乳酸菌發(fā)酵藍(lán)莓乳清混合體系體外抗氧化特性分析

王文瓊，孫志勇,2，黃冬成，張杰龍，張志賢，李穎，魯茂林，顧瑞霞

（1.揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇乳品生物技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州 225127）

（2.江蘇新美星包裝機(jī)械股份有限公司，江蘇張家港 215618）

（3.黑龍江大三源乳品機(jī)械有限公司，黑龍江哈爾濱 150069）

氧化損傷是人體衰老的主要原因，另外其還可引起高血脂、糖尿病及心腦血管疾病等多種疾病[1]。大量研究表明，乳酸菌具有較強(qiáng)的抗氧化能力，能夠改善人體腸道內(nèi)的活性氧分子變化，清除氧化應(yīng)激產(chǎn)生的多種自由基[2,3]。藍(lán)莓中的花青素，多酚類物質(zhì)具有很強(qiáng)的抗氧化性，藍(lán)莓果汁經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵后，花青素含量提高 15.38%，抗氧化能力顯著提高[4]。同時有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后果蔬制品的抗氧化能力顯著增強(qiáng)，這是由于乳酸菌在發(fā)酵過程中能夠水解一些結(jié)合酚，釋放游離酚，提高其生物利用率，從而提高抗氧化能力。乳清蛋白經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵后會產(chǎn)生大量的功能性多肽，具有 ACE抑制活性，抗氧化等功能。研究表明蛋白對花色苷的熱穩(wěn)定性和光穩(wěn)定性具有一定的保護(hù)作用。近年來，藍(lán)莓發(fā)酵提高抗氧化的研究很多，乳酸菌發(fā)酵對于花青素的保護(hù)作用是不容置疑的，乳酸菌發(fā)酵可以維持底物基質(zhì)中的酸性環(huán)境，這對于酚類物質(zhì)及花青素都有著積極的保護(hù)作用[5,6]。然而，乳清蛋白與藍(lán)莓果汁中酚類物質(zhì)的相互作用對體系抗氧化性造成影響，所以提高和穩(wěn)定藍(lán)莓乳清發(fā)酵體系的抗氧化性是目前需要解決的技術(shù)難題。

本課題組前期利用乳酸菌對乳清蛋白與藍(lán)莓果汁混合物進(jìn)行發(fā)酵，利用微生物發(fā)酵產(chǎn)酸，降低發(fā)酵體系pH，保持多酚活性，維持體系顏色穩(wěn)定，同時利用乳酸菌發(fā)酵作用促進(jìn)藍(lán)莓果漿中活性成分與乳清蛋白對接，產(chǎn)生蛋白-多酚和花色苷復(fù)合物提高飲料體系的抗氧化能力[7]。本研究采用乳清蛋白藍(lán)莓果汁體系為原料，考察嗜熱鏈球菌，保加利亞乳桿菌以及嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的混合菌種（以下簡稱混合菌種）分別發(fā)酵24、36、48 h后體系還原能力，羥自由基清除能力，總抗氧化能力，DPPH·清除能力，超氧陰離子清除能力以及抗脂質(zhì)過氧化能力。旨在以藍(lán)莓乳清為原料通過乳酸菌發(fā)酵使酚酸類物質(zhì)發(fā)生脫羧和還原，提高酚酸類物質(zhì)在人體內(nèi)的消化和吸收率。同時，利用乳酸菌水解蛋白，增強(qiáng)蛋白質(zhì)分子與藍(lán)莓花青素分子之間以親水和疏水作用相互結(jié)合，從而對其分子穩(wěn)定性起到保護(hù)作用[8]。將蛋白和多酚的結(jié)合物水解為游離酚，提高藍(lán)莓乳清飲料體系的抗氧化性，為藍(lán)莓乳清混合飲料的研發(fā)與工藝優(yōu)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品準(zhǔn)備

①原料的篩選：選擇果實(shí)飽滿，已經(jīng)成熟的藍(lán)莓果（2018成熟的大興安嶺野生藍(lán)莓 51°55′ N，124°34′ E），摘除果柄、枝葉，剔除病蟲害、變色、變質(zhì)等質(zhì)量不合格的藍(lán)莓果，并用清水清洗干凈。

