外泌體的生物學功能和調(diào)控機制研究進展

彭夢陽 ，賀 花，王獻偉，蔡翠翠，劉 賢，徐澤君，茹寶瑞，雷初朝，陳 宏，黃永震*

（1.西北農(nóng)林科技大學動物科技學院，陜西楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學學院，陜西楊凌 712100；3.河南省畜牧總站，河南鄭州 450008；4.寧夏農(nóng)林科學院固原分院，寧夏固原 756000）

1983 年，Pan 等[1]發(fā)現(xiàn)羊未成熟紅細胞可以分泌囊泡結(jié)構(gòu)。1987 年，Johnstone 等[2]將這種在綿羊紅細胞上清液中發(fā)現(xiàn)的直徑為30～100 nm、密度在1.10～1.20 g/mL的膜性小囊命名外泌體（Exosomes）。隨后發(fā)現(xiàn)多種細胞可以分泌外泌體，且在體液中也可以檢測到，但當時對其研究不透徹，人們一度認為其為細胞代謝廢物。1996 年，Stoorvogel 等[3]發(fā)現(xiàn)外泌體具有改變細胞外微環(huán)境、參與免疫調(diào)節(jié)以及影響機體健康等重要功能，外泌體才開始得到廣泛關(guān)注。2007 年，Valadi 等[4]發(fā)現(xiàn)外泌體中含有mRNAs 和miRNAs。隨著研究不斷深入，研究者們發(fā)現(xiàn)外泌體的更多組分，更加深刻認識到外泌體在參與細胞間物質(zhì)運輸與信息傳遞方面以及在生物生理與病理中發(fā)揮重要作用。

外泌體來源廣泛，功能多樣，幾乎所有細胞都可分泌外泌體，而這些外泌體具有源細胞的種種特點，其內(nèi)含蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)。目前外泌體在疾病診療方面的研究取得了多項成果，展示了外泌體參與機體免疫應(yīng)答、細胞遷移、細胞增殖分化、細胞凋亡、腫瘤侵襲等過程。外泌體在畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域研究較少，且僅集中于乳液外泌體中的miRNA。研究外泌體有助于認識細胞間廣泛的聯(lián)系與互作關(guān)系，有助于認識機體組織增殖分化與腫瘤轉(zhuǎn)移機制，可用于疾病診斷與治療。本文主要對外泌體的發(fā)生、分離純化及功能調(diào)控機制進行綜述，為選擇合適的外泌體提取方法與更深入研究外泌體提供參考。

1 外泌體發(fā)生機制與生物學特性

外泌體屬于細胞外囊泡的一個亞組，主要由細胞通過胞吞作用形成核內(nèi)體，而后核內(nèi)體以內(nèi)出芽的方式形成管腔狀囊泡，在這個過程中囊泡會有目的地分揀脂質(zhì)、蛋白質(zhì)與核酸成分，形成有亞細胞結(jié)構(gòu)的多囊體，其通過Ca2+依賴途徑與細胞膜融合將其內(nèi)小囊泡釋放出來[5]，這些小囊泡就被稱為外泌體。外泌體的形態(tài)大小變異較大且范圍不同的原因是大多研究不要求囊泡濃度，外泌體往往是各種囊泡的混合物[6]。由于外泌體的分泌受多種分子調(diào)節(jié)，Ras 超家族中Rab 蛋白是備受關(guān)注的一類，其成員Rab27a 主要通過修飾基因調(diào)節(jié)外泌體的分泌與作用，研究證明Rab27a 過表達癌細胞外泌體可以引起更有效的抗腫瘤免疫效應(yīng)[7]，后來的研究驗證了利用外泌體治療腫瘤思路的可行性[8-9]。

外泌體膜厚度約5 nm，形態(tài)為圓形或橢圓形“杯狀”囊泡[10]，外泌體中存在的蛋白與核酸種類多樣，且與源細胞組分與功能相聯(lián)系。截止2016 年，外泌體中被發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)有9 769 種，mRNA 有3 408 種，miRNAs 有2 838 種 （http://www.exocarta.org/）。在口腔來源的外泌體研究中，研究者曾分離腮腺唾液外泌體中491 種蛋白質(zhì)，其中265 種與腮腺導(dǎo)管中蛋白一致，有72 種與其他尿液蛋白質(zhì)一致[11]?？梢姴煌饷隗w有共同的保守成分，廣泛存在的外泌體大多均包括CD9、CD63、CD81、MHC、Alix、flotillin、TSG101、HSC70 等多種標志蛋白，可以用來鑒定和分選外泌體[12]。

