外源誘導(dǎo)姬松茸麥角甾醇的合成

范秀芝，姚芬，殷朝敏，史德芳，高虹

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所，湖北武漢 430064）

姬松茸（Agaricus blazei）又名巴氏蘑菇、巴西蘑菇[1]，屬于擔(dān)子菌門、傘菌目、蘑菇科、蘑菇屬（Agaricus）。姬松茸味道鮮美，含有豐富的蛋白質(zhì)、人體必需氨基酸、礦物質(zhì)和微量元素等營(yíng)養(yǎng)成分。近年來，隨著國(guó)內(nèi)外對(duì)姬松茸研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)它不僅是一種美味的食用菌，還在抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、抑菌、降血糖、抗血栓等方面效果奇特[2]，尤其是其抗腫瘤作用居食（藥）用菌首位[3]。

2001年，Takaku等從干的姬松茸子實(shí)體中分離到一種脂類物質(zhì)，通過研究發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)能直接抑制腫瘤生長(zhǎng)，經(jīng)核磁共振和質(zhì)譜分析后確定此物質(zhì)為麥角甾醇[4]。2011年，高虹等[5]發(fā)現(xiàn)姬松茸菌絲體醇提物中的主要抗腫瘤活性成分也是麥角甾醇，并經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)麥角甾醇是通過抑制腫瘤新生血管的形成來抑制腫瘤生長(zhǎng)。已知抑制新生血管形成是抑制腫瘤的潛在治療手段[6]，因此，這一發(fā)現(xiàn)為姬松茸在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用提供了依據(jù)。但目前姬松茸麥角甾醇含量相對(duì)較低，子實(shí)體中含量?jī)H為1.00～2.00 mg/g[7]，且姬松茸子實(shí)體的栽培周期較長(zhǎng)，栽培過程需要消耗大量人力和物力，產(chǎn)量也不高，這些問題限制了姬松茸子實(shí)體作為原料用于其麥角甾醇產(chǎn)品的開發(fā)及應(yīng)用。

外源誘導(dǎo)物，又稱誘導(dǎo)子（elicitor molecules）、激發(fā)子（elicitor），是當(dāng)生物受到脅迫時(shí)產(chǎn)生的多種能夠響應(yīng)脅迫并誘導(dǎo)防御基因表達(dá)，以增強(qiáng)抗逆性的一類特殊化合物的總稱[8]，如茉莉酸類（jasmonates，JAs）和水楊酸（salicylic acid，SA）等。大量研究表明，JAs和SA可誘導(dǎo)酶和防御蛋白的活性水平，導(dǎo)致次級(jí)代謝物質(zhì)的產(chǎn)生和積累，被認(rèn)為是非常有效的誘導(dǎo)子[9,10]。近年來，JAs的茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）和水楊酸（salicylic acid，SA）在大型真菌代謝產(chǎn)物誘導(dǎo)應(yīng)用中初見成效。已有的研究主要集中在靈芝（Ganoderma lucidum）三萜[11]、桑黃（Phellinus igniarius）黃酮[12]和猴頭菌（Hericium erinaceus）麥角甾醇[13]產(chǎn)量提高及誘導(dǎo)機(jī)制的研究中。

因此，本研究借助液體培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)，通過外源誘導(dǎo)物的添加提高菌絲中麥角甾醇產(chǎn)量，并通過誘導(dǎo)條件下參與麥角甾醇合成基因的表達(dá)分析，探析姬松茸麥角甾醇合成的分子機(jī)理及其調(diào)控機(jī)制，為利用基因工程手段構(gòu)建高產(chǎn)麥角甾醇工程菌株提高麥角甾醇的生物合成量，以及開發(fā)保健食品及功能配方食品奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為進(jìn)一步全面闡述姬松茸中次生活性物質(zhì)代謝合成調(diào)控機(jī)制提供理論指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

姬松茸菌株 JSR3購(gòu)自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)菌種實(shí)驗(yàn)中心，保藏于湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所。

麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；茉莉酸甲酯、水楊酸、色譜級(jí)甲醇等購(gòu)自 Sigma公司；氫氧化鉀、無(wú)水乙醇、正己烷等試劑均為分析純。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

固體完全培養(yǎng)基（CYM）：葡萄糖20.00 g，蛋白胨2.00 g，酵母膏2.00 g，KH2PO40.46 g，K2HPO41.00 g，MgSO4·7H2O 0.50 g，瓊脂20.00 g，蒸餾水 1.00 L。

JSR3菌株接種到CYM固體培養(yǎng)基，于25 ℃，避光培養(yǎng)5～7 d進(jìn)行活化。

1.3 麥角甾醇誘導(dǎo)合成條件優(yōu)化

1.3.1 茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）和水楊酸（salicylic acid，SA）添加濃度篩選

