紅豆杉屬植物中紫杉烷化合物含量比較與分析

吳長橋，蔣路園，楊艷芳，陸 英，唐 其，陳段芬，邱德有

紅豆杉屬植物中紫杉烷化合物含量比較與分析

吳長橋1, 2，蔣路園1, 3，楊艷芳1*，陸 英2，唐 其2，陳段芬3，邱德有1

1. 中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所林木遺傳育種國家重點實驗室，國家林業(yè)局林木培育重點實驗室，北京 100091 2. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，湖南 長沙 410128 3. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，河北 保定 071001

分析和比較5種紅豆杉中6種紫杉烷類化合物含量的差異。利用乙醇超聲浸提后得到樣品溶液；通過高效液相色譜法測定和相關(guān)性分析、回歸分析和聚類分析比較紫杉醇、巴卡亭III、10-去乙?；涂ㄍあ螅?0-deacetylbaccatin III，10-DAB）、10-去乙?；仙即迹?0-deacetyltaxol，10-DAT）、三尖杉寧堿和10-去乙酰基-7-木糖基紫杉醇（10-deacetyl-7-xylosetaxol，DXT）含量。不同種紅豆杉紫杉烷含量存在顯著性差異，隴南地區(qū)中國紅豆杉中10-DAB、紫杉醇、10-DAT和三尖杉寧堿含量顯著高于其他種紅豆杉，曼地亞紅豆杉和湖南省南方紅豆杉中10-DAB含量也相對較高；相關(guān)性分析、回歸分析及聚類分析均表明，10-DAT和三尖杉寧堿與紫杉醇含量顯著相關(guān)，且前者比后者對紫杉醇含量的影響作用更大；聚類分析還表明溫室內(nèi)栽植的南方紅豆杉聚為一類，大田種植的中國紅豆杉、東北紅豆杉、太行山地區(qū)南方紅豆杉和曼地亞紅豆杉聚為一類，表明環(huán)境因子對紫杉烷積累具有明顯影響。不同種紅豆杉中紫杉烷含量具有顯著差異，種類是影響紅豆杉紫杉醇等紫杉烷含量的重要因素，紫杉醇含量隨著10-DAT和三尖杉寧堿含量增加而增加。

紫杉醇；巴卡亭III；10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ；10-去乙酰基紫杉醇；三尖杉寧堿；10-去乙?；?7-木糖基紫杉醇；中國紅豆杉；東北紅豆杉；云南紅豆杉；西藏紅豆杉；南方紅豆杉；曼地亞紅豆杉

紫杉醇是一種從紅豆杉中提取的天然二萜類化合物，對多種癌癥具有良好的療效，如卵巢癌、乳腺癌、子宮癌等[1-2]。然而，紫杉醇在紅豆杉中含量極低，并且紅豆杉生長十分緩慢，因而，紫杉醇供需矛盾激化，紅豆杉野生資源遭到了嚴重的破壞。

紅豆杉中除了紫杉醇之外，還含有上百種紫杉烷二萜類化合物[3]，這些紫杉烷化合物中，三尖杉寧堿與紫杉醇結(jié)構(gòu)十分相似，同時也具有較強的抗腫瘤活性[4]，而巴卡亭III和10-去乙?；涂ㄍあ笫亲仙即己铣傻闹虚g產(chǎn)物，同時也是半合成法合成紫杉醇的重要原料[5-6]。此外，近年來，科研工作者也實現(xiàn)利用10-去乙?；仙即技?-木糖基紫杉醇作為原料轉(zhuǎn)化合成紫杉醇。這些工作無疑為提高紫杉醇含量，拯救更多癌癥病人帶來了新的轉(zhuǎn)機。