2 外泌體的分離與純化

外泌體在疾病早期診斷與靶向治療方面的作用越趨重要，但其分離純化方法尚無統(tǒng)一標準。目前外泌體的提取方法較多，提取產(chǎn)物在含量、純度、活性方面存在不同，各有優(yōu)缺點。其提取分離原理：根據(jù)外泌體與其他物質(zhì)沉降系數(shù)不同進行離心分離；根據(jù)外泌體大小進行過濾分離；根據(jù)外泌體大小及理化性質(zhì)沉淀分離與識別外泌體表面特異蛋白并進行分離。外泌體具體分離方法及優(yōu)缺點見表1[13-26]。

3 外泌體的生物學功能與其調(diào)控機制

外泌體來源分布廣泛且功能多樣，與各自源細胞關(guān)系密切，不同外泌體具有不同生物學特點，受其內(nèi)容物、組織微環(huán)境、受體細胞等因素影響會產(chǎn)生不同的作用效果[27]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，骨骼肌外泌體在肌肉生成與再生、肌肉萎縮等過程中起到不可忽視的作用[28]；癌細胞外泌體具有參與腫瘤轉(zhuǎn)移、促進或抑制腫瘤進展、引起機體免疫應(yīng)答、促血管生成作用[29]。骨細胞外泌體有骨重塑、骨代謝、成骨細胞破骨細胞分化等功能[30]；桿菌來源外泌體有抑制宿主免疫、滅殺其他細菌、釋放毒力因子、促進自身增殖生長、引起宿主免疫應(yīng)答等功能[31]；胎盤外泌體膜上含有胎盤組織的凋亡信號分子，在母體對胎兒的免疫耐受作用中發(fā)揮免疫作用，除此之外還有參與螺旋動脈重鑄與胎盤屏障形成的功能[32]；間充質(zhì)干細胞外泌體種類多樣功能眾多，有免疫調(diào)節(jié)功能、促血管新生、信息傳遞調(diào)控分化、組織修復(fù)與細胞增殖等功能[33-34]；脂肪組織外泌體具有相同的功能，同時，成熟的脂肪細胞外泌體與脂肪干細胞外泌體有更強的成脂分化能力[35]。

外泌體發(fā)揮作用的方式主要有3 種[36]：第一種是外泌體膜上配體與靶細胞膜上受體結(jié)合傳遞細胞間信息發(fā)揮作用；第二種是外泌體與靶細胞融合釋放其內(nèi)含的各種促因子與核酸實現(xiàn)信息轉(zhuǎn)運發(fā)揮功能；第三種是外泌體釋放胞內(nèi)物質(zhì)作用于靶細胞表面受體，完成信息傳遞產(chǎn)生生物學效應(yīng)。

3.1 外泌體的免疫調(diào)節(jié)功能與調(diào)控機制 免疫調(diào)節(jié)功能的調(diào)控機制主要有外泌體直接作用于靶細胞啟動下游信號和外泌體miRNA 介導(dǎo)調(diào)控2 種。胎盤外泌體表面存在胎盤組織表達的Fas 配體（Fas Ligand，F(xiàn)asL）與腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（Tumor Necrosis Factor-Related Apoptosis-Inducing Ligand，TRAIL），這2 種信號分子通過與靶細胞接觸觸發(fā)T 細胞凋亡，從而維持正常妊娠[37]；Delorme-Axford 等[38]和Donker 等[39]研究發(fā)現(xiàn)，C19MCmiRNA 是胎盤外泌體miRNA 主要成分，該miRNA 可以誘發(fā)病毒自我吞噬和抑制增殖，從而提高胎兒對外界的抗感染能力；在燒傷大鼠模型中，間充質(zhì)干細胞外泌體內(nèi)含的miRNA-181c 可以降低TLR4（Toll 樣受體）表達，從而降低NF.κB/p65 的激活，抑制過度炎癥反應(yīng)[40]；在小鼠糖尿模型中，間充質(zhì)干細胞外泌體通過內(nèi)含的siFas基因和Anti-miRNA-375沉默人胰島相關(guān)基因，從而提高胰島移植效果[41]。在肺結(jié)核桿菌外泌體研究中發(fā)現(xiàn)，外泌體表面過表達熱休克蛋白70（Heat Shock Protein 70，HSP70），此現(xiàn)象激活核因子κB（Nuclear Factor kappa-B，NF-κB）途徑誘導(dǎo)巨噬細胞釋放腫瘤壞死因子而引起促炎反應(yīng)[42]；腫瘤細胞外泌體表達的FasL 可以誘導(dǎo)CD8 T 凋亡，抑制Jak3 和細胞周期素D3 來阻斷殺傷NK 細胞周期，從而為腫瘤生長創(chuàng)造條件，腫瘤細胞外泌體可以介導(dǎo)多種RNA 轉(zhuǎn)移來促進癌癥發(fā)展[43]。

