高效液相色譜法測定飼料添加劑25-羥基維生素D3 含量的方法研究

趙小陽，虞哲高，張 進，何 雷

（1.中國農業(yè)科學院農業(yè)質量標準與檢測技術研究所，北京 100081；2.帝斯曼（中國）有限公司，上海 201203）

維生素D3是一種具有多種生理功能的類固醇類激素，天然形式的維生素D3不具有生物活性，其活性形式為1α,25-二羥基維生素D3。維生素D3首先在肝臟經25-羥基酶作用下，脫氫生成25-羥基維生素D3，然后在腎臟中經1α羥化酶羥化生成1α,25-二羥基維生素D3[1]。25-羥基維生素D3是維生素D3的第一個代謝產物，也是維生素D3在血液循環(huán)中的主要活性形式，其生物效價是維生素D3的3～5 倍[2]。動物通過采食飼料中的25-羥基維生素D3，吸收后可在血液中獲得25-羥基維生素D3，繞開肝臟的羥化反應，能更有效地轉化成最終生物活性代謝物[3]。在飼料中添加一定量的25-羥基維生素D3，可調節(jié)動物體內的鈣磷平衡，維持骨骼健康，改善免疫功能，調節(jié)能量代謝，并在提高畜禽生產性能、改善畜產品品質方面也有一定作用[2]。歐盟于2005 年批準25-羥基維生素D3作為飼料添加劑用于禽，于2009 年批準了25-羥基維生素D3作為飼料添加劑用于豬。研究表明，在仔豬的耐受性試驗中，仔豬飼糧中添加推薦量5～10 倍的25-羥基維生素D3不影響其生理指標[4]。25-羥基維生素D3是一種安全系數(shù)較高的飼料添加劑[2]，我國農業(yè)部（現(xiàn)為農業(yè)農村部，下同）第2045 號公告中將其列入《飼料添加劑品種目錄（2013）》，準許用于豬和家禽飼料中。2017 年農業(yè)部的2625 號文規(guī)定了25-羥基維生素D3在配合飼料和全混合日糧中的最高限量。近年來，25-羥基維生素D3在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中得到了廣泛應用，除進口25-羥基維生素D3飼料添加劑外，我國目前已有幾家企業(yè)生產該產品，但我國目前尚未有飼料添加劑25-羥基維生素D3產品的行業(yè)標準。本文采用高效液相色譜法測定飼料添加劑25-羥基維生素D3含量，以期為飼料添加劑25-羥基維生素D3的含量測定提供操作簡單、準確可靠的分析方法。

1 材料與方法

1.1 儀器和設備 電子分析天平：感量0.1 mg 和0.01 mg，德國Sartorius 公司；數(shù)顯控溫水浴鍋：精度0.1℃，超聲波水浴清洗器，功率280 W，德國IKA 公司；離心機：12 000 r/min，美國Thermo 公司；高效液相色譜儀：配有紫外可調波長檢測器或二極管矩陣檢測器，美國Agilent 1200。

1.2 試劑和溶液 甲醇：色譜純，購于Fisher Scientific公司；甲醇：國產分析純試劑；水：符合《分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法》（GB/T 6682-2008）標準，一級。80%甲醇溶液：400 mL 甲醇，用水稀釋至500 mL，混勻。25-羥基維生素D3一水化合物對照品（CAS：63283-36-3，純度≥98.0%），購于Dr.Ehrenstorfer 公司。

25-羥基維生素D3標準貯備溶液：稱取25-羥基維生素D3一水化合物對照品25 mg（精確至0.01 mg）于25 mL 的棕色容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度。溶液保存于-20℃冰箱。

25-羥基維生素D3標準工作溶液：準確移取25-羥基維生素D3標準貯備液5.0 mL 于50 mL 的棕色容量瓶中，用80%甲醇溶液定容。臨用時現(xiàn)配。

1.3 方法

1.3.1 25-羥基維生素D3含量的測定

1.3.1.1 試樣溶液的制備 稱取1 g試樣（精確至0.000 1 g），置于100 mL 的棕色容量瓶中。在容量瓶中加入20 mL水，搖勻后在超聲波水浴中超聲處理20 min，用甲醇定容。搖勻后取適量于離心機上，以10 000 r/min 轉速離心5 min，上清液用0.2 μm 濾膜過濾，供高效液相色譜儀分析。

1.3.1.2 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse XDB C18柱，長150 mm，內徑4.6 mm，粒徑5 μm；流動相：甲醇+水=80+20；流速：1 mL/min；檢測波長：265 nm；柱溫：35℃；進樣量：20 μL。