紅豆杉是紅豆杉屬sp.植物的通稱，我國共有4種1變種：中國紅豆杉(Pilger) Rehd、東北紅豆杉Sieb. et Zucc、云南紅豆杉cheng et L. K. Fu、西藏紅豆杉Zucc和南方紅豆杉var.(Lemee et Levl.) Cheng et L. K. Fu。曼地亞紅豆杉×cv. Hicksii是東北紅豆杉和歐洲紅豆杉的雜交種，自20世紀90年代引種于我國以來，在我國四川、山東等地具有廣泛栽植。目前，已經(jīng)有多篇文獻對紅豆杉中紫杉醇含量進行了測定[7-9]，但是針對上述6種紫杉烷在不同種紅豆杉中測定的報道較為少見。本研究對栽植范圍較廣的4種紅豆杉嫩枝葉中紫杉醇等6種紫杉烷成分的含量進行了測定和比較，對于保護天然紅豆杉，培育高紫杉烷含量新品種，實現(xiàn)紅豆杉植物資源的高效利用具有重要意義。

1 材料與儀器

1.1 材料

東北紅豆杉、太行山地區(qū)南方紅豆杉、甘肅隴南地區(qū)中國紅豆杉及曼地亞紅豆杉3～5年生小苗種植于河北省廊坊市實驗基地，來自浙江省和湖南省南方紅豆杉3年生小苗種植于中國林業(yè)科學(xué)研究院科研溫室。上述紅豆杉均經(jīng)中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所楊艷芳副研究員鑒定確認為中國紅豆杉(Pilger) Rehd、東北紅豆杉Sieb. et Zucc.、南方紅豆杉var.(Lemee et Lévl.) Cheng et L. K. Fu、曼地亞紅豆杉×cv. Hicksii。樣品信息見表1。

2019年10月中下旬采集植株當年生及1年生健康葉片若干，自然干燥，采用粉碎機磨碎，過篩，用于后續(xù)紫杉烷類物質(zhì)提取。

對照品巴可亭III（批號20160902）、10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ（10-deacetylbaccatin III，10-DAB，批號20160219）、紫杉醇（批號20160227）、三尖杉寧堿（批號20170222）、10-去乙?；仙即迹?0-deacetyltaxol，10-DAT，批號20170114）和10-去乙?；?7-木糖基紫杉醇（10-deacetyl-7- xylosetaxol，DXT，批號20170702）購自壇墨質(zhì)檢標準物質(zhì)中心，質(zhì)量分數(shù)均大于98%。乙醇、甲醇、乙腈（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）均為分析純。

1.2 主要儀器

AUW220D型電子天平和LC-20A高效液相色譜儀購自日本島津公司；KM5200DE型超聲波清洗器購自昆山美美超聲儀器有限公司。

2 方法

2.1 混合對照品溶液的制備

分別精密稱取巴可亭III、10-DAB、紫杉醇、三尖杉寧堿、10-DAT和DXT對照品7.0 mg，分別用甲醇配制成質(zhì)量濃度為0.70 mg/mL的對照品母液，各取母液1.0 mL，配成質(zhì)量濃度為0.10 mg/mL混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

準確稱取樣品粉末0.50 g，加入體積分數(shù)80%乙醇25 mL，50 ℃超聲提取1 h，冷卻至室溫，用提取溶液補足至超聲前質(zhì)量，搖勻過0.45 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

2.3 HPLC色譜條件

色譜柱為GL Sciences（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈（B）-水（A），洗脫梯度，0～75 min，30%～63% B；體積流量1.0 mL/min，檢測波長227 nm；柱溫為30 ℃；進樣量為50 μL。色譜圖見圖1。

2.4 標準曲線繪制

取混合對照品溶液母液，將母液逐級稀釋，每個濃度混合對照品進樣 10 μL，在上述“2.3”項條件，以峰面積為縱坐標（），各紫杉烷對照品的質(zhì)量濃度為橫坐標（）確定標準曲線。巴卡亭III、10-DAB、紫杉醇、三尖杉寧堿、10-DAT和DXT的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)（2）、見表2。

表2 6個紫杉烷類化合物的線性方程和相關(guān)系數(shù)