（1）MeJA添加濃度篩選

分別向100 mL（250 mL三角瓶）液體CYM培養(yǎng)基中加入不同體積的無(wú)菌MeJA溶液使其終濃度分別為 60.00、70.00、80.00、90.00、100.00 μmol/L?；罨募扇拙z用 8 mm打孔器打孔，等量接種到CYM液體培養(yǎng)基中，25 ℃靜止培養(yǎng)2 d后于120 r/min條件下振蕩培養(yǎng)6 d。菌絲于60 ℃烘干，稱重，計(jì)算得到菌絲生物量（g/100 mL）。提取并測(cè)定菌絲中麥角甾醇含量（mg/g），確定 MeJA 的最佳添加濃度。以MeJA濃度為0的培養(yǎng)基作對(duì)照，每個(gè)處理三個(gè)平行。

（2）SA添加濃度篩選

100 mL液體CYM培養(yǎng)基中分別加入不同體積無(wú)菌SA溶液使其終濃度分別為1.00、10.00、100.00、500.00、1000.00 μmol/L，以不含水楊酸的空白培養(yǎng)基作對(duì)照，每個(gè)處理三個(gè)平行。接種及培養(yǎng)條件同上。提取、測(cè)定菌絲中麥角甾醇含量，確定SA最佳添加濃度。

1.3.2 添加時(shí)間確定

分別在接種的0、2、4、6、8、10 d加入最佳濃度MeJA或SA，于25 ℃，120 r/min振蕩培養(yǎng)，并加入空白對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)至第12 d收獲菌絲體，測(cè)定生物量和麥角甾醇含量，篩選最佳添加時(shí)間。每個(gè)處理三個(gè)平行。

1.3.3 誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)確定

在最佳添加時(shí)間（第n d）時(shí)加入最佳濃度的MeJA或SA，于25 ℃，120 r/min振蕩培養(yǎng)，后分別在第n d、(n+1) d、(n+2) d、(n+3) d、(n+4) d、(n+5) d 收獲菌絲，測(cè)定生物量和麥角甾醇含量。每個(gè)處理三個(gè)平行。

1.4 基因表達(dá)分析

參考檢測(cè)獲得的 JSR3轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（NCBI：PRJNA305463）以及釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）[14]中報(bào)道麥角甾醇合成途徑，設(shè)計(jì)基因表達(dá)定量分析引物（表 1）。在優(yōu)化的條件下分別添加MeJA和SA，收集0～60 h液體培養(yǎng)菌絲液氮速凍后提取總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后用于定量PCR擴(kuò)增[15]。擴(kuò)增體系25.00 μL，反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃，10 min；95 ℃，15 s→60 ℃，60 s，循環(huán)40次；60 ℃→95 ℃，+1 ℃/30 s。以姬松茸內(nèi)源gpd基因?yàn)閮?nèi)參，用2?ΔΔCT法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量[16]。

表1 麥角甾醇合成途徑中基因表達(dá)定量分析引物Table 1 Primers for RT-PCR analysis of genes involving in ergosterol synthesis

1.5 麥角甾醇含量測(cè)定

1.5.1 麥角甾醇提取

姬松茸菌絲中麥角甾醇采用堿-醇法提取[17]。稱取1.00 g樣品溶于32.00 mL堿-醇溶液（KOH 25.00 g，蒸餾水40.00 mL，乙醇定容到100.00 mL），40 ℃下200 W超聲20 min，6000 r/min離心10 min，上清液用正己烷萃取2次，收集下層液體水洗到中性，40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸干后加入20.00 mL無(wú)水乙醇，超聲溶解后定容到25.00 mL。

1.5.2 麥角甾醇含量測(cè)定

麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品稀釋到 0.02～0.08 mg/mL，采用Inertsil?ODS-SP（5 μm，4.6 mm×250 mm）C18色譜柱，柱溫30 ℃，流動(dòng)相為V（流動(dòng)相甲醇）:V（水）=98:2，流速1.00 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)282 nm，進(jìn)樣體積10.00 μL。以峰面積Y為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣量X（mg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（Y=1×107X+11493，R2=0.9981）。樣品稀釋或不稀釋經(jīng)0.22 μm濾膜過濾至進(jìn)樣瓶，10.00 μL進(jìn)樣，以峰面積外標(biāo)法定量。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用單因素方差分析（one-way ANOVA test）進(jìn)行差異顯著性分析，以p＜0.05判斷差異顯著性程度。采用Origin 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析作圖。利用Hemi軟件繪制基因表達(dá)量熱圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 外源誘導(dǎo)物添加量篩選