1.3.1.3 轉換系數(shù)F 的測定 在一定溫度下，少量的25-羥基維生素D3會轉化為預25-羥基維生素D3，這一性質與維生素D3的性質有類似之處。在生產、儲存和檢測過程中，飼料添加劑25-羥基維生素D3產品中會有部分的預25-羥基維生素D3由25-羥基維生素D3轉化而來，正如在飼料添加劑維生素D3的產品中，會有部分的預維生素D3存在一樣。在維生素D3產品中，現(xiàn)行的國家標準[5-6]以維生素D3和預維生素D3的含量之和作為產品中維生素D3的總量。在飼料添加劑25-羥基維生素D3產品中，25-羥基維生素D3總量以25-羥基維生素D3和預25-羥基維生素D3的含量之和來表示。由于得不到商品化的預25-羥基維生素D3的標準物質，預25-羥基維生素D3的含量通過轉換系數(shù)F 來計算，計算公式：

具體測定方法及字母代表的含義如下：將1 mL 的25-羥基維生素D3標準工作溶液裝入進樣小瓶，將20 μL的標準工作溶液注入高效液相色譜儀，得到25-羥基維生素D3的色譜峰。測定的25-羥基維生素D3的峰面積記為A。如果在色譜圖中有預25-羥基維生素D3色譜峰，預25-羥基維生素D3的峰面積記為Apre。

取5 mL 的25-羥基維生素D3標準工作溶液倒入具有螺旋瓶蓋的10 mL 螺口試管中，旋緊瓶蓋，置于50℃恒溫水浴中，放置3 h 后取出，冷卻至室溫后將試管內的溶液取1 mL 裝入進樣小瓶，將20 μL 標準工作溶液注入高效液相色譜儀，得到25-羥基維生素D3的色譜峰和預25-羥基維生素D3色譜峰（圖1）。25-羥基維生素D3的峰面積記為A*，預25-羥基維生素D3的峰面積記為Apre*。

1.3.1.4 分析結果的表述 試樣中25-羥基維生素D3的含量計算公式如下：

圖1 25-羥基維生素D3 標準工作溶液經50℃加熱后色譜圖

式中，X1為試樣中25-羥基維生素D3的含量，單位為%；F 為25-羥基維生素D3與預25-羥基維生素D3峰面積的轉換系數(shù)；Aspre為樣品溶液中預25-羥基維生素D3峰面積；As 為樣品溶液中25-羥基維生素D3峰面積；Apre為25-羥基維生素D3標準工作溶液中預25-羥基維生素D3峰面積；A 為25-羥基維生素D3標準工作溶液中25-羥基維生素D3峰面積；C 為25-羥基維生素D3標準工作溶液的濃度，單位為μg/mL；m 為樣品的質量，單位為g。

1.4 方法學驗證

1.4.1 方法的檢測限和定量限 分析方法的檢測限LOD 和定量限LOQ 由信噪比（S/N）計算。LOD 定義為S/N=3時對應的待分析物濃度，LOQ 定義為S/N=10 時對應的待分析物濃度。將25-羥基維生素D3標準溶液用80%甲醇溶液稀釋，當25-羥基維生素D3的濃度為0.18 μg/mL，軟件計算得到的S/N=2.7。按樣品的取樣量及稀釋體積計算，方法的檢測限為0.018 mg/g。當25-羥基維生素D3的濃度為0.52 μg/mL，軟件計算得到的S/N=9.7。按樣品的取樣量及稀釋體積計算，方法的定量限為0.052 mg/g。

1.4.2 方法的線性范圍 取25-羥基維生素D3標準貯備液用80% 甲醇溶液稀釋，配制系列標準工作液，最終濃度分別為3.014、6.028、9.042、18.084、60.280、90.470、150.700 μg/mL。系列標準工作液進樣20 μL，按所述色譜條件測定。結果表明25-羥基維生 素D3在3.0～150.7 μg/mL 濃度范 圍內峰面積（Y）與濃度（X）線性相關性良好?；貧w線性方程為Y=48.8246X+0.7358，線性相關系數(shù)r=1.000。

1.4.3 精密度試驗 按1.3.1 試樣溶液的制備方法，稱取標示量為1.25% 的飼料添加劑25-羥基維生素D3的試樣6 份，按色譜條件檢測樣品的含量，計算其相對標準偏差RSD%。25-羥基維生素D3試樣的6 次測試的含量均值為1.28%（1.26%～1.29%），相對標準偏差（0.91%）小于1%，表明該方法有較好的精密度。

