基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)人參皂苷F2減肥作用的靶標(biāo)及通路

周靜，何洋，胡衛(wèi)成，張跡，楊曉君

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052）

（2.淮陰師范學(xué)院江蘇省區(qū)域現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與環(huán)境保護(hù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇淮安 223300）

據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）數(shù)據(jù)，截止到2016年，全世界18歲及以上的成年人中有39%的人群超重，其中13%為肥胖。肥胖可能增加罹患各種疾病的風(fēng)險(xiǎn)，如Ⅱ型糖尿病、高血壓、脂肪肝、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病等[1]，由肥胖引起的抑郁、自卑等心理問(wèn)題也十分常見(jiàn)。肥胖主要源于遺傳性、代謝失常、飲食結(jié)構(gòu)失衡、缺乏體力活動(dòng)等因素，基因水平上涉及多種調(diào)控通路，因此，開(kāi)發(fā)多靶點(diǎn)化合物改善類似代謝疾病的研究受到廣泛關(guān)注[2,3]。

人參（Panax ginseng）具有廣泛的生理活性，如抗肥胖[4]、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[5]、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力[6]等，是一種重要的保健食品資源。人參皂苷是人參的主要功效成分，按結(jié)構(gòu)主要分為原人參二醇型（protopanaxadiol，PPD）和原人參三醇型（protopanaxatriol，PPT）。人參皂苷 F2（20(S)-ginsenoside F2，G-F2）是由PPD型人參皂苷通過(guò)生物轉(zhuǎn)化等方式水解多種糖苷鍵得到的，可以減輕氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡[7]，對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[8]、乳腺癌[9]等有抗癌作用。有報(bào)道稱G-F2可緩解胰島素抵抗、保護(hù)肝免受非酒精性肝損傷，抑制肝內(nèi)中性脂肪形成、堆積以及炎癥[10]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)G-F2可以降低 3T3-L1前脂肪細(xì)胞脂滴產(chǎn)生數(shù)量，通過(guò)文獻(xiàn)遍歷，發(fā)現(xiàn)Fayeza Md. Siraj等[11]報(bào)道了G-F2可以抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化而可能具有減肥的效果，但是其作用機(jī)制尚不明確。

隨著系統(tǒng)生物學(xué)、網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)、多向藥理學(xué)等新興交叉學(xué)科的發(fā)展，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)（Network pharmacology，NP）已經(jīng)成為未來(lái)功能成分開(kāi)發(fā)的重要依據(jù)，它從整體性和系統(tǒng)性強(qiáng)調(diào)多成分、多靶點(diǎn)、多疾病之間的相互作用，提高效率，同時(shí)可以降低開(kāi)發(fā)成本，也適用于天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)[12-14]。目前，NP已經(jīng)發(fā)展出一系列成熟的數(shù)據(jù)平臺(tái)、方法和軟件，如可對(duì)中藥成分進(jìn)行篩選、獲取成分-靶點(diǎn)-疾病關(guān)系的中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP）；集成了包括基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、遺傳、臨床和功能信息等資源的 GeneCards；可以預(yù)測(cè)藥物與蛋白質(zhì)之間相互作用的STITCH數(shù)據(jù)庫(kù)；用于分子互作網(wǎng)絡(luò)及生物途徑可視化的軟件平臺(tái)Cytoscape等[15]。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)和已發(fā)表數(shù)據(jù)對(duì) G-F2和肥胖的靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)和篩選，采用Cytoscape軟件構(gòu)建G-F2-靶點(diǎn)-疾病作用網(wǎng)絡(luò)，對(duì)相關(guān)靶點(diǎn)參與的生物學(xué)過(guò)程、分子功能以及涉及的通路進(jìn)行分析，以深入探討 G-F2減肥的潛在作用機(jī)制，為后續(xù)研究提供參考方向。

1 資料與方法

1.1 G-F2靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

在有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫(kù)（PubChem，https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/） 檢 索 20(S)-ginsenoside F2結(jié)構(gòu)信息，再將獲得的結(jié)構(gòu)信息在小分子-蛋白靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)（Swiss Target Prediction，http://www.swisstargetprediction.ch/）中檢索，獲得 G-F2的靶點(diǎn)信息。

