紅芪多糖對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和成骨細(xì)胞的影響

趙良功，方瑤瑤，劉小花，封士蘭*

紅芪多糖對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和成骨細(xì)胞的影響

趙良功1, 2，方瑤瑤3，劉小花3，封士蘭3*

1. 甘肅省骨關(guān)節(jié)疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000 2. 蘭州大學(xué)第二醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000 3. 蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000

研究3種新型紅芪多糖（HPS-1、HPS-2、HPS-3）對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞rBMSCs和顱骨成骨細(xì)胞ROBs成骨性分化的影響。采用MTT法檢測(cè)rBMSCs細(xì)胞和ROBs細(xì)胞增殖；采用堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）試劑盒檢測(cè)rBMSCs細(xì)胞和ROBs細(xì)胞的ALP活性；采用茜素紅染法檢測(cè)rBMSCs和ROBs細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)的形成情況。HPS-1（20、50 μg/mL）作用48 h顯著促進(jìn)rBMSCs細(xì)胞增殖（＜0.05、0.01），HPS-1（20 μg/mL）作用48 h顯著促進(jìn)ROBs細(xì)胞增殖（＜0.01）；HPS-2和HPS-3對(duì)2種細(xì)胞的增殖無(wú)促進(jìn)作用。HPS-1（50、100 μg/mL）顯著升高rBMSCs細(xì)胞的ALP活性（＜0.01），HPS-1（10、20、50 μg/mL）顯著升高ROBs細(xì)胞的ALP活性（＜0.05、0.01）；HPS-3（50 μg/mL）顯著升高rBMSCs細(xì)胞的ALP活性（＜0.05），HPS-2對(duì)2種細(xì)胞ALP活性沒(méi)有促進(jìn)作用。HPS-1顯著增加rBMSCs和ROBs細(xì)胞中鈣化結(jié)節(jié)面積和數(shù)量（＜0.01），HPS-2和HPS-3對(duì)rBMSCs和ROBs細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)的形成沒(méi)有促進(jìn)作用。HPS-1可增強(qiáng)rBMSCs和ROBs細(xì)胞ALP活性和成骨相關(guān)因子表達(dá)，并顯著促進(jìn)rBMSCs和ROBs細(xì)胞分化、礦化。

紅芪多糖；成骨分化；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；顱骨成骨細(xì)胞；堿性磷酸酶

紅芪是豆科植物多序巖黃芪Hand. -Mazz. 的干燥根，為甘肅省的道地藥材。紅芪的主要成分包括多糖類、黃酮類、皂苷類、多種氨基酸類等，其中紅芪多糖（hedysarum polysaccharides，HPS）是紅芪的主要藥效成分，具有提高免疫力、抗衰老、抗肝纖維化、抗氧化等藥理作用[1]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)傳統(tǒng)水提法分離純化的紅芪多糖HPS3d可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化，具有防治骨質(zhì)疏松的潛質(zhì)[2]。傳統(tǒng)的水提法提取率低、溶解度差、后期純化困難，課題組采用復(fù)合酶聯(lián)合超聲提取工藝顯著提高了紅芪粗多糖的得率和含量[3]；紅芪粗多糖采用DEAE-52柱色譜分離純化，用蒸餾水及0.1、0.3 mol/L氯化鈉溶液依次洗脫，得到3種免疫活性較好的均質(zhì)性多糖組分（HPS-1、HPS-2、HPS-3）[4]。氣相色譜分析表明，3種新型多糖均由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖5種單糖組成，HPS3d不含甘露糖；3種新型多糖蛋白質(zhì)含量均低于HPS3d；HPS-1多糖含量高于HPS3d且相對(duì)分子質(zhì)量遠(yuǎn)小于HPS3d[2,4]。本研究探討3種新型紅芪多糖（HPS-1、HPS-2、HPS-3）對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞rBMSCs和顱骨成骨細(xì)胞ROBs增殖、分化和礦化的影響，為紅芪多糖的后續(xù)研究開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)SD雄性大鼠，1月齡，體質(zhì)量120～170 g；SPF級(jí)出生48 h以內(nèi)的SD大鼠乳鼠，體質(zhì)量25～30 g，均由蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（甘）2013-0002。動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，3只/籠，在（22±2）℃、12 h光/暗周期、相對(duì)濕度（50±5）%下，自由飲食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。所有程序和實(shí)驗(yàn)規(guī)程均經(jīng)蘭州大學(xué)動(dòng)物保護(hù)與使用倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)SCXK（GaN）2018-0002，并按照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)和動(dòng)物福利道德準(zhǔn)則進(jìn)行。

