不同品種紫蘇葉迷迭香酸的提取及其生物活性

任志清，李會(huì)珍，張志軍，N. Vasudeva Reddy，趙亞娜，李河

（中北大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，山西太原 030051）

紫蘇（Perilla frutescensL.）屬于薄荷屬唇形科植物，廣泛分布于中國、日本、韓國、印度和其他東南亞國家，在中國紫蘇被當(dāng)作油料作物種植，并被用于保健品和醫(yī)藥品方面的開發(fā)[1,2]。紫蘇葉中含有多種酚類化合物，例如迷迭香酸、咖啡酸、原兒茶酸、綠原酸及其衍生物，其中迷迭香酸含量最高[3,4]。迷迭香酸是一種水溶性多酚類化合物，具有較強(qiáng)的清除自由基的活性，同時(shí)具有抗炎、抑菌、抗腫瘤等功效。紫蘇葉是抗氧化劑的重要來源，它有助于減少自由基對人體的損傷，能夠降低脂質(zhì)過氧化和減少不良膽固醇，從而有助于血液的健康循環(huán)[5-7]。

據(jù)報(bào)道，紫蘇葉提取物中主要有迷迭香酸及其三種衍生物，包括迷迭香酸甲酯，迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷和3’O-脫羥-迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷[8,9]。迷迭香酸的抗氧化能力強(qiáng)于維生素E，并且迷迭香酸能與脂質(zhì)過氧基結(jié)合，從而降低脂質(zhì)過氧化。迷迭香酸因其較強(qiáng)的抗氧化能力，在食品領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用市場[10]，迷迭香酸能夠通過增強(qiáng)膜的通透性來抑制細(xì)菌和真菌的生長代謝[11]。目前，已經(jīng)利用紫蘇提取物研制出的藥品、化妝品、飲料、食用油等產(chǎn)品[12,13]，被廣泛用于治療抑郁癥[14]、過敏、哮喘、咳嗽和蛀牙[15,16]。

隨著人們生活水平的提高，消費(fèi)者更加追求優(yōu)質(zhì)食品，因此提高食品營養(yǎng)價(jià)值和延緩食品的氧化所導(dǎo)致的腐敗就成為研究的熱點(diǎn)。作為一種天然抗氧化劑，迷迭香酸可以延緩食品氧化，提高食品穩(wěn)定性[17]，例如已經(jīng)應(yīng)用于沙棘果酒的發(fā)酵[18]；此外，它還具有抗菌活性，可以很好地代替化學(xué)合成型防腐劑，用于食品保鮮防腐[19]，在食品領(lǐng)域具有廣闊的市場前景和現(xiàn)實(shí)意義[20]。目前，對于不同品種紫蘇葉中迷迭香酸在食品方面的研究較少，本文主要研究不同品種紫蘇葉中迷迭香酸含量及其抗氧化性和抑菌性，以期為天然抗氧化產(chǎn)品和食品防腐的利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料：紫蘇葉，不同紫蘇品種由課題組按產(chǎn)地命名編號，均種植于中北大學(xué)試驗(yàn)田，清洗葉片表面，于無陽光直射且通風(fēng)處陰干至恒重，粉碎過80目篩，保存?zhèn)溆茫?5個(gè)紫蘇品種信息見表1。

試劑：迷迭香酸標(biāo)品（HPLC級，≥98%）：成都普菲德生物技術(shù)有限公司；DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）：美國 Sigma公司；ABTS（2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）：美國Sigma公司；XDA-8大孔樹脂：天津歐瑞生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

表1 紫蘇品種信息表Table 1 Information of perillavariety

1.2 儀器與設(shè)備

BJ-400型高速多功能粉碎機(jī)：北京普朗新技術(shù)科學(xué)儀器有限公司；SB-5200 DTDN超聲波清洗機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；TDL-5-A高速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；RE-52 AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；中壓制備液相色譜（配有二元溶劑輸送泵、UV檢測器、自動(dòng)流份收集器）：瑞典Biotage公司；Agilent 1260高效液相色譜（Zorbax Eclipse XDA-C18 150×4.6 mm，5 μm column）：美國Agilent 公司；SPX-150 B-Z生化培養(yǎng)箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；LDZX-75 KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；7220 N可見分光光度計(jì)：上海菁華科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紫蘇葉水提物的制備