1.4.4 加標回收率試驗 精密稱取約0.4 g 同一批次的飼料添加劑25-羥基維生素D3樣品9 份，置于100 mL 的棕色容量瓶中。該批次樣品的本底值為1.28%。在容量瓶加入20 mL 水，搖勻后在超聲波水浴中超聲處理20 min。將試樣分為3 組，每組3 份。于每組中分別精確加入25-羥基維生素D3的標準貯備溶液（濃度為1.056 mg/mL）2.5、5.0、10.0 mL，在容量瓶中加入50 mL 甲醇，在超聲波水浴中超聲處理20 min 后用甲醇定容至刻度，搖勻后取適量于離心機上，以10 000 r/min 轉速離心5 min，上清液用0.2 μm 濾膜過濾，供高效液相色譜儀分析。從表1 中可以看出，在不同添加水平下，回收率范圍為96.97%～101.23%，平均回收率為98.19%，相對標準偏差為1.9%。

表1 加標回收率的實驗結果

1.4.5 穩(wěn)定性試驗 將配制好的樣品溶液置于棕色的進樣小瓶中，每隔1 h 進樣一次，連續(xù)進樣12 h。試驗結果顯示，12 h 內峰面積變化不大，峰面積的相對標準偏差為0.9%，表明12 h 內，25-羥基維生素D3在避光條件下穩(wěn)定。將樣品溶液置于透明的進樣小瓶內，在光照條件下放置12 h 后測定，發(fā)現(xiàn)25-羥基維生素D3的含量有一定程度的下降，表明25-羥基維生素D3在光照條件下不穩(wěn)定，因此在操作中應注意樣品的避光。

2 結果與分析

2.1 轉換系數(shù)F 如表2 所示，溫度的高低不影響轉換系數(shù)F 值的大小。將標準溶液在90℃水浴中回流45 min和標準溶液在50℃水浴中放置3 h 得到的轉換系數(shù)F 值分別為2.18 和2.21。由于將標準溶液在50℃水浴中放置的操作更簡便，因此在分析方法中采用了標準溶液在50℃水浴中放置3 h 的方法來測定轉換系數(shù)F 值。

表2 轉換系數(shù)F 的測定

2.2 實際樣品的測定 7 個批次飼料添加劑25-羥基維生素D3產品來源于幾家生產商，這7 批次樣品按照1.3.1試樣溶液的制備方法操作，得到樣品溶液中25-羥基維生素D3的濃度不同，但均在測定的線性范圍之內，結果見表3。原因可能在于飼料添加劑25-羥基維生素D3標示量沒有統(tǒng)一規(guī)定，不同生產商會提供不同規(guī)格的產品。

表3 實際樣品的測定結果 %

飼料添加劑25-羥基維生素D3是以化學合成制備法制得的25-羥基維生素D3結晶為原料，配以輔料經噴霧、包被、干燥制成的粉狀產品。在樣品的色譜圖中，除25-羥基維生素D3和預25-羥基維生素D3的色譜峰外，還有其他的色譜峰存在。由于不同生產商所用的原輔料有差異，從7 批次樣品的色譜圖上看，其他峰的種類有差異，如圖2 其他峰種類較少，圖3 其他峰種類較多。

為獲得準確的測試結果，應關注25-羥基維生素D3和預25-羥基維生素D3與其他色譜峰的分離度情況。從圖2 和圖3 可以看出，按照1.3.2 色譜條件推薦的Agilent Eclipse XDB C18 柱，能得到分離度較好的色譜圖。為考察方法的耐用性，嘗試了其他品牌或者類別的C18 色譜柱進行分離。試驗發(fā)現(xiàn)，用Waters Symmetry C18 柱也能得到分離度好的色譜圖。而對于Agilent ZORBAX SB-AQ C18 柱或Waters Atlantic C18柱，在分析樣品時會產生分離度差的問題。

3 結 論

圖2 飼料添加劑25-羥基維生素D3 樣品7 色譜圖

圖3 飼料添加劑25-羥基維生素D3 樣品5 色譜圖

本文建立了用高效液相色譜法測定飼料添加劑25-羥基維生素D3含量的方法，樣品前處理的方法簡單，有較廣的線性范圍，能滿足市場上不同含量產品的測定；精密度和加標回收率表明該方法能滿足分析要求。本方法具有較高的實際應用價值。