1.2 藥品與試劑

胎牛血清購(gòu)自Clark公司；II型膠原酶購(gòu)自Biosharp公司；青霉素、鏈霉素、DMEM培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基，購(gòu)自Hyclone公司；0.25%胰蛋白酶、檸檬酸、地塞米松（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%）、抗壞血酸、檸檬酸鈉、β-甘油磷酸鈉均購(gòu)自索萊寶公司；堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）試劑盒（批號(hào)20180614）購(gòu)自南京建成生物工程研究所；木瓜蛋白酶、纖維素酶，購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；95%乙醇、醋酸乙酯均為分析純。

1.3 儀器

BS224S/BP211D電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；XK96-6調(diào)速平板振蕩器（姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司）；KQ-3200DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；CKX53倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；CO-150型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)LabServ公司）；DK-98-Ⅱ型電熱恒水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；Vaioskan Flash多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)賽默飛世爾公司）；移液槍（德國(guó)Eppendorf公司）。

2 方法

2.1 紅芪多糖的制備

采用復(fù)合酶聯(lián)合超聲提取法制備得到紅芪粗多糖[3,5]。將紅芪粗多糖加適量蒸餾水溶解后，經(jīng)DEAE-52柱分離純化，用蒸餾水及0.1、0.3 mol/L氯化鈉溶液依次洗脫，得到3個(gè)多糖組分，分別為HPS-1、HPS-2、HPS-3，多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為96.44%、98.02%、95.20%。

2.2 rBMSCs細(xì)胞和ROBs細(xì)胞的分離培養(yǎng)

2.2.1 貼壁分離法體外培養(yǎng)rBMSCs細(xì)胞 SD大鼠脫頸椎處死，75%酒精浸泡消毒10 min，無(wú)菌剝離股骨和脛骨，剪去兩端骨骺，將DMEM/F12培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、1000 U/mL鏈霉素）注入骨髓腔并反復(fù)沖洗，收集細(xì)胞懸液，過(guò)200目細(xì)胞篩得到單細(xì)胞懸液。調(diào)整細(xì)胞密度為1×107/mL，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日更換培養(yǎng)基，之后每2天用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液洗滌3次，并更換培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%以上時(shí)，以0.25%胰蛋白酶消化傳代用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2.2 酶消解法體外分離培養(yǎng)ROBs細(xì)胞 新生SD大鼠乳鼠，75%酒精浸泡消毒10 min，無(wú)菌取顱骨，剔除血管和結(jié)締組織，無(wú)菌PBS沖洗2次，將顱骨剪碎至約1 mm3。碎骨片裝入無(wú)菌培養(yǎng)瓶中，加入胰蛋白酶（0.5 mg/mL）于37 ℃振蕩消化2次，10 min/次，棄去消化液；加入II型膠原酶（1 mg/mL）于37 ℃振蕩消化6次，15 min次。收集最后4次消化液，過(guò)200目細(xì)胞篩除去骨碎片，將單細(xì)胞懸液調(diào)整至細(xì)胞密度為3×104/mL，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中。于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日更換培養(yǎng)基，之后每2天用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液洗滌3次。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%以上時(shí)，以0.25%胰蛋白酶消化傳代用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)[6]。

2.3 藥物的配制

分別精密稱取HPS-1、HPS-2、HPS-3，溶解于培養(yǎng)基中，分別制成質(zhì)量濃度為1、5、10、20、50、100、200 μg/mL的溶液。

2.4 紅芪多糖對(duì)rBMSCs細(xì)胞和ROBs細(xì)胞增殖的影響

分別取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的rBMSCs細(xì)胞和ROBs細(xì)胞，以1×104/孔接種于96孔板，細(xì)胞貼壁后，分別加入100 μL HPS-1（5、10、20、50、100、200 μg/mL）、HPS-2（5、10、20、50、100、200 μg/mL）、HPS-3（5、10、20、50、100、200 μg/mL），對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h或48 h，避光加入10 μL MTT，孵育4 h，棄去培養(yǎng)基，加入100 μL DMSO，振蕩溶解結(jié)晶，用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處吸光度值。

2.5 紅芪多糖對(duì)rBMSCs細(xì)胞和ROBs細(xì)胞ALP活性的影響

分別取第1代rBMSCs細(xì)胞和ROBs細(xì)胞，以1×104/孔密度接種于12孔板，細(xì)胞生長(zhǎng)接近融合時(shí)，更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含1×10?8mol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 mg/L抗壞血酸），分別加入100 μL HPS-1（5、10、20、50、100、200 μg/mL）、HPS-2（5、10、20、50、100、200 μg/mL）、HPS-3（5、10、20、50、100、200 μg/mL），對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，每3天更換1次誘導(dǎo)培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)8 d后，按照ALP試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)ALP活性[7]。