參考薛姣[21]的方法并進(jìn)一步優(yōu)化制備紫蘇葉活性物質(zhì)。分別稱取不同品種紫蘇葉粉末20.00 g，按照料液比1:20加入蒸餾水，超聲功率為300 W，超聲溫度為45 ℃，提取30 min。提取完成后5000 r/min，離心15 min，取上清液真空減壓濃縮，濃縮液經(jīng)冷凍干燥，得到紫蘇葉提取物，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 迷迭香酸含量的測定

參考李榮貴等[22]的方法測定紫蘇葉提取物中迷迭香酸的含量。精確稱取1.00 mg迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)品，溶于10 mL乙醇中，經(jīng)稀釋得到不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。配制5 mL反應(yīng)體系：4 mL 0.10 mol/L NaAc緩沖液（pH為6.0），0. 03 mL 0.2 mol/L現(xiàn)配FeSO4溶液，0.2 mL樣品溶液，0.77 mL蒸餾水，充分混勻，室溫暗反應(yīng)5 min，在568 nm下測其吸光度值。以迷迭香酸的濃度、吸光度值分別為橫、縱坐標(biāo)，繪制迷迭香酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0000.4x+0.001，相關(guān)系數(shù)R2=0.9993，可知吸光度值與迷迭香酸含量有極好的線性關(guān)系。樣品溶液采用同樣的方法測定其吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算迷迭香酸含量，每個(gè)樣品重復(fù)三次，取平均值。計(jì)算公式如下：

1.3.3 大孔樹脂柱色譜純化紫蘇迷迭香酸

參考薛姣[23]的方法經(jīng)進(jìn)一步優(yōu)化。選用 XDA-8型大孔樹脂濕法裝柱，柱體積為25 mL，將樣品配制成 5.00 mg/mL的溶液進(jìn)行上樣，吸附流速為 2.00 BV/h，當(dāng)流出液的濃度為上樣濃度的 1/10時(shí)停止上樣；先用鹽酸水溶液（pH 3.0）進(jìn)行洗脫，至流出液無色時(shí)停止洗脫，最后用70%乙醇進(jìn)行洗脫，洗脫流速為1.00 BV/h，洗脫劑用量12 BV，分段收集，當(dāng)洗脫液的濃度保持不變時(shí)，停止洗脫，收集合并洗脫液，45 ℃烘24 h得紫蘇水提物，備用。

1.3.4 中壓制備色譜富集紫蘇迷迭香酸

配制迷迭香酸濃縮液上樣，以體積分?jǐn)?shù)為0.1%的冰乙酸（A）和甲醇（B）為流動(dòng)相，檢測波長為320 nm。按表2中條件進(jìn)行洗脫，根據(jù)色譜峰收集流份。

將洗脫液通過HPLC進(jìn)一步檢測其主要成分，流動(dòng)相同上，進(jìn)樣量 10 μL，流速 1 mL/min，柱溫：35 ℃，進(jìn)樣程序見表3。

表2 中壓制備色譜洗脫梯度Table 2 The elution gradient of medium-pressure liquid chromatography

表3 HPLC進(jìn)樣程序Table 3 Sample injection procedure of HPLC

1.3.5 紫蘇迷迭香酸抗氧化能力的測定

對純化后樣品進(jìn)行抗氧化性測定。按照 Shimada等[24]的實(shí)驗(yàn)方法測定DPPH自由基的清除能力，在3 mL體系中分別加1 mL不同濃度樣品溶液（20.00、40.00、60.00、80.00、100.00 μg/mL）和 2 mL 1.00 mmol/mL DPPH自由基溶液，充分混勻3 min，室溫暗反應(yīng)30 min后，以無水甲醇為參比，在517 nm處測定樣品吸光度As，同時(shí)測定DPPH自由基溶液的吸光度Ac，每個(gè)濃度重復(fù)3次，取平均值。計(jì)算清除率公式如下：