②榨汁：將清洗干凈的藍(lán)莓果，晾干，取藍(lán)莓100 g，加水榨汁。

③過濾：將藍(lán)莓漿液先用200目紗布單層過濾，再用兩層紗布過濾，過濾液600 mL，分裝50 mL。

④調(diào)配：向過濾完的藍(lán)莓中加入去離子水，使得藍(lán)莓與水的比例為1:5。

⑤加入乳清粉：向調(diào)配液中加入 6%的乳清蛋白。

⑥加入6%蔗糖。

⑦調(diào)pH：將樣品液pH調(diào)至7.0。

⑧滅菌：將配置成的藍(lán)莓乳清蛋白飲料置于95 ℃水浴鍋水浴滅菌5 min。

⑨接菌發(fā)酵：接入保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌（上海昊岳食品科技有限公司提供）以及混合菌種（保加利亞乳桿菌:嗜熱鏈球菌=1:1），接種量為2%（活菌數(shù)為7 log cfu/mL），樣品置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)。

1.2 還原能力的測定

取樣品0.5 mL，加入2.5 mL磷酸鹽緩沖液（濃度為0.2 mol/L，pH值為6.6）和2.5 mL的1%鐵氰化鉀溶液，混合均勻。再將混合物在 50 ℃下水浴 20 min后冷卻，加入2.5 mL的三氯乙酸溶液（體積分?jǐn)?shù)10%），然后將混合物在5500 r/min下離心10 min。取2.5 mL上層清液，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL的0.1%的氯化鐵溶液，混合均勻，放置 10 min后，在700 nm 處測定其吸光值[9]。實(shí)驗(yàn)用壞血酸作為對照組，重復(fù)3次，吸光度值越大，飲料還原能力越強(qiáng)。

還原能力=Ai-Aj

式中：Ai為加樣品的吸光度；Aj為以水代替清除劑時的吸光度。

1.3 羥自由基清除能力測定

向試管中加入樣品（樣品用去離子水稀釋至 200 mg/mL）1.00 mL，溶液（濃度為10 mmol/L）1.00 mL，水楊酸-乙醇（濃度為10 mmol/L）1.00 mL，最后加1.00 mL（體積分?jǐn)?shù) 0.03%）啟動反應(yīng)，振蕩混合，水浴37 ℃，保溫30 min，5500 r/min離心7 min，在波長510 nm下測量吸光度值[10]。

式中：As為加樣品的吸光度；Ac為不加清除劑時吸光度；A0為以水代替樣品的吸光度。

1.4 ABTS+自由基測定

（1）ABTS+自由基儲備液的制備

用蒸餾水將 ABTS+·和高硫酸鉀分別溶解并混合，使其終濃度分別為7 mmol/L和2.45 mmol/L，在室溫、避光條件下放置12～16 h，形成ABTS+自由基儲備液。使用前用 60%乙醇或磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L，pH 7.4)稀釋ABTS+自由基儲備液，使其在波長405 nm處吸光度為0.700±0.020，此為ABTS+·工作液。配濃度為0～750 μmol/L的Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液，0.1 mL不同濃度的Trolox溶液與3.90 mL ABTS+·工作液充分混合，反應(yīng)10 min后，于734 nm波長處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）樣品的測定

將樣品稀釋至 200 mg/mL，使其對ABTS+·工作液產(chǎn)生 20%～80%的抑制率。精確吸取樣品稀釋液0.10 mL，加入3.90 mL ABTS+·工作液充分混合，在30 ℃反應(yīng)10 min后，于405 nm波長處測定吸光度，以蒸餾水作為空白對照。樣品的 ABTS+自由基清除能力用 TEAC 值（Trolox equivalent antioxidant capacity）表示[11]。

1.5 DPPH自由基清除能力的測定

將樣品稀釋到200 mg/mL濃度，取樣液1.0 mL及4.00 mL濃度為0.12 mmol/L的DPPH·乙醇溶液（乙醇體積分?jǐn)?shù)95%），混勻，室溫下避光反應(yīng)30 min，如有沉淀可在5500 r/min條件下離心5 min。用體積分?jǐn)?shù)為 95%乙醇溶液作參比，于 517 nm測定吸光值。根據(jù)下式計算每種樣品液對DPPH自由基的清除率[12]：