有報(bào)道指出，MeJA和SA的濃度會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量[9,11-13]，因此本研究分別對(duì)MeJA和SA誘導(dǎo)姬松茸麥角甾醇合成的最佳濃度進(jìn)行了篩選。從圖1中可以看出，雖然MeJA和SA可以誘導(dǎo)姬松茸麥角甾醇的合成，但麥角甾醇的合成量并不會(huì)隨著誘導(dǎo)物濃度的增加而持續(xù)增加。圖1a中，姬松茸菌絲中麥角甾醇的含量隨著培養(yǎng)基中MeJA濃度的提高呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢(shì)，在濃度為70.00 μmol/L時(shí)，菌絲中麥角甾醇含量最高，為1.35 mg/g，其含量是對(duì)照組（MeJA濃度為0）的1.52倍。但在MeJA不同濃度條件下，菌絲生物量并未表現(xiàn)出與麥角甾醇含量相同的趨勢(shì)。且與麥角甾醇含量趨勢(shì)相反，菌絲的生物量在MeJA濃度為70.00 μmol/L時(shí)最低，為1.17 g/100 mL，而在不添加MeJA時(shí)生物量最高，為1.43 g/100 mL。這一現(xiàn)象與其他物種中報(bào)道一致，原因可能是MeJA抑制初級(jí)代謝，而激活次級(jí)代謝，且MeJA對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制可能有利于次生代謝物的合成[9,18]。

圖1 茉莉酸甲酯（a）和水楊酸（b）添加濃度對(duì)姬松茸菌絲生物量和麥角甾醇含量的影響Fig.1 Effects of concentrations of MeJA and SA on the mycelial biomass and ergosterol content in Agaricus blazei

與MeJA不同，SA濃度對(duì)姬松茸菌絲生物量和麥角甾醇含量的影響具有相同的趨勢(shì)（圖 1b）。雖然生物量和麥角甾醇含量不與 SA濃度成正比，但在 SA濃度為10.00～1000.00 μmol/L時(shí)，所有測(cè)試濃度均促進(jìn)了菌絲生物量和代謝產(chǎn)物麥角甾醇的合成，這一結(jié)果與 SA 對(duì)桑黃（P. igniarius）[12]、猴頭菇（H. erinaceus）[13]、靈芝（G. lucidum）[19]中黃酮、麥角甾醇、靈芝酸等次級(jí)代謝產(chǎn)物的影響報(bào)道一致。在SA濃度為10.00 μmol/L時(shí)，姬松茸菌絲生物量和其中麥角甾醇含量達(dá)到最大值，分別為1.62 g/100 mL和1.40 mg/g，比對(duì)照組（SA濃度為0）分別提高了17.39%和57.30%，表明SA可增加姬松茸中麥角甾醇含量[12,19]。

與本文確定的MeJA和SA對(duì)麥角甾醇的最佳誘導(dǎo)濃度（70.00 μmol/L和10.00 μmol/L）不同，猴頭菇中報(bào)道的MeJA和SA對(duì)麥角甾醇的最佳誘導(dǎo)濃度為50.00 μmol/L 和 100.00 μmol/L[13]，分析原因可能是不同食用菌菌種對(duì)這2種誘導(dǎo)物的耐受性存在差異。

2.2 外源誘導(dǎo)物添加時(shí)間

為同時(shí)提高麥角甾醇的含量以及菌絲生物量，對(duì)外源誘導(dǎo)物的添加時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果如圖2所示。圖2a中，培養(yǎng)至第6 d時(shí)加入70.00 μmol/L MeJA，培養(yǎng)結(jié)束收獲的菌絲量達(dá)到最大值，為 1.92 g/100 mL，是空白對(duì)照組（1.40 g/100 mL）的1.37倍。麥角甾醇的含量隨著添加時(shí)間的推后，總體呈現(xiàn)先抑制后促進(jìn)再抑制的趨勢(shì)，在第8 d添加MeJA時(shí)，麥角甾醇含量達(dá)到最大值，為2.52 mg/g，是對(duì)照組（0.89 mg/g）的2.83倍。而在第4 d加入MeJA，菌絲的生物量和麥角甾醇含量均最小，在第4 d達(dá)到最小峰值，推測(cè)原因可能是菌絲在剛剛度過“適者生存”期向指數(shù)生長(zhǎng)期轉(zhuǎn)變時(shí)，加入的MeJA后又一次引起“適者生存”現(xiàn)象[20]，抑制了菌絲的初級(jí)和次級(jí)代謝，從而導(dǎo)致菌絲生物量和麥角甾醇含量值最低?？紤]到菌絲生物量和麥角甾醇出現(xiàn)最大值的MeJA添加時(shí)間不一致，我們以培養(yǎng)終點(diǎn)所獲得菌絲中麥角甾醇總量為參考指標(biāo)，確定第8 d為MeJA的最佳添加時(shí)間點(diǎn)，此時(shí)獲得的麥角甾醇總量最高，為4.56 mg/100 mL。