根據(jù) Re等[25]的方法測定紫蘇迷迭香酸清除ABTS自由基的能力。將7.00 mmol/mL ABTS自由基溶液添加到2.45 mmol/mL過硫酸鉀中，在黑暗中反應(yīng)12～16 h，直到吸光度穩(wěn)定為止。該ABTS自由基陽離子溶液用 70%乙醇稀釋至在 734 nm處的吸光度為0.02～0.07。將0.9 mL的該溶液添加到0.1 mL的待測樣品溶液（20.00、40.00、60.00、80.00和100.00 μg/mL）中，并充分混合 45 s。將反應(yīng)溶液在黑暗中反應(yīng) 15 min，然后在734 nm處測定樣品吸光度At。同時(shí)測定ABTS溶液吸光度值A(chǔ)c，每個(gè)濃度重復(fù)3次，取平均值。清除率計(jì)算公式如下：

1.3.6 紫蘇迷迭香酸抑菌能力的測定

濾紙片法測定抑菌圈選取迷迭香酸含量最高的三個(gè)品種進(jìn)行抑菌性研究，將迷迭香酸配制成 1.25、2.50、5.00 mg/mL溶液，以5%苯甲酸鈉為陽性對照。將大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌分別于LB液體培養(yǎng)基中活化，當(dāng)吸光度值達(dá)到0.2～0.4時(shí)用生理鹽水將其稀釋成一定濃度的菌懸液。向每個(gè)加有固體培養(yǎng)基的平板各加入100 μL的菌懸液，涂布均勻后，于平板中等距放入4個(gè)直徑為6.00 mm無菌濾紙片，分別在濾紙片上滴加15 μL待測溶液，將平板于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h，測量其抑菌圈直徑[26]，每次試驗(yàn)做三個(gè)平行。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差統(tǒng)計(jì)分析（LSD，p＜0.05），除有特殊說明外，試驗(yàn)均進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示；采用Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫蘇葉片迷迭香酸含量與清除 DPPH自由基能力測定

不同品種紫蘇葉中迷迭香酸的含量如圖1所示，方差分析結(jié)果F值為282.79，p值為0.04＜0.05，所以不同品種紫蘇葉提取物中迷迭香酸的含量具有顯著性差異。由圖1可得不同紫蘇提取物中迷迭香酸含量變化范圍為4.69%～7.87%，ZY7-1、ZB3、DZ-1粗提物中迷迭香酸含量最高，分別為7.87%、7.34%、7.32%。含量最低的是HB，為4.69%，僅為ZY7-1的0.59倍。

圖1 不同品種紫蘇葉中迷迭香酸的含量Fig.1 Content of rosmarinic acid in leaves of different varieties of Perilla

圖2所示為不同品種紫蘇粗提取物清除DPPH自由基的IC50，F(xiàn)值為2430.94，p值為0.01＜0.05，所以不同品種間紫蘇葉提取物對DPPH自由基的清除率也具有顯著差異，由圖知ZY7-1、ZB3、DZ-1粗提取物對DPPH自由基的清除能力最強(qiáng)，IC50值分別為85.18 μg/mL、87.22 μg/mL 和88.45 μg/mL，而ZY10T的清除能力最弱，QY 次之，IC50分別為 110.36、105.86 μg/mL。

圖2 不同品種紫蘇迷迭香酸清除DPPH自由基的IC50Fig.2 The IC50 of different varieties of Perilla rosmarinic acid in scavenging DPPH free radicals

利用SPSS Statistics對迷迭香酸含量與DPPH自由基清除率進(jìn)行相關(guān)性分析（圖3），根據(jù)建立的模型得回歸方程為y=10.1546x+0.7711，相關(guān)系數(shù)R2為0.9963，呈顯著正相關(guān)（p＜0.05），故選取這三個(gè)品種進(jìn)行后續(xù)純化試驗(yàn)。

圖3 紫蘇迷迭香酸含量對提取物清除DPPH自由基能力的影響Fig.3 Effect of rosmarinic acid on DPPH free radical scavenging ability of Perilla extract