式中：Ai為加樣品液后DPPH·溶液的吸光值；Aj為樣品液的吸光值；Ac為未加樣品液時DPPH·溶液的吸光值。

1.6 抗脂質(zhì)過氧化能力測定

用硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）比色法測定樣品中丙二醛含量（代表脂質(zhì)過氧化反應(yīng)程度）[13]。卵黃懸液：新鮮雞蛋去除蛋清，卵黃用等體積pH 7.45，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）配成1:1（m/m）懸液，磁力攪拌10 min，再用PBS稀釋成1:25（m/m）的懸液，冷藏備用。測定方法：在離心管中依次加入 40 μL卵黃懸液，10 μL不同質(zhì)量濃度樣品溶液，40 μL 25 mmol/L FeSO4，310 μL PBS（0.1 mol/L，pH 7.45），混勻于37 ℃恒溫振蕩15 min，取出后加入100 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的三氯乙酸溶液和100 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%的TBA溶液，沸水浴15 min，冷卻后，3500 r/min離心10 min，吸取上清液，于 532 nm波長處測定MDA-TBA復(fù)合物吸光度，按下列式子計算抑制率。

式中：A樣為加樣品吸光度；A1為空白管吸光度，以水代替樣品液。

1.7 超氧陰離子自由基的清除能力的測定

采用鄰苯三酚法，在試管中加入Tris-HCl緩沖溶液（50 mmol/L pH 8.2）9 mL，加入樣品（用去離子水稀釋至0.2 mg/mL）0.6 mL，混合均勻，于25 ℃恒溫水浴鍋中加熱15 min后，加入25 ℃鄰苯三酚溶液（以10 mmol/L HCL為溶劑配置成7.5 mmol/L）0.2 mL，混合均勻，于325 nm處測定吸光度，3 min后再次測定吸光度，計算差值記為 ΔA。將樣品溶液替換為水，其他操作同上，計算差值記為ΔA0[14]。實(shí)驗(yàn)采用抗壞血酸作對照組。根據(jù)下列公式計算樣品O2-·清除率。

式中：ΔA：加入樣品溶液后 3 min內(nèi)吸光度增加值；ΔA0：以水替代樣品溶液3 min內(nèi)吸光度增加值。

1.8 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

每個試驗(yàn)重復(fù) 3次，結(jié)果表示為平均值±偏差。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS 11.5軟件（p<0.05表示差異顯著，p>0.05表示差異不顯著），采用Origin 8.5畫圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 還原能力

由圖1可知，在發(fā)酵前，乳清蛋白藍(lán)莓果汁體系的還原能力比藍(lán)莓強(qiáng)，藍(lán)莓的還原能力比乳清蛋白強(qiáng)[15]，主要是藍(lán)莓中含有酚類化合物，如黃烷醇、單寧、花青素等具有較強(qiáng)抗氧化活性[16]。另外，乳清蛋白與多酚形成的結(jié)合物具有抗氧化性[17]。乳清蛋白在不接菌，接入嗜熱鏈球菌（發(fā)酵24、36、48 h），接入保加利亞乳桿菌（發(fā)酵24、36、48 h），和接入混合菌種（發(fā)酵0、24、36、48 h）時還原能力差異不顯著（p＞0.05）。

圖1 乳清蛋白藍(lán)莓體系發(fā)酵時間對還原能力的影響Fig.1 The effect of fermentation time on the reducing power of whey protein and blueberry beverage