圖2 茉莉酸甲酯（a）和水楊酸（b）添加時(shí)間對(duì)姬松茸菌絲生物量和麥角甾醇含量的影響Fig.2 Effects of adding time of MeJA and SA on the mycelial biomass and ergosterol content in Agaricus blazei

由圖2b可以看出，在12 d的培養(yǎng)周期內(nèi)，不同時(shí)間點(diǎn)加入 SA，菌絲的生物量和麥角甾醇含量表現(xiàn)出相同的趨勢(shì)。在培養(yǎng)至第6 d加入10.00 μmol/L的SA時(shí)最終收獲的菌絲量和其中麥角甾醇的含量均達(dá)到最大值，分別為2.02 g/100 mL和2.73 mg/g，分別為空白對(duì)照組的1.44和3.07倍。根據(jù)以上結(jié)果，可以看出SA比MeJA具有對(duì)姬松茸菌絲量和麥角甾醇具有更好的誘導(dǎo)效果，推測(cè)可能是因?yàn)槎叩恼T導(dǎo)機(jī)制或作用底物不同[21,22]。

2.3 外源誘導(dǎo)物誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)

Shi等[12]研究指出，高濃度或長(zhǎng)時(shí)間的誘導(dǎo)物處理會(huì)造成一個(gè)環(huán)境壓力，從而影響菌絲的生長(zhǎng)并引起代謝的改變。因此本研究在已確定的添加濃度和添加時(shí)間條件下，分別繼續(xù)對(duì)菌絲進(jìn)行5 d的培養(yǎng)，每天取樣以確定MeJA和SA最佳誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)，以提高菌絲生物量和麥角甾醇含量。

圖3 茉莉酸甲酯（a）和水楊酸（b）誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)對(duì)姬松茸菌絲生物量和麥角甾醇含量的影響Fig.3 Effects of duration of MeJA and SA induction on the mycelial biomass and ergosterol content in Agaricus blazei

由圖3可以看出，在加入MeJA和SA后，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)菌絲生物量基本上呈現(xiàn)出增加的趨勢(shì)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌絲生物量緩慢增加。此外，菌絲中麥角甾醇含量均在添加MeJA和SA后的第2 d達(dá)到最大值，分別為2.35 mg/g和2.43 mg/g，比對(duì)照組（0 d，0.95 mg/g）分別增加了 147.37%和155.79%。此時(shí)，雖然菌絲生物量比較低，但其中麥角甾醇總量均達(dá)到最高值，分別為4.24 mg/100 mL和4.33 mg/100 mL。而且，該誘導(dǎo)條件下獲得的麥角甾醇含量已超過姬松茸子實(shí)體中的含量（1.00～2.00 mg/g）[7]，比較姬松茸子實(shí)體栽培周期長(zhǎng)以及所耗費(fèi)的人力、物力和財(cái)力，本研究所獲得的麥角甾醇具有時(shí)間短、成本低、產(chǎn)量高等優(yōu)勢(shì)，尤其是以SA為誘導(dǎo)物時(shí)，培養(yǎng)時(shí)間更短而產(chǎn)量更高，因此可以考慮用培養(yǎng)所得菌絲體來代替子實(shí)體開展相關(guān)研究。

2.4 基因表達(dá)分析

Hu等[14]指出麥角甾醇的生物合成途徑可分為三個(gè)模塊，即戊酸合成、焦磷酸法尼酯合成和麥角甾醇合成。合成涉及至少23步反應(yīng)，25個(gè)結(jié)構(gòu)基因[23]，這些基因中既有必需基因，也有非必需基因[24]。Ren[11]和Shi[12]等研究指出，MeJA和SA可通過調(diào)控參與目標(biāo)產(chǎn)物合成的基因轉(zhuǎn)錄水平或改變次級(jí)代謝途徑中某些酶的活性來提高目標(biāo)產(chǎn)物的合成。因此，為探明MeJA和SA誘導(dǎo)姬松茸麥角甾醇合成的機(jī)制，本文對(duì)添加誘導(dǎo)物前后參與麥角甾醇合成相關(guān)酶的編碼基因（16個(gè)，表1）轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了定量。圖4a和4b分別顯示在姬松茸菌絲培養(yǎng)到第8 d加入70.00 μmol/L MeJA和第6 d加入10.00 μmol/L SA后每隔12 h菌絲中參與麥角甾醇合成基因表達(dá)情況。