2.2 迷迭香酸的富集純化

經(jīng)大孔樹脂純化后，ZY7-1、ZB3、DZ-1提取物中迷迭香酸含量分別提高到37.30%、32.65%、32.02%。將純化后樣品通過中壓制備色譜進(jìn)行再次分離純化，經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)調(diào)整洗脫程序和參數(shù)，優(yōu)化洗脫工藝，確定上樣量為1 mL，上樣濃度為5 mg/mL，洗脫流速為15 mL/min，當(dāng)流速大于15 mL/min時(shí)色譜峰會(huì)出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。

圖4 紫蘇提取物的中壓制備色譜圖Fig.4 Chromatogram of medium-pressure preparation of rosmarinic acid standard and Perilla extract

圖4分別為三種紫蘇迷迭香酸的色譜圖，收集圖中ZY7-1峰2、ZB3峰3、DZ-1峰2的洗脫液，測定迷迭香酸含量分別為：59.28%、54.41%、51.13%，同時(shí)測定多酚含量為 76.62%、72.13%、70.43%，其中迷迭香酸分別占77.36%、75.43%、72.59%。

圖5 迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)品與洗脫液的HPLC圖Fig.5 HPLC of rosmarinic acid standard and eluent

進(jìn)一步通過HPLC檢測物質(zhì)成分，結(jié)果如圖5，與迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)品對照可知該流分主要物質(zhì)為迷迭香酸。

2.3 紫蘇葉迷迭香酸抗氧化能力的測定

2.3.1 紫蘇迷迭香酸對DPPH自由基的清除能力

DPPH能夠提供穩(wěn)定的自由基，當(dāng)反應(yīng)體系中存在抗氧化物質(zhì)時(shí)，溶液體系顏色逐漸變淺，從而根據(jù)吸光度值的大小可測定物質(zhì)的抗氧化能力[27,28]。迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)品做陽性對照，由圖6可知，純化后的三個(gè)紫蘇迷迭香酸對DPPH自由基的清除率均隨濃度的增加而增大，當(dāng)達(dá)到100 μg/mL時(shí)，清除率基本保持不變。當(dāng)濃度為 120.00 μg/mL時(shí)，迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)品、ZY7-1、ZB3、DZ-1對 DPPH 自由基清除率分別為94.25%、89.82%、82.65%、79.12%，IC50值分別為9.12、15.13、19.08、20.91 μg/mL，因此可知三個(gè)品種紫蘇迷迭香酸均具有一定的清除DPPH自由基的能力。

圖6 三個(gè)品種紫蘇迷迭香酸對DPPH自由基的清除率Fig.6 Scavenging rate of DPPH free radical by rosmarinic acid of three Perilla varieties

2.3.2 紫蘇迷迭香酸對ABTS自由基的清除能力

利用ABTS法測定物質(zhì)抗氧化性時(shí)，ABTS經(jīng)過硫酸鉀氧化后產(chǎn)生穩(wěn)定的藍(lán)綠色物質(zhì)-ABTS自由基，當(dāng)反應(yīng)體系存在抗氧化劑時(shí)，會(huì)與ABTS自由基結(jié)合，使溶液顏色變淺[29]。圖7結(jié)果顯示隨著濃度的增加三個(gè)樣品對ABTS自由基的清除率逐漸增大，但低于迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)品的清除率，當(dāng)濃度為120.00 μg/mL時(shí)，迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)品、ZY7-1、ZB3、DZ-1對ABTS自由基清除率分別為95.63%、87.08%、81.99%、80.23%。IC50值分別為 18.34、26.57、33.11、36.59 μg/mL，故三個(gè)品種紫蘇迷迭香酸均對ABTS自由基有一定的清除能力。

圖7 三個(gè)品種紫蘇迷迭香酸對ABTS自由基的清除率Fig.7 Scavenging rate of ABTS free radical by rosmarinic acid of three Perilla varieties

