豬不同發(fā)育階段腸道微生物菌群特征分析

陳寶劍，吳永紹，覃兆鮮，張 冰，潘天彪，關志惠，陳少梅，吳柱月，謝炳坤

（廣西壯族自治區(qū)畜牧研究所，廣西家畜遺傳改良重點實驗室，廣西南寧 530005）

豬腸道中微生物主要是厭氧菌和兼性厭氧菌，其中厚壁菌門和擬桿菌門占90% 以上，在維護機體健康、提高機體免疫力、營養(yǎng)物質吸收代謝等方面發(fā)揮著重要作用[1]。不同時期豬腸道微生物菌群有顯著差異，胚胎時期腸道處于一種無菌狀態(tài)，分娩過程中受母體產(chǎn)道、糞便以及周圍環(huán)境的影響開始出現(xiàn)微生物，主要以大腸桿菌、葡萄球菌等為主[2]。哺乳期仔豬腸道中的優(yōu)勢菌群主要為乳酸桿菌和鏈球菌，仔豬從哺乳期到斷奶期間，內源性的乳酸菌、厭氧菌群數(shù)量減少，外源性大腸桿菌、沙門菌等致病菌數(shù)量增加[3]。仔豬斷奶后1～3 周內會形成相對穩(wěn)定的微生物群落，此時胃腸道微生物優(yōu)勢菌種為雙歧桿菌[4]。不同飼料營養(yǎng)成分是引起豬腸道微生物變化的重要原因。Peng 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，育肥豬日糧蛋白質水平降低5%能夠提高結腸微生物多樣性；Zhou 等[6]研究發(fā)現(xiàn)，生長豬日糧蛋白質水平降低3%后在屬水平上多種微生物菌群相對豐度差異顯著；Jaworski 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，飼喂高纖維水平飼糧的豬胃腸道微生物活性明顯高于飼喂低纖維水平飼糧。仔豬斷奶2～3 周后腸道微生物結構基本形成，此后生長發(fā)育和日糧改變是引起豬腸道微生物結構持續(xù)變化的主要原因，現(xiàn)代生豬養(yǎng)殖從斷奶到出欄會根據(jù)不同生長階段來提供營養(yǎng)需求，必將引起豬胃腸道微生物結構發(fā)生改變。雖然關于不同階段豬腸道微生物菌群的研究已有很多，但有關豬斷奶后不同生長階段與飼料營養(yǎng)水平改變對豬腸道微生物菌群的影響研究尚未見報道。本研究旨在分析斷奶后不同生長階段和日糧營養(yǎng)水平的變化對腸道微生物菌群的影響，更好的揭示飼糧營養(yǎng)調控在豬不同生長階段對腸道微生物的組成與平衡作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 試驗豬由廣西壯族自治區(qū)畜牧研究所種豬場提供，將50 頭28 日齡體重8 kg 左右的杜× 長×大斷奶仔豬按照體重和性別隨機分為5 欄，根據(jù)不同的生長階段選擇廣西揚翔股份有限公司生產(chǎn)的飼料進行飼喂，其營養(yǎng)成分見表1。分別在第60、90、120、150、180 日齡上午飼喂前，從每欄隨機挑選5 頭豬，每頭采取100 g 左右的新鮮糞樣，-80℃保存。

1.2 血清生化指標檢測 分別在采集糞便的同時，前腔靜脈采血5 mL，3 000 r/min，4℃，離心10 min，吸取血清-80℃保存。利用ELISA 技術測定免疫球蛋白M（IgM）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白A（IgA）、白細胞介素2（IL-2）、白細胞介素6（IL-6）含量，ELISA 試劑盒均購自上海江萊生物科技有限公司。

1.3 腸道微生物測序 提取糞便總DNA，選擇16S rRNA 基因的V4 區(qū)作為擴增和測序的目的區(qū)間，擴增長度為468 bp，擴增引物序列：338F：5'-ACTCCTAC GGGAGGCAGCAG-3'，806R：5'-GGACTACHVGGGT WTCTAAT-3'，將擴增后的片段回收，利用PE300 測序平臺進行測序。

1.4 腸道微生物菌群特征分析

1.4.1 測序數(shù)據(jù)優(yōu)化 MiSeq 測序得到的是雙端序列數(shù)據(jù)，首先根據(jù)PE reads 之間的相互重疊關系，將成對的reads 拼接成一條序列，同時對reads 的質量和拼接的效果進行質控過濾，根據(jù)序列首尾兩端的條形碼和引物序列區(qū)分樣品，得到有效序列，并校正序列方向。

