三、RACGAP1與膀胱癌預(yù)后的關(guān)系

生存分析結(jié)果顯示在膀胱癌樣本數(shù)據(jù)集GSE13507中，RACGAP1高表達(dá)組和低表達(dá)組的5年總生存率分別為56.6%和73.9%(HR=0.473 1，95%CI：0.291 2～0.768 8，P=0.002 5)，5年腫瘤特異性生存率分別為70.9%和91.6%(HR=0.334 6，95%CI：0.166 4～0.672 9，P=0.000 5)，5年無復(fù)發(fā)生存率分別為76.7%和85.9%(HR=0.470 4，95%CI：0.224 4～0.986 0，P=0.045 8)，RACGAP1低表達(dá)組的預(yù)后生存顯著優(yōu)于高表達(dá)組，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1。

A：總生存率；B：腫瘤特異性生存率；C：無復(fù)發(fā)生存率圖1 膀胱癌組織中RACGAP1不同表達(dá)水平的生存曲線

四、RACGAP1高表達(dá)組的GSEA分析

為進(jìn)一步研究膀胱癌樣本數(shù)據(jù)集GSE13507中RACGAP1可能的作用機(jī)制，對(duì)RACGAP1表達(dá)水平與各種生物通路基因集的富集關(guān)系進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示RACGAP1高表達(dá)樣本富集了MYC信號(hào)通路、精子發(fā)生、未折疊蛋白反應(yīng)、G2M檢查點(diǎn)、E2F轉(zhuǎn)錄因子、MTORC1信號(hào)、有絲分裂紡錘體、PI3K/AKT/mTOR途徑和DNA修復(fù)相關(guān)的基因集。提示RACGAP1可能通過上述信號(hào)通路參與膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展。見表3。

表3 RACGAP1高表達(dá)的膀胱癌樣本GSEA分析

討 論

RACGAP1通過調(diào)節(jié)GTP酶活性，在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、細(xì)胞遷移和新陳代謝等生命活動(dòng)中起重要的作用[6-9]。RACGAP1在細(xì)胞分裂間期位于細(xì)胞核內(nèi)，與Rac1相互作用，并參與激活NADPH氧化酶，影響分裂期的物質(zhì)合成準(zhǔn)備[10-13]。細(xì)胞分裂中期，RACGAP1與微管骨架綁定遷移到有絲分裂紡錘體，作為支架蛋白因子參與細(xì)胞分裂[13]。RACGAP1在細(xì)胞分裂后期和末期移位至中央?yún)^(qū)，后在胞質(zhì)分裂期濃縮至中間體[13-14]。

研究顯示在人體細(xì)胞中RACGAP1與KIF23相互作用，共同促進(jìn)中央紡錘體蛋白復(fù)合體的形成，進(jìn)而調(diào)節(jié)胞質(zhì)分裂過程[10-11]。此外RACGAP1也與多條炎性通道有關(guān)，對(duì)組織細(xì)胞造成損傷[13]。RACGAP1連同ANLN、ECT2、AURKB8、PRC1和KIF23(MKLP1)這些胞質(zhì)分裂相關(guān)的群集基因，共同調(diào)控細(xì)胞增殖分化[10-11]。RACGAP1可以通過調(diào)節(jié)GTP-Rac1的水平來調(diào)節(jié)Rac1、RhoA和Erk蛋白的活化，活化的Rac1、RhoA和Erk蛋白在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲中起重要作用[9,15]。

RACGAP1高表達(dá)癌組織中Rac和cdc42的活性更高，組織細(xì)胞骨架重構(gòu)，細(xì)胞形態(tài)改變，癌組織與周圍正常組織的黏附降低，癌細(xì)胞更易發(fā)生轉(zhuǎn)移[10]。RACGAP1也可作用于AURKB酶，通過使其第387位的絲氨酸發(fā)生磷酸化，致使它的GTP酶作用方向從激活Rac蛋白活性轉(zhuǎn)向?yàn)榧せ頡ho，進(jìn)而導(dǎo)致Rac GTP的增多和Rho GTP的減少，以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[16]。有報(bào)道稱RACGAP1可通過調(diào)節(jié)群集基因，引發(fā)紡錘體的組裝并觸發(fā)分裂溝內(nèi)移，是決定胞質(zhì)分裂能否完成的重要步驟[17]。此外RACGAP1上調(diào)表達(dá)的Rac和cdc42，可以增強(qiáng)癌細(xì)胞的耐藥性[18]。RACGAP1過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致有絲分裂過程出錯(cuò)，引起細(xì)胞周期紊亂，通過調(diào)節(jié)GTP酶的活性影響細(xì)胞代謝，引起異常的胞質(zhì)分裂，導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。在臨床實(shí)踐中，由于RACGAP1在正常組織細(xì)胞中表達(dá)沉默，Rac1處于失活狀態(tài)，而在腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)時(shí)才激活Rac1，RACGAP1抑制劑對(duì)正常組織細(xì)胞是沒有作用的[10]，RACGAP1可作為腫瘤潛在的免疫治療靶點(diǎn)，解決化療藥物耐受的問題，為膀胱癌的治療提供新思路[18]。

本研究利用生物信息學(xué)的方法探究RACGAP1與膀胱癌的關(guān)系，通過對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫中膀胱癌樣本數(shù)據(jù)集GSE13507(165例膀胱癌樣本)的數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)RACGAP1在膀胱癌組織中的表達(dá)顯著高于正常膀胱組織；RACGAP1的表達(dá)與膀胱癌患者的年齡、腫瘤侵襲性、T分期、N分期、腫瘤分級(jí)和復(fù)發(fā)等臨床病理特征在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有相關(guān)性；生存分析結(jié)果顯示RACGAP1高表達(dá)的患者術(shù)后總生存期更短，且腫瘤進(jìn)展更易發(fā)生；GSEA分析提示RACGAP1高表達(dá)的膀胱癌組織具有分裂增殖的潛能，能激活MYC、E2F和MTORC1等腫瘤相關(guān)信號(hào)通路，作用于PI3K/AKT/mTOR途徑，調(diào)控細(xì)胞有絲分裂的過程，阻滯對(duì)損傷DNA的修復(fù)，在膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

Martini等[19]分析了RACGAP1在108例膀胱癌患者組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示RACGAP1表達(dá)與腫瘤分期相關(guān)，與腫瘤分級(jí)、淋巴結(jié)侵犯、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、生存等無相關(guān)性。這可能與選取的研究對(duì)象有關(guān)，本研究群體是亞洲人群，Martini等研究的群體為高加索人群；此外，還可能與樣本量、實(shí)驗(yàn)檢測(cè)等其他因素有關(guān)。

本研究尚存在以下不足：首先,本研究采用的是公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行的數(shù)據(jù)分析，未采用免疫組化等實(shí)驗(yàn)方法開展樣本驗(yàn)證；其次，我們?cè)赥CGA數(shù)據(jù)庫中未能發(fā)現(xiàn)RACGAP1與膀胱癌預(yù)后有關(guān)。因此，本研究結(jié)果尚需進(jìn)一步開展相關(guān)研究加以驗(yàn)證。