2.3.3 迷迭香酸含量與紫蘇葉提取物抗氧化性的相關(guān)性

從45個(gè)品種選取10個(gè)迷迭香酸含量較高的品種比較其清除不同自由基的IC50。從圖8可以看出，紫蘇葉提取物中迷迭香酸含量與清除 DPPH自由基、ABTS自由基的IC50呈極顯著負(fù)相關(guān)（p＜0.01），迷迭香酸含量越高，IC50越小，其清除自由基能力越強(qiáng)，表明迷迭香酸是紫蘇葉提取物清除自由基的主要有效成分之一。

圖8 迷迭香酸含量與清除DPPH自由基（a）、ABTS自由基（b）IC50的相關(guān)性Fig.8 Correlation between rosmarinic acid content and scavenging DPPH free radical (a), ABTS free radical (b) IC50

2.4 紫蘇迷迭香酸抑菌性的測定

紫蘇迷迭香酸對三種供試菌種的抑菌圈直徑見表4，圖9是呈現(xiàn)了三個(gè)品種紫蘇迷迭香酸對三種不同供試菌的抑制效果。

表4可知，不同品種紫蘇迷迭香酸對三種供試菌的生長均具有一定程度的抑制作用，并且抑菌能力隨著迷迭香酸濃度的降低而減弱。ZY7-1對金黃色葡萄球菌的抑制能力最強(qiáng)，濃度為20.00 mg/mL時(shí)抑菌圈直徑最大，為12.50±0.26 mm；ZB3對金黃色葡萄球菌的抑制能力最強(qiáng)，最大抑菌圈直徑為 11.80±0.10 mm；DZ-1對枯草芽孢桿菌的抑制能力最強(qiáng)，最大抑菌圈直徑為12.40±0.14 mm，三個(gè)品種的紫蘇提取物均對大腸桿菌的抑制能力最弱。圖 9是選取濃度為5.00、10.00、20.00 mg/mL的紫蘇迷迭香酸溶液的抑菌圖，陽性對照為 5%的苯甲酸鈉，可以看出在一定濃度范圍內(nèi)隨著迷迭香酸濃度增加抑菌效果更加明顯。

圖9 三個(gè)品種紫蘇迷迭香酸的抑菌能力Fig.9 Antibacterial ability of three different varieties of perilla rosmarinic acid

表4 不同濃度紫蘇迷迭香酸對各供試菌種的抑菌圈直徑d(mm)Table 4 Diameter of bacteriostatic circle of Perilla rosmarinic acid at different concentration (mm)

3 結(jié)論

本文從45個(gè)不同品種紫蘇葉中提取迷迭香酸，并檢測其對DPPH自由基的清除能力，進(jìn)一步對含量最高的3個(gè)較優(yōu)品種ZY7-1、ZB3、DZ-1的抗氧化性及抑菌性進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同品種紫蘇所含迷迭香酸含量不同，3個(gè)較優(yōu)品種經(jīng)過大孔樹脂柱色譜以及中壓制備色譜分離純化后迷迭香酸含量由7.87%、7.34%、7.32%提高到59.28%、54.41%、51.13%。3個(gè)品種均具有較強(qiáng)的抗氧化性，迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)品對清除 DPPH自由基、ABTS自由基的 IC50值分別為9.12、18.34 μg/mL，而ZY7-1、ZB3、DZ-1清除DPPH自由基的IC50值分別為：15.03、19.08、20.91 μg/mL；清除ABTS自由基的IC50值分別為：26.57、33.11、36.59 μg/mL，而且迷迭香酸含量與清除自由基的IC50值呈極顯著負(fù)相關(guān)。三個(gè)品種紫蘇迷迭香酸對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的生長均具有一定的抑制效果。ZY7-1和ZB3對金黃色葡萄球菌的的抑制作用較大腸桿菌和枯草芽孢桿菌強(qiáng)，最大抑菌圈直徑分別為：12.50 mm、11.80 mm；DZ-1對枯草芽孢桿菌的抑制作用最強(qiáng)，最大抑菌圈直徑為12.40 mm。目前鮮有利用中壓制備色譜分離純化紫蘇迷迭香酸的研究，本研究結(jié)果為紫蘇作為抗氧化劑的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)，也為紫蘇的品種選育以及開發(fā)新的天然抗氧化劑提供了依據(jù)。