1.4.2 OUT 聚類分析 利用Usearch 平臺vsesion 7.0軟件進行OUT 聚類分析，首先對優(yōu)化后的序列提取非重復序列，并去除沒有重復的單序列，按照97% 相似性對非重復序列進行OTU 聚類，在聚類過程中去除嵌合體，得到OTU 的代表序列，將所有優(yōu)化序列對比至OTU 代表序列，選出與代表序列相似性在97%以上的序列，生成OUT 數(shù)據(jù)。

1.4.3 腸道微生物Beta 多樣性分析 根據(jù)beta 多樣性距離矩陣進行層級聚類分析，使用UPGMA 算法構建樹狀結構，利用Qiime 軟件計算beta 多樣性距離矩陣，然后用R 語言做出樹狀圖，Vegan 軟件包制作NMDS 分析圖。

1.4.4 腸道微生物多樣性指數(shù)分析 分別計算每個單獨樣本的Chao、PD、Ace、Sob 指數(shù)和Coverage 多樣性指數(shù)，通過每個樣本的多樣性指數(shù)分析來反映出整個微生物群落的豐富度、多樣性和覆蓋率，然后對不同組間多樣性指數(shù)進行t檢驗。

1.4.5 腸道微生物物種間差異分析 根據(jù)得到的群落豐度數(shù)據(jù)，運用克氏秩和檢驗，對不同組微生物群落之間的物種進行假設檢驗，評估不同組間物種豐度差異的顯著性水平。

1.4.6 腸道微生物不同分類學水平上的群落組成 利用現(xiàn)有細菌和古菌16S rRNA silva 數(shù)據(jù)庫（Silva（Release128 http://www.arb-silva.de），Greengene（Release 13.5 http://greengenes.secondgenome.com/）；真菌18S rRNA 數(shù)據(jù)庫：Silva（Release128 http://www.arb-silva.de）；真菌ITS數(shù)據(jù)庫：Unite（Release 7.0 http://unite.ut.ee/index.php）對每個OTU 所對應的物種進行分類，采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU 代表序進行分類學分析，并分別在域、門、綱、目、科、屬、種水平上統(tǒng)計每個樣品的群落組成。

1.4.7 腸道微生物多樣性與環(huán)境因子關聯(lián)分析 使用R軟件vegan 包對血清生化指標與腸道差異菌屬關聯(lián)分析。通過計算環(huán)境因子與所選菌屬之間的Sperman 相關系數(shù)，將獲得的數(shù)值矩陣通過Heatmap 圖直觀展示。

1.5 統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)先經(jīng)Excel 統(tǒng)計，利用SPSS 18.0 軟件對不同日齡間血液生化指標進行單因素方差分析，采用 Duncan's 法進行多重比較檢驗，結果用平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 豬不同發(fā)育階段血清生化指標檢測 由表2 可見，隨著仔豬的生長發(fā)育，血清生化指標出現(xiàn)顯著變化，特別是在飼喂的前2 個月內，血液中IL-2、IL-6、IgG、IgM、IgA 濃度與其他階段都差異顯著，此時豬腸道微生物還處于一個不穩(wěn)定的狀態(tài)。IgG 和IgA 在不同時期差異顯著。仔豬在生長過程中，其體內免疫能力也隨著飼料和環(huán)境的變化而改變。