1.2 肥胖相關(guān)靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org/）以obesity為檢索詞查找肥胖相關(guān)靶點(diǎn)信息，選取相關(guān)分?jǐn)?shù)Relevance score≥5作為分析靶點(diǎn)。將G-F2與肥胖相關(guān)靶點(diǎn)信息進(jìn)行比對(duì)并取交集，即為 G-F2治療肥胖潛在作用靶點(diǎn)。

1.3 靶點(diǎn)GO富集及KEGG通路注釋分析

將G-F2-肥胖相關(guān)靶點(diǎn)信息導(dǎo)入OmicShare平臺(tái)（https://www.omicshare.com/）GO富集和Pathway富集分析工具，制作GO富集柱狀圖、KEGG注釋圖，并選取Q-value前20的富集通路制作KEGG氣泡圖和通路-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將 G-F2-肥胖相關(guān)靶點(diǎn)信息導(dǎo)入 String數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/），選擇Multiple Proteins選項(xiàng)，Organism選擇為Homo Sapiens，再將獲得的文件信息導(dǎo)入 Cytoscape version 3.7.0軟件（Cytoscape Consortium, California，USA），繪制相互作用網(wǎng)絡(luò)并分析，即獲得靶點(diǎn)基因?qū)?yīng)的蛋白質(zhì)互作（PPI）關(guān)系圖。

1.5 數(shù)據(jù)處理

本研究所有數(shù)據(jù)均使用Cytoscape version 3.7.0軟件做圖，選取P-Value＜0.01的數(shù)據(jù)進(jìn)行 GO 富集及KEGG通路分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 G-F2抗肥胖作用靶點(diǎn)篩選

G-F2化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖3（a）。Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)共獲得100個(gè)G-F2相關(guān)靶點(diǎn)信息，GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索共獲得 1367個(gè)肥胖相關(guān)靶點(diǎn)（Relevance score≥5），將 G-F2靶點(diǎn)信息與肥胖靶點(diǎn)信息進(jìn)行比對(duì)，并取交集，共獲得35個(gè)G-F2與肥胖相關(guān)靶點(diǎn)，見(jiàn)表1。

表1 G-F2減肥靶點(diǎn)Table 1 Anti-obesity targets of G-F2

2.2 G-F2抗肥胖潛在靶點(diǎn)GO富集分析

使用 OmicShare平臺(tái)對(duì)G-F2-肥胖靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析。GO富集分析分別描述了靶點(diǎn)基因參與的生物過(guò)程（Biological Process）、分子功能（Molecular Function）、細(xì)胞組分（Celluar Component）。結(jié)果如圖1所示。

由圖1知，G-F2減肥作用的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)參與多個(gè)生物過(guò)程，其中生物學(xué)過(guò)程主要包括代謝過(guò)程（metabolic process）、對(duì)刺激反應(yīng)（response to stimulus）、生物調(diào)節(jié)（biological regulation）、細(xì)胞進(jìn)程（cellular process）、多細(xì)胞組織過(guò)程（multicellular organism process）等；分子功能主要富集于結(jié)合（binding)、催化活性（catalytic activity）、分子轉(zhuǎn)導(dǎo)活性（molecular trancducer activity）、分子功能調(diào)節(jié)（molecular function regulation）、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性（transcription regulation activity）等；參與的細(xì)胞組成主要包括細(xì)胞（cell）、細(xì)胞組分（cell part）、細(xì)胞膜（membrane）、細(xì)胞器（organalle）、細(xì)胞器組分（organelle part）等。

脂質(zhì)代謝與能量代謝是肥胖發(fā)展的關(guān)鍵代謝過(guò)程。脂肪組織是能量?jī)?chǔ)存、調(diào)節(jié)能量平衡和葡萄糖穩(wěn)態(tài)的主要部位，分為白色脂肪組織和棕色脂肪組織，前者以甘油三酯的形式儲(chǔ)存能量，其過(guò)量增加會(huì)導(dǎo)致激素紊亂、炎癥細(xì)胞因子和脂肪因子的釋放，是引起肥胖并導(dǎo)致一系列心血管疾病的重要因素[16]；而后者主要通過(guò)產(chǎn)熱調(diào)節(jié)能量，維持正常能量穩(wěn)態(tài)，因此，白色脂肪組織向棕色脂肪組織的轉(zhuǎn)化對(duì)于改善肥胖具有重要意義，而這一過(guò)程與線粒體數(shù)量、形態(tài)、內(nèi)膜上解偶聯(lián)蛋白1（uncoupling protein-1，UCP1）、膜電位等因素相關(guān)，而預(yù)測(cè)靶點(diǎn)STAT3能夠進(jìn)入線粒體，調(diào)節(jié)電子傳遞鏈，增加線粒體ATP生成并減少組織損傷[17]。據(jù)報(bào)道，G-F2可通過(guò)降低線粒體膜電位、促使活性氧積累并誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡而具有抗癌作用[18]，其是否對(duì)脂肪細(xì)胞線粒體產(chǎn)生影響有待實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