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗 取混合對照品溶液，按照“2.3”項條件連續(xù)進樣6次，巴卡亭III、10-DAB、紫杉醇、三尖杉寧堿、10-DAT和DXT色譜峰峰面積的RSD分別為0.70%、0.80%、0.80%、1.00%、0.90%、0.70%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.5.2 重復(fù)性試驗 取樣品（DB）粉末約0.5 g，平行6份，精密稱定，按“2.2”項方法制備供試品溶液，按照“2.3”項條件分析，計算樣品中巴卡亭III、10-DAB、紫杉醇、三尖杉寧堿、10-DAT和DX質(zhì)量分數(shù)的RSD，結(jié)果分別為1.2%、0.95%、1.9%、2.2%、0.70%、0.54%，結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液（DB）分別于0、2、4、8、16、24、48、72 h 進樣測定，供試品溶液中巴可亭III、10-DAB、紫杉醇、三尖杉寧堿、10-DAT和DXT的色譜峰峰面積的RSD值分別為0.10%、0.50%、1.30%、0.90%、1.20%、0.60%，結(jié)果表明供試品溶液在3 d 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.4 加樣回收率試驗 取已測定的東北紅豆杉粉末，精密稱定，按照相當于樣品中紫杉烷80%、100%、120%的比例，分別精密加入混合對照品溶液，按照“2.2”項供試品的制備方法，在上述的色譜條件下進行分析，計算baccatin III、10-DAB、紫杉醇、三尖杉寧堿、10-DAT和DXT的回收率和RSD值，巴可亭III、10-DAB、紫杉醇、三尖杉寧堿、10-DAT和DXT加樣回收率分別為98.20%、101.82%、97.00%、100.71%、94.01%、100.01%；RSD值分別為1.7%、1.0%、1.1%、1.4%、0.62%、0.64%。

2.6 樣品測定

取各樣品按照“2.2”項制備供試品溶液，按照“2.3”項方法進行HPLC分析，記錄峰面積，并根據(jù)各標準曲線計算樣品中各成分的含量。

2.7 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Excel進行數(shù)據(jù)整理和繪圖，用SPSS 22.0進行相關(guān)性分析、多元回歸統(tǒng)計和聚類分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同類型紅豆杉紫杉烷類成分的比較

對大田種植的4種紅豆杉中6種紫杉烷類成分含量測定，結(jié)果如圖2所示，6種成分中10-DAB含量最高，其他幾種成分含量相近。此外，在4個種中，隴南地區(qū)中國紅豆杉的6種成分均較高，10-DAB、紫杉醇、10-DAT和三尖杉寧堿含量顯著高于其他種紅豆杉。曼地亞紅豆杉中10-DAB的含量也顯著高于東北紅豆杉（DB）和太行山地區(qū)紅豆杉（TH），但其10株單株中均未檢測出巴卡亭III。4種紅豆杉中DXT含量差異不顯著，而東北紅豆杉和中國紅豆杉中巴卡亭III含量差異也不顯著。

對溫室種植的湖南和浙江2個省份的3年生南方紅豆杉小苗中6種紫杉烷類成分含量進行了測定。結(jié)果如圖3所示，6種成分中10-DAB和DXT含量較高，其他4種成分含量相近。比較這2個地區(qū)，湖南產(chǎn)南方紅豆杉中10-DAB顯著高于浙江產(chǎn)南方紅豆杉。

3.2 紅豆杉5種紫杉烷類成分相關(guān)性分析

為了更好地研究紅豆杉中5種紫杉烷化合物含量之間的相互關(guān)系，對其進行了相關(guān)性分析。結(jié)果如表3所示，三尖杉寧堿與紫杉醇和10-DAT呈極顯著相關(guān)（＝0.575，＜0.01；＝0.368，＜0.01），與巴卡亭III和10-DAB呈顯著相關(guān)（＝0.458，＜0.05；＝0.266，＜0.05），與DXT則不相關(guān)；紫杉醇與10-DAT和DXT呈極顯著相關(guān)（＝0.576，＜0.01；＝0.480，＜0.01），與巴卡亭III呈顯著相關(guān)（＝0.392，＜0.05），與10-DAB則不相關(guān)；此外，10-DAT和DXT呈極顯著相關(guān)（＝0.624，＜0.01）。