2.6 紅芪多糖對(duì)rBMSCs細(xì)胞和ROBs細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)的影響

分別取第1代rBMSCs細(xì)胞和ROBs細(xì)胞，以1×104/孔密度接種于12孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)接近融合時(shí)，更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，rBMSCs細(xì)胞分別加入100 μL HPS-1（50 μg/mL）、HPS-2（50 μg/mL）、HPS-3（50 μg/mL），ROBs細(xì)胞分別加入100 μL HPS-1（20 μg/mL）、HPS-2（20 μg/mL）、HPS-3（20 μg/mL），對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，每3天更換1次培養(yǎng)液，連續(xù)培養(yǎng)12 d，采用選擇性結(jié)合鈣的茜素紅染色法檢測(cè)鈣化結(jié)節(jié)的形成情況，并使用Image-Pro Plus 6.0軟件統(tǒng)計(jì)鈣化結(jié)節(jié)染色陽(yáng)性區(qū)域的面積和數(shù)量。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 3種紅芪多糖對(duì)rBMSCs細(xì)胞和ROBs細(xì)胞增殖的影響

如表1所示，與對(duì)照組比較，20、50 μg/mL HPS-1顯著促進(jìn)rBMSCs和ROBs細(xì)胞增殖（＜0.05、0.01）；HPS-2和HPS-3對(duì)rBMSCs和ROBs細(xì)胞增殖沒(méi)有促進(jìn)作用，且200 μg/mL HPS-2顯著抑制rBMSCs細(xì)胞增殖（＜0.05、0.01），200 μg/mL HPS-3顯著抑制rBMSCs和ROBs細(xì)胞增殖（＜0.05、0.01）。

與對(duì)照組比較：*＜0.05**＜0.01，下表同

*< 0.05**< 0.01control group, same as below tables

3.2 3種紅芪多糖對(duì)rBMSCs細(xì)胞和ROBs細(xì)胞ALP活性的影響

ALP活性的提高是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的重要標(biāo)志。如表2所示，與對(duì)照組比較，50、100 μg/mL HPS-1顯著升高rBMSCs細(xì)胞中ALP活性（＜0.01），10、20、50 μg/mL HPS-1顯著升高ROBs細(xì)胞中ALP活性（＜0.05、0.01）；200 μg/mL HPS-2顯著降低rBMSCs細(xì)胞中ALP活性（＜0.01）；50 μg/mL HPS-3顯著升高rBMSCs細(xì)胞中ALP活性（＜0.05），50 μg/mL HPS-3顯著升高rBMSCs細(xì)胞中ALP活性（＜0.05），200 μg/mL HPS-3顯著降低rBMSCs細(xì)胞和ROBs細(xì)胞中ALP活性（＜0.05、0.01），100 μg/mL HPS-3顯著降低ROBs細(xì)胞中ALP活性（＜0.01）。

3.3 3種紅芪多糖對(duì)rBMSCs細(xì)胞和ROBs細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)形成的影響

鈣化結(jié)節(jié)的形成是成骨細(xì)胞成熟的標(biāo)志之一。如圖1所示，與對(duì)照組比較，HPS-1（50 μg/mL）顯著增加rBMSCs細(xì)胞中鈣化結(jié)節(jié)的數(shù)量和面積（＜0.01），HPS-2（50 μg/mL）顯著減少rBMSCs細(xì)胞中鈣化結(jié)節(jié)的數(shù)量（＜0.01），HPS-3對(duì)rBMSCs細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)的形成沒(méi)有影響。如圖2所示，與對(duì)照組比較，HPS-1顯著增加ROBs細(xì)胞中鈣化結(jié)節(jié)的數(shù)量（＜0.01），HPS-2和HPS-3對(duì)ROBs細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)的形成沒(méi)有影響。

4 討論

骨質(zhì)疏松癥是一種常見的系統(tǒng)性骨骼疾病，以骨密度降低和骨微觀結(jié)構(gòu)退化為特征，可導(dǎo)致骨骼無(wú)力、骨強(qiáng)度下降、骨脆性增加。國(guó)際骨質(zhì)疏松基金會(huì)預(yù)計(jì)，2020—2050年，中國(guó)患有骨質(zhì)疏松癥的人數(shù)為2.87億，骨量減少的人數(shù)可能高達(dá)5.33億[8]。骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制為多種因素促進(jìn)骨組織的吸收，同時(shí)抑制骨組織的形成，骨重建平衡遭到破壞，破骨細(xì)胞骨吸收大于成骨細(xì)胞骨形成作用，因此增強(qiáng)成骨細(xì)胞活性或誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向分化對(duì)骨質(zhì)疏松的防治具有重要意義[9-10]。