圖4 茉莉酸甲酯（a）和水楊酸（b）誘導(dǎo)對(duì)姬松茸中麥角甾醇合成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平影響Fig.4 The results of transcription analysis of the genes involving in ergosterol biosynthesis of Agaricus blazeiin response to MeJA(a) and SA (b)

從圖4中可以看出，在添加MeJA和SA后，姬松茸菌絲中erg1，erg7，cyp51（erg11）基因的表達(dá)量基本都表現(xiàn)為上調(diào)，這一結(jié)果可能與它們是麥角甾醇合成前期的必需基因有關(guān)[14]。此外，erg27的表達(dá)量雖也有所提高，但在不同時(shí)間點(diǎn)其表達(dá)量會(huì)出現(xiàn)波動(dòng)，這可能是其編碼的3-酮基固醇還原酶與erg7基因編碼的羊毛固醇合酶存在相互調(diào)控作用所導(dǎo)致的[25]。

除以上3個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平明顯提高外，在添加SA誘導(dǎo)的中后期，erg6基因表達(dá)量出現(xiàn)上調(diào)，且隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)erg4基因的表達(dá)量逐漸增加。有報(bào)道指出，在釀酒酵母中erg6基因和erg4基因的高表達(dá)會(huì)增加釀酒酵母中麥角甾醇的合成，預(yù)示著它們?cè)邴溄晴薮己铣芍芯哂兄匾{(diào)控作用[26,27]。據(jù)此推測(cè)erg6和erg4基因在SA誘導(dǎo)的麥角甾醇含量提高中起到調(diào)控作用。但在MeJA誘導(dǎo)的菌絲中未檢測(cè)到erg6和erg4這2個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平明顯的改變，推測(cè)可能是MeJA和SA誘導(dǎo)麥角甾醇合成的機(jī)制存在差異。

hmgcr基因編碼的HMG-CoA還酶是甾醇生物合成途徑中第一個(gè)報(bào)道的限速步驟，高表達(dá)HMG-CoA還原酶可以促進(jìn)中間體角鯊烯的積累[23]，但在 MeJA和SA誘導(dǎo)下（圖4），姬松茸菌絲體中hmgcr基因的表達(dá)量始終處于一個(gè)較低的水平，推測(cè)可能是因?yàn)檩^高的麥角甾醇引起的反饋調(diào)控[14]。而erg13、erg19、erg5基因也因其表達(dá)量過低而未檢測(cè)到，推測(cè)可能跟蔡鵬麗等報(bào)道的結(jié)果一致，這些基因的表達(dá)量與麥角甾醇含量負(fù)相關(guān)[28]，較低的表達(dá)量更有利于麥角甾醇的合成。

雖然基因表達(dá)量不能完全代表其編碼酶的活性，但綜上可以推測(cè)MeJA和SA誘導(dǎo)麥角甾醇合成主要是通過直接或間接的作用啟動(dòng)麥角甾醇合成上游關(guān)鍵酶基因的表達(dá)來提高中間代謝產(chǎn)物的量，并通過中間代謝物與下游相關(guān)酶的協(xié)同、抑制等互作來實(shí)現(xiàn)的麥角甾醇合成的調(diào)控。

3 結(jié)論

外源添加MeJA和SA可以誘導(dǎo)姬松茸菌絲體中麥角甾醇合成。經(jīng)過試驗(yàn)獲得二者最佳的誘導(dǎo)條件分別是 25 ℃下液體培養(yǎng)的菌絲在第 8 d加入 70.00 μmol/L的MeJA和第6 d加入10.00 μmol/L的SA，并繼續(xù)培養(yǎng)2 d。獲得的菌絲中麥角甾醇含量分別為2.35 mg/g和2.43 mg/g，比對(duì)照組分別增加了147.37%和155.79%，并且高于姬松茸子實(shí)體中麥角甾醇含量，因此外源誘導(dǎo)，尤其是SA誘導(dǎo)獲得菌絲體可替代子實(shí)體開展相關(guān)研究。通過熒光定量PCR對(duì)參與麥角甾醇合成基因表達(dá)量進(jìn)行分析后推測(cè)MeJA和SA誘導(dǎo)麥角甾醇合成的機(jī)制可能是通過直接或間接的作用啟動(dòng)麥角甾醇合成上游關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，并通過參與麥角甾醇合成代謝相關(guān)酶的相互作用來實(shí)現(xiàn)的。