表3 6種紫杉烷類成分相關(guān)性分析

*＜0.05，**＜0.01

3.3 紅豆杉中紫杉烷類化合物線性回歸預(yù)測模型

將紫杉醇含量作為因變量，以上述相關(guān)性分析中顯著相關(guān)的成分巴卡亭III、三尖杉寧堿、10-DAT和DXT為自變量，應(yīng)用逐步回歸法建立預(yù)測模型。經(jīng)過逐步擬合，10-DAT和三尖杉寧堿2個自變量進入回歸方程，形成最優(yōu)模型，模型的判定系數(shù)（2）為0.461，估計值的標準誤差為0.127，Durbin-Watson檢驗統(tǒng)計量為2.346，表明殘差獨立。逐步回歸擬合的多元線性方程結(jié)果表明10-DAT和三尖杉寧堿對紫杉醇含量的影響可達到43.1%。因此，基于10-DAT（1）和三尖杉寧堿（2）2個關(guān)鍵因子與紫杉醇（）構(gòu)建的線性回歸模型為＝0.7651＋0.4862＋0.005。參數(shù)經(jīng)檢驗，其概率值分別為0.001和0.035，具有顯著性。共線性統(tǒng)計量顯示了變量的容差（Tolerance）為0.839，方差膨脹因子（VIF）為1.192，表明自變量之間不存在多重共線性。紫杉醇含量均隨著10-DAT（1）和三尖杉寧堿（2）含量的增加而增加，與三尖杉寧堿（2）含量相比，10-DAT（1）含量的增加對紫杉醇含量的影響更大。

3.4 聚類分析

利用大田種植的3種紅豆杉5種紫杉烷類成分進行聚類分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)紫杉烷類化合物分成2類，其中10-DAB為一類，紫杉醇、10-DAT、DXT和三尖杉寧堿聚為一類（圖4）。

此外，利用大田4種紅豆杉和溫室的浙江和湖南省南方紅豆杉5種紫杉烷含量數(shù)據(jù)，對不同種類紅豆杉進行聚類分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，測試樣品中，東北紅豆杉、中國紅豆杉、太行山南方紅豆杉和曼地亞紅豆杉聚為一類，而浙江和湖南省的南方紅豆杉聚為一類（圖5）。

4 討論

紅豆杉是獲取紫杉醇最主要的藥源植物，因此，獲取高紫杉醇等紫杉烷含量的紅豆杉新品種一直都是各大藥企及紅豆杉育種工作者所追求的目標之一。目前已有多篇關(guān)于不同種類、地區(qū)、年限、組織及發(fā)育時期等因素下紅豆杉中紫杉烷類化合物含量檢測的報道[7,9-13]。例如，姜艷等[14]報道曼地亞紅豆杉中紫杉醇含量最高，云南紅豆杉中10-DAB含量最高，而東北紅豆杉中三尖杉寧堿和紫杉烷總量最高。而朱慧芳等[15]則報道與中國紅豆杉和東北紅豆杉相比，在南方紅豆杉樹皮中紫杉醇含量最高，10-DAB在中國紅豆杉中較高。由于植物次生代謝物質(zhì)的合成是植物長期與適應(yīng)環(huán)境的進化結(jié)果，上述諸多因素及氣候、溫度、土壤等環(huán)境因素都會造成紅豆杉紫杉醇等紫杉烷含量有所不同。本研究中，對露地種植的中國紅豆杉、東北紅豆杉、太行山地區(qū)南方紅豆杉和曼地亞紅豆杉中的6種紫杉烷類化合物成分進行檢測比較，發(fā)現(xiàn)中國紅豆杉6種成分均顯著高于其他3個種和太行山地區(qū)南方紅豆杉。研究結(jié)果與前人結(jié)果一致，表明不同種類紅豆杉之間紫杉烷含量具有顯著差異。