本研究探討了3種紅芪多糖（HPS-1、HPS-2、HPS-3）對(duì)rBMSCs細(xì)胞和ROBs細(xì)胞增殖、分化和礦化的影響，發(fā)現(xiàn)3種紅芪多糖（5、10、20、50 μg/mL）均不會(huì)對(duì)rBMSCs和ROBs細(xì)胞產(chǎn)生毒性，20、50 μg/mL HPS-1可促進(jìn)細(xì)胞增殖。ALP和鈣化結(jié)節(jié)可分別作為成骨分化早期和晚期的標(biāo)志，本研究表明HPS-1能明顯促進(jìn)2種細(xì)胞ALP活性和礦化結(jié)節(jié)的形成，HPS-2和HPS-3對(duì)2種細(xì)胞成骨分化沒(méi)有顯著促進(jìn)作用，甚至產(chǎn)生負(fù)性作用；50 μg/mL HPS-1對(duì)rBMSCs細(xì)胞的促進(jìn)作用較大，20 μg/mL HPS-1對(duì)ROBs細(xì)胞的促進(jìn)作用較大。課題組前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3種紅芪多糖均由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖5種單糖組成，但HPS-1主要由葡萄糖組成（87.41%），HPS-2和HPS-3主要由阿拉伯糖和半乳糖組成；HPS-2相對(duì)分子質(zhì)量最大，為1.420×105，HPS-3次之，HPS-1最小，為9.336×103；HPS-1的糖苷鍵為α構(gòu)型，HPS-2和HPS-3主要為β構(gòu)型[3]。因此，推測(cè)3種紅芪多糖對(duì)rBMSCs和ROBs細(xì)胞成骨分化活性的差異可能與其單糖基組成、相對(duì)分子質(zhì)量、結(jié)構(gòu)和構(gòu)象有關(guān)。綜上，HPS-1具有一定的成骨活性，具有潛在的增強(qiáng)骨骼強(qiáng)度的能力，為骨質(zhì)疏松的治療提供了新的思路。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effects of hedysarum polysaccharides on osteogenic differentiation of rBMSCs and ROBs

ZHAO Liang-gong1, 2, FANG Yao-yao3, LIU Xiao-hua3, FENG Shi-lan3

1. Gansu Provincial Key Laboratory of Bone and Joint Diseases, Lanzhou 730000, China 2. Lanzhou University Second Hospital, Lanzhou 730000, China 3. School of Pharmacy, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China

To investigate the effects of hedysarum polysaccharides (HPS-1, HPS-2, HPS-3) on promoting osteogenic differentiation of rat bone marrow stromal cells (rBMSCs) and rat calvarial osteoblasts (ROBs).MTT assay was used to detect the proliferation of rBMSCs and ROBs. Alkaline phosphatase (ALP) activity of rBMSCs and ROBs were detected by ALP kit. Mineralized nodule formation of rBMSCs and ROBs was detected by alizarin red S staining.HPS-1 (20, 50 μg/mL) significantly promoted the proliferation of rBMSCs (< 0.05, 0.01), HPS-1 (20 μg/mL) significantly promoted the proliferation of ROBs (< 0.01), HPS-2 and HPS-3 had no influence on promoting the proliferation of rBMSCs and ROBs. HPS-1 (50, 100 μg/mL) significantly increased ALP activity in rBMSCs (<0.01), HPS-1 (10, 20, 50 μg/mL) significantly increased ALP activity in ROBs (<0.05, 0.01), HPS-3 (50 μg/mL) significantly increased ALP activity in rBMSCs (<0.05). HPS-2 had no influence on increasing ALP activity in rBMSCs and ROBs. HPS-1 significantly increased the area and number of calcified nodules of rBMSCs and ROBs (<0.01), HPS-2 and HPS-3 had no influence on promoting the formation of calcified nodules of rBMSCs and ROBs.HPS-1 could enhance the cell activity and osteogenesis-related factor expression, and significantly promote the differentiation and mineralization of rBMSCs and ROBs cells.

hedysarum polysaccharides; osteogenic differentiation; bone marrow stromal cells; calvarial osteoblasts; alkaline phosphatase

R285.5

A

0253 - 2670(2021)02 - 0432 - 05

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.02.016

2020-07-10

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81703664）

趙良功（1986—），男，博士，主治醫(yī)師，從事骨關(guān)節(jié)退行性疾病的治療。E-mail: Lzxtj2008@hotmail.com

封士蘭（1957—），博士，教授，從事中草藥及中藥制劑中化學(xué)成分分離分析研究。E-mail: fengshl@lzu.edu.cn

[責(zé)任編輯 李亞楠]