表1 外泌體提取方法

3.2 外泌體調(diào)控血管新生功能及其機制 血管新生是指從現(xiàn)有血管形成新血管的過程[44]。外泌體可以通過microRNA 調(diào)控內(nèi)皮細胞功能和血管生成，如miRNA-424 通過靶向cullin2 促進血管新生[45]；外泌體富集的miRNA-125a 可以通過靶向基因 3' 非翻譯區(qū)域阻礙抑制劑表達，促進血管生成；在ips-MSC 外泌體處理的大鼠股骨頭壞死模型中，血管內(nèi)皮細胞（Vascular Endothelial Cells，VEC）形成血管能力增強，并且發(fā)現(xiàn)其PI3K/Akt 信號通路被激活[46]；經(jīng)過NO 釋放物處理過的外泌體可以增強促血管生成因子的生成，進而發(fā)揮作用[47]；敲除細胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子（Extracellular Matrix Metalloproteinase Inducer，EMMPRIN）基因，VEC 促血管生成作用減弱，說明金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子在外泌體促血管生成中有重要作用[48]；在研究心肌細胞時發(fā)現(xiàn)，在缺氧狀態(tài)，外泌體中高表達的miRNA-126 可以抑制炎性細胞因子，抑制心肌細胞凋亡，發(fā)揮免疫作用，同時其還可以促進微血管的生成和遷移，修復(fù)損傷細胞維持心臟功能[49-50]；在腫瘤細胞外泌體中，其表皮生長因子受體和miRNA-150 等生物分子可以誘導(dǎo)VEGF 和其受體表達，促進血管生成和腫瘤生長[51]。

3.3 外泌體在骨代謝中的作用及其機制 間充質(zhì)干細胞的外泌體因內(nèi)含相應(yīng)的miRNA 具有促進分化的功能，在骨代謝中有重要作用，其內(nèi)含的miRNA-223 可以參與破骨細胞的形成，但過度表達則起抑制作用[52]；miRNA-378 促進破骨細胞形成和分化[53]，let-7 和miRNA-140 則協(xié)同參與軟骨發(fā)育[54]；何偉等[55]通過大鼠顱骨缺損動物模型驗證人骨髓間充質(zhì)干細胞外泌體在體內(nèi)骨再生的作用，發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細胞外泌體促進骨再生的能力與上調(diào)Wnt/β-catenin 通路有關(guān)。β-catenin廣泛存在于細胞質(zhì)內(nèi)，受到Wnt 信號激活后轉(zhuǎn)入細胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)目標基因RUNX2，促進脂肪干細胞成骨分化。崔夢瑩等[56]研究發(fā)現(xiàn)，脂肪干細胞來源外泌體可以上調(diào)β-catenin 蛋白表達，促進脂肪干細胞成骨分化。宋子珺等[57]用脂肪干細胞外泌體處理骨細胞凋亡模型，發(fā)現(xiàn)外泌體可以抑制低氧缺血環(huán)境下骨細胞的凋亡，提示脂肪干細胞釋放的外泌體可以促進骨組織修復(fù)與再生。高坤等[58]研究發(fā)現(xiàn)，膝關(guān)節(jié)炎滑膜液分泌的外泌體能夠通過YAP 去磷酸化抑制MMP-1、MMP-13 分泌，促進軟骨細胞的增殖，具有保護關(guān)節(jié)軟骨的作用。

3.4 外泌體在神經(jīng)細胞中的作用及其機制 神經(jīng)細胞外泌體參與疾病的發(fā)生，同時在神經(jīng)生長與保護方面起作用，如小膠質(zhì)細胞和星狀膠質(zhì)細胞外泌體含有的促炎性細胞因子和金屬蛋白酶會破壞血腦屏障在腦組織引起炎癥[59]；伊剛等[60]在大鼠上的研究發(fā)現(xiàn)，脂肪干細胞來源外泌體對周圍神經(jīng)損傷后再生有一定促進作用，其機制可能與減少SCs 凋亡、抑制其自噬、減輕神經(jīng)瓦勒變性有關(guān)。Ebrahimkhani 等[61]研究表明，含有干擾素、腫瘤壞死因子等物質(zhì)的外泌體可以破壞血腦屏障，同時釋放內(nèi)容物，導(dǎo)致血腦屏障腦內(nèi)皮細胞之間的組織結(jié)構(gòu)和緊密性降低，進而使白細胞遷移來，引起髓鞘脫失，造成多發(fā)性硬化。陳晨等[62]開展了間充質(zhì)干細胞源性外泌體針對神經(jīng)退行性疾病的研究，發(fā)現(xiàn)其作用機制廣泛，具有免疫、再生、促進細胞增殖等眾多功能，提出運用間充質(zhì)干細胞源性外泌體治療神經(jīng)退行性疾病具有光明前景。