圖4 紫杉烷含量聚類分析

圖5 紅豆杉聚類分析

馬生軍等[12]利用不同產(chǎn)地、不同生長年限的曼地亞紅豆杉作為實驗材料，發(fā)現(xiàn)三尖杉寧堿和10-DAB與紫杉醇呈極顯著相關(guān)。本研究中紫杉烷含量相關(guān)性分析并未發(fā)現(xiàn)10-DAB與紫杉醇存在顯著相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)巴可亭III、三尖杉寧堿、10-DAT和DXT與紫杉醇含量具有顯著或極顯著相關(guān)（表1），而回歸分析也表明三尖杉寧堿、10-DAT與紫杉醇具有顯著相關(guān)。紫杉烷成分聚類分析也進一步顯示10-DAT和三尖杉寧堿與紫杉醇關(guān)系密切，三者聚為一類（圖4）。由此可見，不同種類與不同地區(qū)、年限的同一種中紅豆杉中紫杉烷類化合物之間的關(guān)系并不完全一致。

本研究對所涉及的紅豆杉進行聚類分析，發(fā)現(xiàn)溫室種植的湖南和浙江南方紅豆杉聚為一類，而露地種植的東北紅豆杉、中國紅豆杉、太行山地區(qū)南方紅豆杉和曼地亞紅豆杉明顯聚為一類（圖5）。表明，可能是由于湖南和浙江省南方紅豆杉種植于溫室，與大田種植的紅豆杉生長環(huán)境極大不同而造成。產(chǎn)地是影響紅豆杉中紫杉醇含量的一個重要環(huán)境因子，研究表明不同產(chǎn)地的紅豆杉葉中紫杉醇含量相差數(shù)倍甚至十幾倍[16]。由此可見，生長環(huán)境極大地影響紫杉醇等紫杉烷類的積累。此外，盡管東北紅豆杉、中國紅豆杉、太行山地區(qū)南方紅豆杉和曼地亞紅豆杉組成一大類，但也可以看出，東北紅豆杉、太行山地區(qū)南方紅豆杉和曼地亞紅豆杉聚成一個小的亞類，表明種類可能是影響紅豆杉紫杉醇等紫杉烷含量的重要因素。

[1] 李媛, 李振宇. 天然抗癌藥物-紫杉醇 [J]. 中山大學(xué)研究生學(xué)刊: 自然科學(xué)與醫(yī)學(xué)版, 2006(4): 58-62.

[2] Yang C H, Horwitz S B. Taxol?: the first microtubule stabilizing agent [J]., 2017, 18(8): E1733.

[3] 楊春, 孔令義, 汪俊松. 加拿大紅豆杉中紫杉烷類成分的研究進展及藥源危機解決方法探討 [J]. 中國中藥雜志, 2014, 39(11): 1961-1971.

[4] 劉同祥, 張艷平, 徐羽, 等. 紫杉醇聯(lián)合三尖杉寧堿誘導(dǎo)人肝癌HepG2細胞凋亡 [J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志, 2010, 16(9): 115-118.

[5] Denis J N, Greene A E, Guenard D,. Highly efficient, practical approach to natural taxol [J].1988, 110(17): 5917-5919.

[6] 孔建強, 王偉, 朱平, 等. 紫杉醇生物合成的研究進展 [J]. 藥學(xué)學(xué)報, 2007, 42(4): 358-365.

[7] 張潔, 徐小平, 劉靜, 等. 我國不同種類紅豆杉不同部位紫杉醇的含量分布研究 [J]. 藥物分析雜志, 2008, 28(1): 16-19.

[8] Nasiri J, Naghavi M R, Alizadeh H,. Seasonal-based temporal changes fluctuate expression patterns of,,andgenes alongside production of associated taxanes in[J]., 2016, 35(5): 1103-1119.

[9] 陳立國. 紅豆杉屬植物中主要紫杉烷類化合物的分離純化研究 [D]. 大連: 大連工業(yè)大學(xué), 2007.

[10] 張九東, 雷穎虎, 馮寧, 等. 陜西省秦巴山區(qū)紅豆杉中紫杉醇含量研究 [J]. 陜西師范大學(xué)學(xué)報: 自然科學(xué)版, 2009, 37(4): 76-81.