2.3 G-F2抗肥胖潛在靶點(diǎn)KEGG通路富集分析

為了闡明G-F2減肥的作用機(jī)制，將上述32個(gè)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析注釋，并取Q-Value前20的KEGG通路繪制氣泡圖，結(jié)果如圖2所示。

圖2（a）中對(duì)G-F2減肥潛在靶點(diǎn)進(jìn)行了通路注釋，結(jié)果顯示這些靶點(diǎn)基因主要富集于六大模塊，按節(jié)點(diǎn)degree排序位于前三的模塊包括：（1）人類疾病，包括傳染性疾病（infectious diseases）、癌癥、抗藥性（drug resistance）、內(nèi)分泌代謝性疾?。╡ndocrine and metabolic diseases）、心血管疾?。╟ardiovascular diseases）等；（2）環(huán)境信息進(jìn)程，包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（signal transduction）、信號(hào)分子和相互作用（signaling molecules and interaction）；（3）有機(jī)系統(tǒng)，包括免疫（immune）、內(nèi)分泌（endocrine）、神經(jīng)（nervous）、環(huán)境適應(yīng)（enviroumental adaptation）等。

圖 2（b）中，“Rich factor”表示某一通路的靶基因數(shù)量與該通路上標(biāo)注的基因數(shù)量之比，其值越高，富集程度越高。由圖 2（b）（c）可知，G-F2發(fā)揮抗肥胖作用的潛在信號(hào)通路主要包括EGFR抗酪氨酸激酶抑制劑信號(hào)通路、P13K-Akt信號(hào)通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用信號(hào)通路等。其中，EGFR是一種酪氨酸激酶，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，也是腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的刺激因子，而酪氨酸激酶抑制劑耐受（EGFR TKI resistance）則可導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)[19]，Li等[20]報(bào)道了小分子EGFR拮抗劑改善了肥胖引起的心肌損傷，降低了肥胖小鼠模型心肌炎癥、纖維化、凋亡和功能障礙，這表明 G-F2在抗肥胖的同時(shí)可能通過(guò)該通路具有改善肥胖引起的心肌炎癥作用，涉及的潛在靶點(diǎn)包括VEGFA、MAPK1、STAT3、MTOR、RPS6KB1、PIK3CA、FGF2、MET等8個(gè)靶點(diǎn)；PI3K-Akt信號(hào)通路調(diào)節(jié)基本細(xì)胞功能，如轉(zhuǎn)錄、分化、生長(zhǎng)、存活等，是調(diào)控血糖平衡的關(guān)鍵通路[21]，涉及的靶點(diǎn)主要包括IL2、VEGFA、HSP90AA1、MAPK1、MTOR、RPS6KB1、PIK3CA、PIK3CG、PTPN1、MET等10個(gè)靶點(diǎn)；神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路涉及的靶點(diǎn)主要包括ADRA2A、ADRA2B、ADORA1、NR3C1、ADRB2、PLG、F2、HTR2A、HTR2B等9個(gè)靶點(diǎn)。關(guān)于 G-F2減肥作用的研究報(bào)道較少，值得對(duì)該預(yù)測(cè)結(jié)果作進(jìn)一步深入實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

圖1 G-F2減肥潛在靶標(biāo)GO富集分析Fig.1 Enriched gene ontology terms of potential anti-obesity targets from ginsenoside F2

圖2 G-F2減肥潛在靶點(diǎn)KEGG通路富集分析Fig. 2 KEGG pathway enrichment analysis in potential anti-obesity targets of G-F2