接種嗜熱鏈球菌的乳清蛋白藍(lán)莓果汁體系在發(fā)酵24、36、48 h時還原能力均顯著高于接種嗜熱鏈球菌的藍(lán)莓和接種嗜熱鏈球菌的乳清蛋白。接種嗜熱鏈球菌的乳清蛋白藍(lán)莓果汁體系在發(fā)酵24、36、48 h時還原能力均高于接種保加利亞乳桿菌和混合菌種的乳清蛋白藍(lán)莓果汁發(fā)酵體系。因此嗜熱鏈球菌發(fā)酵有利于乳清蛋白藍(lán)莓果汁體系中抗氧化活性成分的保持和提高。有研究發(fā)現(xiàn)乳酸發(fā)酵更有利于天然產(chǎn)物中抗氧化活性成分的保持[18]。接種保加利亞乳桿菌的乳清蛋白藍(lán)莓果汁發(fā)酵體系在發(fā)酵24 h和36 h時還原能力顯著高于接種保加利亞乳桿菌的藍(lán)莓和接種保加利亞乳桿菌的乳清蛋白，在發(fā)酵48 h時還原能力低于乳清蛋白，藍(lán)莓單獨(dú)發(fā)酵。接種混合菌種的乳清蛋白藍(lán)莓果汁發(fā)酵體系在發(fā)酵24 h和36 h時還原能力顯著高于接種混合菌種的藍(lán)莓和接種混合菌種的乳清蛋白，在發(fā)酵48 h時還原能力低于藍(lán)莓，乳清蛋白單獨(dú)接種混合菌種。因此，相比于接種保加利亞乳桿菌和混合菌種，接種嗜熱鏈球菌的乳清蛋白藍(lán)莓果汁發(fā)酵體系還原能力最高，發(fā)酵24 h時還原能力低于發(fā)酵36 h，而發(fā)酵36 h與發(fā)酵48 h時還原能力差異不顯著。

2.2 羥自由基清除能力

相關(guān)研究表明乳酸菌在生長繁殖過程中不同程度地提高發(fā)酵產(chǎn)品的自由基清除能力[18]。另外，乳酸菌在生長過程中能夠產(chǎn)生多種酶類，通過這些酶的轉(zhuǎn)化作用可以將結(jié)合態(tài)酚酸分解為游離態(tài)酚酸，提高發(fā)酵原料中酚酸類化合物的生物利用度及抗氧化性[19]。前期研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后花色苷含量約為 150～250 mg/100 g樣品，總酚含量為6 mg/100 g樣品，并且不同發(fā)酵時間，花色苷和總酚含量變化顯著[7]。

接入嗜熱鏈球菌的藍(lán)莓果汁在發(fā)酵36 h時羥自由基清除能力高于發(fā)酵前，而發(fā)酵24 h和發(fā)酵48 h時，羥自由基清除能力與發(fā)酵前差異不顯著。接入保加利亞乳桿菌的藍(lán)莓果汁在發(fā)酵24 h時羥自由基清除能力與發(fā)酵前相比降低28.80%，發(fā)酵36 h時羥自由基清除能力提高了8.98%，但仍比發(fā)酵前低19.82%，發(fā)酵48 h時羥自由基清除能力顯著提高（p<0.05），比發(fā)酵前高5.80%。接入混合菌種的藍(lán)莓果汁在發(fā)酵24 h時羥自由基清除能力與發(fā)酵前相比顯著降低，降低了32.13%。發(fā)酵 36 h時羥自由基清除能力提高15.31%，但仍比發(fā)酵前低16.81%，發(fā)酵48 h時羥自由基清除能力進(jìn)一步提高，提高了 20.75%。與發(fā)酵前相比差異不顯著（p>0.05）。接入嗜熱鏈球菌的藍(lán)莓果汁在發(fā)酵24 h與發(fā)酵36 h時羥自由基清除能力高于接入保加利亞乳桿菌和混合菌種的藍(lán)莓果汁，而在發(fā)酵48 h時顯著降低（p<0.05）。Vinderola[20]等研究表明，德氏保加利亞乳桿菌對嗜熱鏈球菌菌株表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑制作用。所以，在接入乳酸菌的藍(lán)莓果汁中，接入嗜熱鏈球菌的藍(lán)莓果汁在發(fā)酵36 h時羥自由基清除能力最強(qiáng)。

圖2 乳清蛋白藍(lán)莓體系發(fā)酵時間對羥自由基清除能力的影響Fig.2 The effect of fermentation time on the scavenging capacity of hydroxyl radicals of whey protein and blueberry beverage