[11] 高銀祥, 楊逢建, 張玉紅, 等. 南方紅豆杉枝葉中6種紫杉烷類化合物含量季節(jié)變化 [J]. 植物研究, 2014, 34(2): 266-270.

[12] 馬生軍, 劉建慧, 馬留純, 等. 不同產(chǎn)地及生長年限曼地亞紅豆杉中10-脫乙?；涂ㄍあ?、三尖杉寧堿、紫杉醇量的比較分析 [J]. 中草藥, 2017, 48(23): 4979-4985.

[13] 何佳奇, 鄭敏霞, 盛振華, 等. 溫度對南方紅豆杉紫杉烷類化合物含量的影響 [J]. 中國中醫(yī)藥科技, 2018, 25(5): 681-685.

[14] 姜艷, 沈晨佳, 周丹英, 等. 紅豆杉屬植物中紫杉烷類物質(zhì)含量比較 [J]. 浙江農(nóng)業(yè)科學(xué), 2018, 59(12): 2280-2282.

[15] 朱慧芳, 鄭文龍, 王玉亮, 等. 三種紅豆杉屬植物中紫杉烷類化合物含量的檢測與分析 [J]. 上海交通大學(xué)學(xué)報: 農(nóng)業(yè)科學(xué)版, 2010, 28(1): 9-13.

[16] 蘇建榮, 張志鈞, 鄧疆. 不同樹齡、不同地理種源云南紅豆杉紫杉醇含量變化的研究 [J]. 林業(yè)科學(xué)研究, 2005, 18(4): 369-374.

Comparative, regression and cluster analysis on contents of six taxanes inspp.

WU Chang-qiao1, 2, JIANG Lu-yuan1, 3, YANG Yan-fang1, LU Ying2, TANGQi2, CHEN Duan-fen3, QIU De-you1

1 State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Key Laboratory of Tree Breeding and Cultivation, Research Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry, Beijing 100091, China 2 College of Horticulture, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China 3 College of Horticulture, Hebei Agricultural University, Baoding 071001, China

To analyze and compare the contents of six taxanes in five differentspecies.The sample solution was obtained by ultrasonic extraction with ethanol; The contents of taxol, baccatin III, 10-deacetylbaccatin III (10-DAB), 10-deacetyltaxol (10-DAT), cephalotaxine, and 10-deacetyl-7-xylosetaxol (DXT) were investigated by HPLC method, and analyzed with correlation, regression, and cluster analysis.The contents of 10-DAB, Taxol, 10-DAT and cephalotaxine inform Longnan Area were significantly higher than those in otherspecies. The contents of 10-DABvar.and×were higher than the others. Moreover, with the correlation, regression, and cluster analysis results, 10-DAT and cephalotaxine were significantly correlated with taxol content, respectively. Furthermore, the cluster analysis also showed that the plants ofvar.which planted in the greenhouse were clustered into one group, and the plants of,,var.from Taihang Mountain, and×which planted in field were grouped together, indicating that environmental factors have obvious effects on taxanes accumulation.Taxanes contents in differentspecies are significantly different, and taxol content increases with the increase of 10-DAT and cephalotaxine contents.

taxol; baccatin III; 10-deacetylbaccatin III; 10-deacetyltaxol; cephalotaxine; 10-deacetyl-7-xylosetaxol;(Pilger) Rehd;Sieb. et Zucc;Cheng et L. K. Fu;Zucc;var.(Lemee et Levl.)Cheng et L. K. Fu;×cv. Hicksii

R282.12

A

0253 - 2670(2021)02 - 0538 -06

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.02.027

2020-03-09

中國林業(yè)科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費專項資金項目（CAFYBB2018SY009）；國家自然科學(xué)基金項目（31570675）

吳長橋（1996—），男，在讀碩士研究生，主要從事中藥資源與開發(fā)研究。E-mail: 1515238496@qq.com

楊艷芳，副研究員，主要從事林木次生代謝工程與調(diào)控研究。Tel: (010)62889638 E-mail: echoyyf@caf.ac.cn

[責(zé)任編輯 時圣明]