表1 日糧營養(yǎng)成分 %

表2 血清生化指標檢測結果

2.2 腸道微生物DNA 的提取及數(shù)據(jù)篩選 25 個樣本均獲得了質量良好的基因組DNA，同時也擴增出了符合目的片段大小的PCR 產(chǎn)物，測序完成后，對所測數(shù)據(jù)進行質控檢查。由圖1 可以看出，樣本的Shannon 和Sobs 稀釋曲線，當樣品隨機抽取的數(shù)據(jù)量為35 000 左右時，曲線開始趨于平坦，表明取樣深度基本一致，稀釋曲線均達到平臺期，包含了樣本中絕大多數(shù)微生物多樣性的信息。數(shù)據(jù)經(jīng)優(yōu)化整理后，每個處理組的數(shù)據(jù)統(tǒng)計結果（表3）。各組間所獲得的序列條數(shù)及堿基個數(shù)經(jīng)統(tǒng)計學檢驗均差異不顯著，5 個處理組序列長度均集中在421～440 bp（51.64%）和441～460 bp（占48.36%），每個處理組的平均長度同為440 bp。5 個試驗組共獲得1 612 個OUT，其中60 日齡時獲得了947 個、90 日齡時獲得1 169 個、120 日齡時獲得1 133 個、150日齡時獲得1 261 個、180 日齡時獲得1 217 個。由組物種Venn 圖（圖2）所示，5 個試驗組共享了607 個OTU，有4 個試驗組共享了338 個OUT，3 個試驗組共享了230 個OUT，2 個試驗組共享了213 個OUT，60 日齡組有85 個專有OTU，90 日齡組有50 個專有OTU，120 日齡組有16 個專有OUT，150 日齡組有33個專有OTU，180 日齡組有36 個專有OTU。

2.3 腸道微生物NMDS 分析和聚類分析 對5 個試驗組共計25 個樣本進行NMDS 及聚類分析，每個試驗組5個體間的微生物群落組成相似（圖3-A），同一組個體均聚在同一個大的分支上（圖3-B），表明本試驗中所采集的樣品重復性較好，組間菌群差異明顯。

圖1 Shannon（A）和Sobs(B)稀釋曲線分析結果

表3 樣本測序結果統(tǒng)計表

圖2 不同試驗組物種Venn 圖

2.4 豬腸道微生物多樣性分析 通過對每個樣本的Chao、PD、Ace、Sobs 等多樣性指數(shù)的計算，并對不同組間多樣性指數(shù)進行t 檢驗分析（圖4）后發(fā)現(xiàn)，Chao、Ace、Sobs 指數(shù)的變化趨勢基本一致，在60 日齡與其他時間均差異極顯著，說明隨著仔豬的生長，豬腸道微生物多樣性顯著升高，達120 日齡后，豬腸道微生物趨于穩(wěn)定，組間差異變小。全部25 個樣本的覆蓋率均在99%以上，Coverage 指數(shù)隨著仔豬體重的增加而減少，說明隨著仔豬的生長，豬腸道微生物的種類數(shù)有所減少。

圖3 不同樣品NMDS 分析圖及相似度樹狀圖

圖4 Alpha 多樣性指數(shù)分析結果圖

2.5 腸道微生物不同分類學水平上的群落組成 對所有樣本的微生物菌群按照物種豐度進行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，檢測到的腸道微生物共涉及22 個門、42 個綱、74 個目、119 個科、321 個屬和579 個種，5 組樣本主要分布于14 個門，其中厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroides）、螺旋體門（Spirochaetae）為主要優(yōu)勢菌門。在門水平上，厚壁菌門豐度呈先升后降的變化趨勢，從60 日齡的76.22%，在120 日齡上升到91.84%，在180 日齡又降到72.05%。擬桿菌門豐度呈先降后升的變化趨勢，從60日齡的19.47%，在120 日齡降低到5.34%，180 日齡又升到8.46%。螺旋體門（Spirochaetae）所占比例越來越大，從60 日齡的0.21%，180 日齡達到17.82%，采用（One-Way ANOVA）單因素方差分析發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、螺旋體門 （Spirochaetae）、放線菌門 （Actinobacteria）、無壁菌門（Tenericutes）間有顯著差異（表4）。在屬水平上，采用（One-Way ANOVA）單因素方差分析發(fā)現(xiàn)，共有25 個菌屬間存在差異顯著，其中60 日齡普氏菌屬9（Prevotella_9）的相對豐度最高達10.04%，90 日齡鏈球菌屬（Streptococcus）的相對豐度最高達29.85%，120 日齡梭狀芽孢桿菌屬（Clostridium_sensu_stricto_1）的相對豐度最高達20.16%，150 日齡Terrisporobacter的相對豐度最高達19.33%，180 日齡螺旋體2 菌屬（Treponema_2）的相對豐度最高，高達17.49%（表5）。