2.4 G-F2-靶點(diǎn)-肥胖蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)模型分析

PPI網(wǎng)絡(luò)圖顯示了靶點(diǎn)間直接或間接調(diào)控作用，可以更好的理解復(fù)雜代謝性疾?。ㄈ绶逝郑┲胁煌悬c(diǎn)的功能[22,23]。圖3b中，節(jié)點(diǎn)（node）表示G-F2-肥胖相關(guān)靶點(diǎn)蛋白，其大小、顏色表示作用強(qiáng)度（degree），由橙至藍(lán)，degree依次增大；節(jié)點(diǎn)之間的邊（edge）表示靶點(diǎn)蛋白之間作用關(guān)系。靶點(diǎn)篩選共得到35個(gè)G-F2-肥胖相關(guān)靶點(diǎn)，而在圖中顯示32個(gè)節(jié)點(diǎn)，缺失的 3個(gè)靶點(diǎn)蛋白為 SLC5A1、ALDH2、HSD17B1，它們與其他靶點(diǎn)蛋白之間無(wú)相互作用關(guān)系，故不顯示。由圖可知，32個(gè)靶點(diǎn)蛋白共產(chǎn)生151條邊，其中degree值位于前五的靶點(diǎn)分別是VEGFA（血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A）、MAPK1（絲裂原活化蛋白激酶1）、CASP3（半胱天冬蛋白酶3）、STAT3（信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3）、PIK3CA（磷脂酰肌醇3激酶），預(yù)示這些靶點(diǎn)可能是G-F2治療肥胖的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖3 G-F2減肥潛在靶點(diǎn)PPIFig. 3 Protein interaction network of ginsenoside F2 in anti-obesity

肥胖在細(xì)胞水平表現(xiàn)為脂肪細(xì)胞數(shù)目增多、體積增大，其中，前脂肪細(xì)胞過(guò)度增殖與分化是引起肥胖的重要原因，期間受多種激素、基因表達(dá)和信號(hào)通路的調(diào)控[24,25]。PPARγ是脂肪細(xì)胞分化的重要轉(zhuǎn)錄子，它可促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化、脂肪生成并增加胰島素敏感性，F(xiàn)ayeza Md. Siraj等[11]通過(guò)分子對(duì)接和體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)G-F2與PPARγ具有良好親和力，G-F2通過(guò)抑制PPARγ表達(dá)而阻止脂肪細(xì)胞分化，具有減肥活性，本研究基于此報(bào)道進(jìn)行了 G-F2減肥靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，進(jìn)一步探討其可能的分子機(jī)制。VEGF家族可參與血管形成、調(diào)節(jié)血管通透性、維持血管生理功能，研究表明其水平與肥胖呈正相關(guān)，而VEGFA在脂肪發(fā)育和能量代謝中起重要調(diào)節(jié)作用[26]，可能是G-F2減肥作用的重要靶點(diǎn)。MAPK作為預(yù)測(cè)的另一重要靶點(diǎn)，是細(xì)胞增殖、分化等基本細(xì)胞進(jìn)程中起關(guān)鍵作用的胞內(nèi)靶點(diǎn)[27,28]，Seo等[29]對(duì)槲皮素的體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，它可以通過(guò)抑制脂肪細(xì)胞中MAPK信號(hào)因子ERK1/2、JNK、p38的表達(dá)而對(duì)肥胖及肥胖引起的炎癥具有抑制作用。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合文獻(xiàn)預(yù)測(cè)了 G-F2減肥的作用機(jī)制，建立了G-F2-靶點(diǎn)-肥胖作用網(wǎng)絡(luò)，共涉及 35個(gè)潛在靶點(diǎn)，其中關(guān)鍵靶點(diǎn)包括 VEGFA、MAPK1、CASP3等，主要參與代謝、結(jié)合、組成細(xì)胞組分等生物過(guò)程，可能通過(guò)EGFR抗酪氨酸激酶抑制劑信號(hào)通路、P13K-Akt信號(hào)通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用信號(hào)通路等方式發(fā)揮改善肥胖作用，表明 G-F2具有多靶點(diǎn)、多通路的作用特點(diǎn)，為后續(xù)深入探討 G-F2改善肥胖作用機(jī)制提供方向，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究思路也有助于傳統(tǒng)藥食資源的再開(kāi)發(fā)利用。