3.5 外泌體的其他功能和相關(guān)作用機制 研究表明[63-64]，終末分化細胞（如內(nèi)皮細胞、成骨細胞、神經(jīng)細胞等）能夠分泌外泌體，促使相應(yīng)的干細胞成血管內(nèi)皮分化、成骨分化、成神經(jīng)分化。脂肪細胞外泌體有促進脂肪干細胞分化的功能[65]。脂肪干細胞外泌體的組織修復(fù)和再生功能主要是通過傳遞脂肪干細胞來源或自身特異性包裝的蛋白、脂質(zhì)、mRNA 和miRNA 等物質(zhì)，并介導(dǎo)旁分泌通路以及所需的營養(yǎng)因子和炎癥因子，使損傷組織中的細胞重新進入細胞周期[66]。骨髓間充質(zhì)干細胞外泌體有增加心肌收縮力的功能，可能是其內(nèi)含的miRNA-21-5p 通過PI3K 信號通路起作用[67]；外泌體與病毒的生命活動有關(guān)，經(jīng)過EB 病毒的誘導(dǎo)會使外泌體中含病毒miRNA，并傳染給未受感染的受體細胞，此過程通過外泌體可以避開機體免疫監(jiān)視與攻擊[68]。在外泌體與病毒間的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，外泌體攜帶RNA病毒組分可促進病毒感染，病毒可能通過外泌體傳遞蛋白[69]、傳遞miRNA[70]，其中無囊膜RNA 病毒可依賴生成外泌體的ESCRT 通路，將外泌體的雙層膜作為后天獲得的囊膜抵御宿主抗體中和以逃逸宿主免疫[71]。

外泌體在各領(lǐng)域的研究火熱、成果豐碩，已有不少外泌體療法的臨床試驗且結(jié)果較好[72]，但在畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域的研究還比較少。Qu 等[73]通過對受體和供體小鼠輸卵管液中的外泌體進行分離對照實驗，發(fā)現(xiàn)供體小鼠輸卵管液中的外泌體濃度顯著高于受體小鼠，提示高濃度的輸卵管液外泌體可提高胚胎抗凋亡和分化水平，改善移植胚胎的存活率。Du 等[74]利用豬精漿外泌體處理精子，發(fā)現(xiàn)外泌體可以直接結(jié)合到精子頭部，抑制精子過早獲能，提高精子的質(zhì)膜完整性和抗氧化能力，維持精子生存能力。Sohel 等[75]分離牛卵泡液外泌體與非外泌體組分并提取分析其miRNA 組分，發(fā)現(xiàn)牛卵泡外泌體含有的miRNA 參與調(diào)控卵母細胞的成熟和生長。Zhu 等[76]通過重組腺病毒研究外泌體miRNA 對豬肺泡巨噬細胞的影響，發(fā)現(xiàn)其通過抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）蛋白的表達發(fā)揮抗病毒作用。

4 結(jié) 語

外泌體具有穩(wěn)定的物質(zhì)基礎(chǔ)與廣泛的分布，功能多樣，作用于生物生命活動的方方面面，目前對它的研究已是生命科學中的一個重要領(lǐng)域。外泌體具有與靶細胞高效結(jié)合的機制，作為新型疫苗與靶向藥物載體的潛力極高；它攜帶的豐富的生物信息物質(zhì)可以使其發(fā)揮改善細胞微環(huán)境，參與到機體免疫、組織修復(fù)、器官發(fā)生與維系等功能，目前研究人員已對肝、肺、腎、心、骨、肌肉等多種組織或異變的腫瘤組織外泌體有了深入的了解；檢測外泌體蛋白以及核酸成分可以用于診斷腫瘤，同時將其研究應(yīng)用到實際生產(chǎn)中可以獲得更多經(jīng)濟效益。如使用B 細胞外泌體進行免疫治療、利用外泌體的抗病毒作用防控疾病、利用輸卵管外泌體提高胚胎移植成功率等。雖然外泌體研究進展較快，但目前仍對其眾多生物學功能作用機制及其多樣的信息物質(zhì)還不甚了解，外泌體用于疫苗與高效安全的修復(fù)治療還有待觀望，且目前還缺乏一個可以大量且安全高效分選純化外泌體的方法。有關(guān)外泌體研究與應(yīng)用仍需要繼續(xù)深入探索，闡明外泌體的功能及其機制，并用實際生產(chǎn)、揭開某些生物奧秘、輔助攻克不同醫(yī)學難題。