2.6 豬腸道微生物與環(huán)境因子關聯(lián)分析 選取豐度值前30 的腸道微生物菌群與血液免疫抗體進行相關性分析（表6），發(fā)現(xiàn)IL-2、IL-6、IgG、IgM、IgA 濃度與腸道菌群之間存在顯著的相關性（P＜0.05）。不同時期腸道菌群與血清指標相關性熱圖（圖5）和相關系數(shù)（表7）顯示，與血清IL-2 濃度顯著相關的有12 個菌種（P＜0.05），其中俠義梭狀芽孢桿菌屬（Clostridium_sensu_stricto_1）與血清IL-2 濃度顯著中度正相關，Catenibacterium、Rikenellaceae_RC9_gut_group、norank_f__Bacteroidales_S24-7_group、Roseburia、norank_o__Mollicutes_RF9、unclassified_o__Lactobacillales、Ruminococcaceae_UCG-010、Lachnospiraceae_XPB1014_group、Streptococcus、Ruminococcaceae_UCG-013、Lachnospiraceae_AC2044_group 等10 種菌群 與血清IL-2 濃度顯著中等強度負相關。與血清IL-6 濃度顯著相關的有14 個菌種，其中unclassified_f__Ruminococc aceae、unclassified_o__Lactobacillales 與血清IL-6 濃度顯著中度正相關，unclassified_p__Firmicutes 血清IL-6 濃度顯著較強正相關，[Ruminococcus]_torques_group 與血清IL-6 濃度顯著較強負相關。與血清IgG濃度顯著相關的有12 個菌種，其中Lachnospiraceae_XPB1014_group 與血清IgG 濃度顯著中度正相關，Anaerotruncus 與血清IgG 濃度顯著較強正相關。IgM 與11 個菌群存在顯著相關性，其中norank_f__Bacteroidales_S24-7_group 與血清IgM 濃度顯著中等強度正相關，Ruminococcaceae_NK4A214_group 與血清IgM 濃度顯著中等強度負相關。IgA 與26 個菌群存在顯著相關性，其中Lachnospiraceae_XPB1014_group與血清IgA 濃度顯著較強正相關，norank_f__p-2534-18B5_gut_group、Lachnospiraceae_AC2044_group、Prevotellaceae_NK3B31_group、Ruminococcaceae_NK4A214_group、Coprococcus_3、Holdemanella、[Ruminococcus]_torques_group 與血清IgA 濃度顯著中等強度正相關，Ruminococcus_1、unclassified_f__Lachnospiraceae、Ruminococcaceae_UCG-010 和Streptococcus 與血清IgA 濃度顯著中度負相關。

表4 不同時期門水平上主要菌群

表5 不同時期屬水平上主要菌群

表6 腸道微生物與血液免疫抗體指標RDA 分析結果

圖5 不同時期腸道菌群與血清指標相關性熱圖

表7 不同時期腸道菌群與血清指標相關系數(shù)

3 討 論

哺乳動物從出生到死亡，腸道微生物菌群是一個動態(tài)的變化過程，當外部環(huán)境改變后，腸道內的微生態(tài)的動態(tài)平衡也會隨之改變。豬腸道微生物菌群組成和人類相似，主要包括細菌、古菌、真核微生物，大約有1 000 多種，其中優(yōu)勢菌為乳酸菌等厭氧菌占99% 以上，而需氧菌和兼性厭氧菌只占1% 左右[8-9]。在不同的生長階段，豬腸道的優(yōu)勢菌群主要是厚壁菌門和擬桿菌門，豬腸道優(yōu)勢菌群與自身免疫調控有很大關系，隨著日齡的增長和外部環(huán)境的改變，腸道中優(yōu)勢菌群也相應變化[10]。本研究中，不同日齡的優(yōu)勢菌群也有所不同，雖然在不同日齡時厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroides）和螺旋體門（Spirochaetae）為主要優(yōu)勢菌門，但厚壁菌門、擬桿菌門、螺旋體門中的顯著差異菌屬差異較大。大腸是消化纖維的主要場所，隨著日糧中粗纖維含量增加，Prevotella_9 屬于普氏菌屬（Prevotella），主要參與多糖的降解和氨基酸的代謝，尤其對纖維素的代謝有重要作用[11]。張冬杰等[12]在研究民豬腸道菌群特征時發(fā)現(xiàn)，飼糧中粗纖維的變化能夠引起密螺旋體屬、疣微菌屬、普氏菌屬的變化，郭秀蘭[13]研究發(fā)現(xiàn)密螺旋體菌屬能夠通過對飼料中多糖和膠質進行發(fā)酵，產(chǎn)生短鏈脂肪酸調節(jié)宿主能量平衡，抑制脂肪組織發(fā)育的作用，本研究中180 日齡螺旋體菌屬（Treponema_2）豐度值最高，可能與飼料中粗纖維的含量較高有關。Liu 等[14]研究玉米麥麩對豬腸道微生物及其細胞因子多樣性影響時發(fā)現(xiàn)，適當增加粗纖維可以提高盲腸腸道微生物的多樣性；王鵬[15]研究發(fā)酵玉米秸稈對育肥豬生產(chǎn)性能及盲腸微生物區(qū)系的影響時發(fā)現(xiàn)，隨著纖維含量增加，豬盲腸微生物shannon 指數(shù)呈先增加后降低的趨勢。張奇等[16]研究發(fā)現(xiàn)，日糧中粗纖維增加能夠刺激豬回腸中乳酸菌的生長并產(chǎn)生多種抗菌化合物，抑制其他微生物生長，使豬腸道微生物多樣性降低。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著飼料中粗纖維的比例越來越高，90 日齡時豬腸道微生物shannon 指數(shù)達到最高，隨著日齡的增加腸道微生物趨于穩(wěn)定，豬腸道微生物種的種類數(shù)有所減少。