由圖2可知，接入嗜熱鏈球菌的乳清蛋白藍(lán)莓果汁混合飲料的羥自由基清除能力在發(fā)酵24 h和48 h時顯著低于接入嗜熱鏈球菌的乳清蛋白和接入嗜熱鏈球菌的藍(lán)莓果汁，在發(fā)酵36 h時略高于接入嗜熱鏈球菌的乳清蛋白，顯著低于接入嗜熱鏈球菌的藍(lán)莓果汁。原因是乳清蛋白水解后可得到含有抗氧化能力的活性多肽，具備一定的抗氧化能力，藍(lán)莓中的黃酮類化合物與蛋白質(zhì)之間主要是非共價結(jié)合（如氫鍵、疏水作用），與蛋白質(zhì)的疏水性位點(diǎn)結(jié)合，蛋白質(zhì)結(jié)會發(fā)生改變，黃酮類化合物含量減少，最終使得羥自由基清除能力減弱[21]。

2.3 ABTS+自由基清除能力

圖3 乳清蛋白藍(lán)莓體系發(fā)酵時間對總抗氧化能力的影響Fig.3 Effect of fermentation time of whey protein blueberry system on total antioxidant capacity

由圖 3可知，乳清蛋白藍(lán)莓果體系發(fā)酵前ABTS+·清除能力最高，乳清蛋白 ABTS+自由基清除能力最低。以不接菌的藍(lán)莓汁為參照，接入嗜熱鏈球菌的藍(lán)莓汁在發(fā)酵24 h時，ABTS+自由基清除能力提高，發(fā)酵36 h時ABTS+自由基清除能力顯著下降，發(fā)酵48 h時ABTS+自由基清除能力無顯著差異。接入保加利亞乳桿菌的藍(lán)莓汁在發(fā)酵 24、36、48 h時ABTS+自由基清除能力均高于發(fā)酵前，且清除能力為發(fā)酵36 h＞發(fā)酵24 h＞發(fā)酵48 h。接入混合菌種的藍(lán)莓汁在發(fā)酵24、36、48 h時ABTS+自由基清除能力均高于發(fā)酵前，且清除能力為發(fā)酵36 h＞48 h＞24 h。與不接菌的乳清蛋白藍(lán)莓混合體系相比，接入嗜熱鏈球菌，保加利亞乳桿菌，混合菌種發(fā)酵乳清蛋白藍(lán)莓果體系總抗氧化性有所降低，但仍具有較強(qiáng)抗氧化能力，原因是總酚和總黃酮具有較高的抗氧化活性[7]，而飲料中接入的乳酸菌可將簡單的酚類物質(zhì)轉(zhuǎn)化，也可解聚大分子酚類化合物，可能導(dǎo)致了發(fā)酵過程中的總酚和總黃酮含量降低[22]。

未接菌的藍(lán)莓乳清混合體系 ABTS+自由基清除能力高于未接菌的藍(lán)莓汁和未接菌的乳清蛋白。由于空氣氧化導(dǎo)致花色苷等酚類物質(zhì)降解，而藍(lán)莓乳清蛋白飲料中乳清蛋白的包裹和結(jié)合作用反而對花色苷等多酚類物質(zhì)起到了穩(wěn)定和保護(hù)作用，使其含量高于藍(lán)莓果汁[23]。由圖3可知，在乳清中添加藍(lán)莓，通過乳酸菌發(fā)酵后 ABTS+自由基清除能力高于乳清蛋白單獨(dú)發(fā)酵，在發(fā)酵24 h時，接入嗜熱鏈球菌，保加利亞乳桿和混合菌種的藍(lán)莓乳清比接入相同菌種的乳清蛋白清除能力分別高14.22%、14.31%和11.71%，在發(fā)酵36 h時，接入嗜熱鏈球菌，保加利亞乳桿菌和混合菌種的藍(lán)莓乳清比接入相同菌種的乳清蛋白清除能力分別提高27.37%、11.65%和15.78%。在發(fā)酵48 h時接入嗜熱鏈球菌，保加利亞乳桿菌和混合菌種的藍(lán)莓乳清比接入相同菌種的乳清蛋白清除能力分別高34.66%、30.87%和25.25%。在發(fā)酵24 h時接入嗜熱鏈球菌，保加利亞乳桿菌和混合菌種的藍(lán)莓乳清混合體系的 ABTS+自由基清除能力比接入相同菌種的藍(lán)莓汁分別低 9.10%、19.45%和 20.77%，比接入相同菌種的乳清蛋分別要高14.22%、14.31%和11.71%，主要是是在乳酸菌的作用下，乳清蛋白結(jié)構(gòu)、組成和含量隨著發(fā)酵狀態(tài)發(fā)生相應(yīng)的改變，使得其無法發(fā)揮包裹和結(jié)合作用，花色苷等多酚物質(zhì)失去乳清的保護(hù)，含量變低從而使得 ABTS+自由基清除能力變低。因此，在乳清蛋白藍(lán)莓混合體系中，接入保加利亞乳桿菌發(fā)酵36 h時ABTS+自由基清除能力最好。