腸道黏膜是豬體內最大的黏膜免疫器官，SIgA 是腸黏膜細胞內分泌量最多的免疫球蛋白，腸道微生物是腸道黏膜免疫的重要調節(jié)因子[17]。本研究通過環(huán)境因子的關聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，血液中IL_2 濃度與狹義梭狀芽孢桿菌屬（Clostridium_sensu_stricto_1）呈中度正相關，與擬桿菌屬S24-7（norank_f__Bacteroidales_S24-7_group）呈中度負相關，血液中IL_6 濃度與胃瘤球菌屬（Ruminococcus）、擬桿菌屬、乳桿菌屬有較強的相關性，與郭曉紅等[18]的研究結果一致。毛螺菌科屬在仔豬生長發(fā)育過程中對能量代謝、機體免疫能力等方面起著重要作用。Callaway 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，毛螺菌科屬與脂肪能量代謝、丁酸鹽代謝有較強的相關性。本研究中發(fā)現(xiàn)，毛螺菌屬（Lachnospiraceae）的XPB1014、AC2044 與IgA、IgM、IgG 都有顯著的相關性。糞球菌屬（Coprococcus）對短鏈脂肪酸的產(chǎn)生具有重要作用，能夠阻擋其他有害菌進入到腸道，減少炎癥的發(fā)生。Min 等[20]發(fā)現(xiàn)在不同性別人群中，霍爾德曼氏菌（Holdemanella）會導致脂肪沉積的差異。本研究發(fā)現(xiàn)，糞球菌屬、霍爾德曼氏菌與血液IgA 濃度都存在中度正相關，說明在豬生長發(fā)育的過程中，這些菌種在脂肪代謝過程起著重要作用。仔豬斷奶后大腸桿菌、沙門氏菌、葡萄球菌等致病菌在仔豬腸道數(shù)量也來越多，引起仔豬腸道功能紊亂的同時也能刺激SIgA 的分泌，擬桿菌屬S24-7（Bacteroidales_S24-7）與腸道的炎癥有顯著的相關性[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，擬桿菌屬S24-7 與IL_2 和IgM間也存在顯著的相關。Salminen 等[22]研究表明，當有害菌或病毒引起腸道感染時，腸道內的IgA 要比血液中的IgM、IgG 具有更大的保護作用，在本研究發(fā)現(xiàn)，與IgA濃度存在顯著相關的菌群多達26 個，說明腸道菌群在抗炎癥、能量代謝、提高機體抵抗能力有積極的作用。

4 結 論

本研究以杜× 長× 大為試驗對象，探討仔豬斷奶后不同生長階段和飼料營養(yǎng)水平的變化對豬腸道微生物菌群的影響，發(fā)現(xiàn)斷奶后隨著日齡的不斷增加，豬腸道微生物趨于穩(wěn)定，腸道微生物菌群的種類也有數(shù)減少，厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroides）、螺旋體門（Spirochaetae）為腸道的主要優(yōu)勢菌門；梭狀芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、擬桿菌屬、瘤胃球菌屬等菌屬與血液免疫抗體具有顯著相關性，對豬的生長發(fā)育有著重要的作用。