2.4 DPPH自由基清除能力

圖4 乳酸菌發(fā)酵乳清蛋白藍(lán)莓果汁體系DPPH清除能力Fig.4 Lactic acid bacteria fermentation system of whey protein blueberry juice DPPH scavenging capacity

由圖4可知，藍(lán)莓不接菌，乳清不接菌和藍(lán)莓乳清不接菌相比，接入藍(lán)莓的乳清飲料DPPH清除能力有顯著提高。說明藍(lán)莓和乳清混合之后比單一的藍(lán)莓果汁和單一的乳清蛋白 DPPH·清除能力更強(qiáng)，原因是乳清蛋白與藍(lán)莓多酚結(jié)合后產(chǎn)生的復(fù)合物具備較強(qiáng)的自由基清除能力。接菌的藍(lán)莓乳清發(fā)酵體系與藍(lán)莓乳清不接菌相比，DPPH自由基清除能力有所降低，而在發(fā)酵48 h時接入嗜熱鏈球菌，保加利亞乳桿菌，混合菌種的藍(lán)莓乳清發(fā)酵飲料 DPPH·清除能力最低。有研究發(fā)現(xiàn)，果蔬飲料在發(fā)酵過程中可能由于黃酮類物質(zhì)的不穩(wěn)定性和發(fā)酵過程中產(chǎn)生了分解酚類物質(zhì)的酶，使得清除自由基的活性物質(zhì)減少，從而降低了混合發(fā)酵體系的DPPH自由基清除能力[24]。接入嗜熱鏈球菌，保加利亞乳桿菌，混合菌種的藍(lán)莓乳清發(fā)酵飲料在發(fā)酵24 h時，DPPH自由基清除能力均高于60%，清除能力較強(qiáng)。從圖中可以看出，在藍(lán)莓乳清發(fā)酵體系中，接入嗜熱鏈球菌發(fā)酵24 h時DPPH自由基清除能力最高，達(dá)到63.01%。

2.5 超氧陰離子清除能力

圖5 乳酸菌發(fā)酵乳清蛋白藍(lán)莓果汁體系超氧陰離子自由基清除能力Fig.5 Lactic acid bacteria fermentation system of whey protein blueberry juice superoxide anion radical scavenging capacity

由圖5可知，在發(fā)酵24 h時，接入乳酸菌的藍(lán)莓果汁O2-·清除能力均大于80%，而未接菌的藍(lán)莓果汁O2-·清除能力為58%，數(shù)據(jù)表明發(fā)酵24 h時的藍(lán)莓果汁O2-·清除能力顯著提高。原因是乳酸菌在藍(lán)莓汁中生長繁殖，改變了藍(lán)莓的營養(yǎng)物質(zhì)。發(fā)酵后的藍(lán)莓汁O2-·清除能力得到提高[25]。接入嗜熱鏈球菌，保加利亞乳桿菌，混合菌種在發(fā)酵 24 h時分別提高23.53%、29.74%和26.70%，但發(fā)酵36 h和48 h時超氧陰離子自由基清除能力顯著下降，與發(fā)酵 24 h相比，接入嗜熱鏈球菌，保加利亞乳桿菌，混合菌種在36 h清除能力分別降低48.89%、69.94%和40.53%，在48 h時分別降低65.57%、78.81%和80.90%，說明藍(lán)莓果汁長時間發(fā)酵會降低其抗氧化能力。與未接菌的乳清相比，接菌的乳清發(fā)酵液O2-·清除能力更強(qiáng)。與未接菌的藍(lán)莓乳清相比，接入嗜熱鏈球菌，保加利亞乳桿菌和混合菌種的乳清在24 h時的清除能力分別提高34.98%、30.07%和20.22%，與未接菌的藍(lán)莓乳清相比，接入嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的藍(lán)莓乳清發(fā)酵飲料O2-·清除能力均有顯著提高，在24 h時分別提高32.98%和22.57%（p<0.05），在36 h時分別提高 6.85%和 18.42%，在 48 h時分別提高 1.5%和3.98%。原因是在發(fā)酵過程中，由于乳酸菌將乳清蛋白水解成多肽，氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)釋放出來，這些基團(tuán)具有電子供體作用，能夠與超氧陰離子自由基反應(yīng)，從而提高了O2-·清除能力[26]。因此，在接入乳酸菌的藍(lán)莓乳清發(fā)酵體系中，嗜熱鏈球菌發(fā)酵24 h時O2-·清除能力最好。

2.6 抗脂質(zhì)過氧化能力

圖6 乳酸菌發(fā)酵乳清蛋白藍(lán)莓果汁體系抗脂質(zhì)過氧化能力Fig.6 The lipid peroxidation ability of lactic acid bacteria fermented whey protein blueberry juice system

由圖 6可知，接入嗜熱鏈球菌，保加利亞乳桿菌，混合菌種的藍(lán)莓汁在24、36和48 h抗脂質(zhì)過氧化能力均高于未接菌的藍(lán)莓汁，說明藍(lán)莓果汁經(jīng)發(fā)酵后抗脂質(zhì)過氧化能力得到提高。與未接菌的藍(lán)莓乳清相比，接入混合菌種的藍(lán)莓果汁發(fā)酵體系在24 h時抗脂質(zhì)過氧化能力顯著提高，達(dá)到了 31.30%，提高了24%；接入保加利亞乳桿菌的藍(lán)莓乳清發(fā)酵體系抗脂質(zhì)過氧化能力也有所提高，增長了8.60%。接入嗜熱鏈球菌的藍(lán)莓乳清發(fā)酵體系在發(fā)酵36 h時抗脂質(zhì)過氧化能力最高，而在24 h和48 h時，與未接菌藍(lán)莓乳清相比差異不顯著（p>0.05）。經(jīng)保加利亞乳桿菌和混合菌種發(fā)酵24 h的乳清蛋白和藍(lán)莓乳清發(fā)酵體系抗脂質(zhì)過氧化能力均有顯著提高（p<0.05），而采用混合菌種發(fā)酵時抗脂質(zhì)過氧化能力最高，原因是保加利亞乳桿菌發(fā)酵后產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物能夠防止亞油酸被氧化，而嗜熱鏈球菌所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物對保加利亞乳桿菌的生長繁殖有促進(jìn)作用[27]。所以藍(lán)莓乳清發(fā)酵體系的發(fā)酵菌種選用混合菌種，發(fā)酵時24 h時，抗脂質(zhì)過氧化能力達(dá)最高。

4 結(jié)論

本研究選用保加利亞乳桿菌，嗜熱鏈球菌及其混合菌種對乳清蛋白藍(lán)莓混合體系進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果表明盡管蛋白-多酚的作用會降低多酚類物質(zhì)的體外抗氧化活性，但隨乳酸菌發(fā)酵有助于藍(lán)莓及藍(lán)莓乳清混合體系抗氧化能力的保持。單獨(dú)采用嗜熱鏈球菌發(fā)酵藍(lán)莓乳清體系36 h時的還原能力最強(qiáng)，羥自由基清除能力最強(qiáng)；單獨(dú)采用保加利亞乳桿菌發(fā)酵藍(lán)莓乳清體系36 h時ABTS+·清除能力最強(qiáng)；單獨(dú)采用嗜熱鏈球菌發(fā)酵藍(lán)莓乳清體系24 h時O2-·清除能力和DPPH自由基最強(qiáng)；采用混合菌種發(fā)酵藍(lán)莓乳清體系24 h時抗脂質(zhì)過氧化能力最強(qiáng)。