測量不確定度在微生物檢驗中的應(yīng)用及研究進(jìn)展

楊娟，鐘昕，朱世真，楊曉云

（青島市食品藥品檢驗研究院，山東青島 266071）

微生物檢驗是依法設(shè)置的各級食品藥品檢驗機(jī)構(gòu)檢驗工作中的重要一環(huán)，主要檢驗產(chǎn)品涉及藥品、食品、化妝品等。微生物存在于檢驗樣品中，一般以單個菌體形式或集團(tuán)菌體形式存在。被微生物污染的藥品不僅會影響治療效果，還會進(jìn)一步加重患者病情[1]。食品微生物污染事件時有發(fā)生，被污染的食物一經(jīng)食用，會對人們的生命健康造成極其不利的影響?；瘖y品中的微生物指標(biāo)直接影響化妝品的質(zhì)量。檢驗工作中的微生物檢驗十分重要，但微生物檢驗過程復(fù)雜，影響其檢驗質(zhì)量的因素較多。在檢測過程中，樣品中微生物受到培養(yǎng)基質(zhì)量、操作環(huán)境、稀釋溶液、培養(yǎng)溫度、觀察結(jié)果時間和操作人員技能等因素的影響，導(dǎo)致檢驗結(jié)果的離散度較大[2]。因此，測量不確定度的評定是確保微生物檢驗質(zhì)量和提高微生物檢驗水平的重要抓手，在質(zhì)量控制中必不可少。只有確定檢驗樣品微生物符合限定標(biāo)準(zhǔn)，才能將產(chǎn)品投入市場，最大程度地降低使用風(fēng)險，保障消費(fèi)者的身體健康。

《測量不確定度評定和表示指南》給出的測量不確定度的定義是：與測量結(jié)果相關(guān)聯(lián)的參數(shù)，表征合理地賦予被測量值的分散程度。測量不確定度越小，說明檢測水平越高，檢測結(jié)果的使用價值越大[3]。各級食品藥品檢驗機(jī)構(gòu)對外出具的檢驗檢測數(shù)據(jù)是判定檢品質(zhì)量的重要依據(jù)，特別是當(dāng)檢驗檢測數(shù)據(jù)處于標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的邊緣時，引入不確定度參數(shù)對評估定量分析方法的可靠性和測量結(jié)果的準(zhǔn)確性就更加重要[4]。在實驗室認(rèn)可和資質(zhì)認(rèn)定的實踐過程中，測量不確定度在檢測數(shù)據(jù)質(zhì)量的提高、測量結(jié)果臨界值的判斷、方法確認(rèn)以及實驗室質(zhì)量控制、實驗室風(fēng)險控制方面具有重要意義。

隨著微生物檢驗領(lǐng)域的發(fā)展，檢測手段和檢驗方法逐步完善。作為一種科學(xué)、合理的驗證手段及質(zhì)量控制方法，測量不確定度正越來越多地被引入。故此，針對微生物檢驗的不同領(lǐng)域（藥品、食品、化妝品）的測量不確定度的國內(nèi)最新研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，并就其應(yīng)用加以探討。

1 藥品微生物檢驗

藥品是指用于預(yù)防、治療、診斷人的疾病，有目的地調(diào)節(jié)人的生理機(jī)能并規(guī)定有適應(yīng)癥或者功能主治、用法和用量的物質(zhì)，包括中藥、化學(xué)藥和生物制品等。藥品微生物檢驗作為藥品檢驗的一大類分支，己經(jīng)越來越多地運(yùn)用到了各個藥品品種中。藥品微生物檢驗是保證藥品質(zhì)量的重要手段，只有切實提高對藥品微生物檢驗工作的重視，才能最大程度上保證藥品投入市場后的療效。2020 年版《中國藥典》對藥品微生物檢驗的質(zhì)量控制提出了更為嚴(yán)格的要求。由于微生物檢驗的特殊性及難以定量的特性，測量不確定度在該領(lǐng)域的運(yùn)用一直進(jìn)展緩慢，相關(guān)的文獻(xiàn)報道也較少，但在微生物效價方面由于效價方法比較成熟，測量不確定度在該領(lǐng)域有所建樹。

1.1 化學(xué)藥品

董超琪等[4]對微生物檢定法測定慶大霉素注射液含量的測量不確定度進(jìn)行評定分析，計算出擴(kuò)展不確定度U=3.88%（k=2），慶大霉素注射液含量測定結(jié)果可表示為99.94%±3.88%。測量不確定度主要是來源于高低劑量抑菌圈直徑值、抑菌圈測量儀、實驗設(shè)計的不確定度、標(biāo)準(zhǔn)品稱量、標(biāo)準(zhǔn)品純度、標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋、供試品量取及稀釋、樣品估計效價。邢以文等[5]以統(tǒng)計學(xué)為工具建立硫酸慶大霉素片含量測定的測量不確定度評估方法。計算出擴(kuò)展不確定度U=3.2%（k=2），硫酸慶大霉素片含量測定結(jié)果可表示為98.6%±3.2%。錢桂英等[6]采用微生物檢定法測定慶大霉素普魯卡因膠囊中慶大霉素含量的不確定度以提高測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。量化了各分量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度，并計算出總合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度，得出擴(kuò)展不確定度為U=2.98%（k=2），慶大霉素的含量測定結(jié)果可表示為88.41%±2.98%。測量不確定度主要來源為試驗設(shè)計、抑菌圈直徑和供試品平均裝量等。宋玉霞等[7]對微生物檢定法測定乙酰螺旋霉素片含量的不確定度進(jìn)行評定。采用二劑量法，計算擴(kuò)展不確定度U=6.0%（k=2），乙酰螺旋霉素含量測定結(jié)果可表示為98.4%±6.0%。安賢蘭等[8]探討注射用磷霉素鈉含量采用抗生素微生物檢定法鑒定的不確定度評定方法，計算擴(kuò)展不確定度為U=4.9%（k=2），注射用磷霉素鈉含量測定結(jié)果可表示為100.5%±4.9%。于麗娜等[9]為研究微生物檢定法測定硫酸卡那霉素注射液生物效價試驗中各因素對結(jié)果的影響，采用不確定度分析，將影響因素歸納為稱量、稀釋、加樣、測定、平行試驗，量化各不確定度分量，評估各因素的影響因子。結(jié)果表明，牛津杯加樣體積對測定結(jié)果影響最大，提示試驗中應(yīng)盡可能精確控制加樣體積。白青山等[10]評定以微生物檢定法測定紅霉素原料含量的不確定度。測量不確定度主要來源為方法設(shè)計，其次為溶液稀釋。選擇適宜的方法設(shè)計，盡可能減少稀釋次數(shù)，可有效減小試驗的不確定度。

微生物檢定法測定藥品中有效成分含量的測量不確定度分析，方法清晰合理、簡便準(zhǔn)確，適合微生物檢定法的不確定度評定。在對測量不確定度進(jìn)行分析與評估時，應(yīng)盡可能地對測量不確定度的所有來源進(jìn)行密切考察，防止出現(xiàn)遺漏。微生物檢定法測量不確定度的來源較多，包括抑制圈的控制、抑制圈邊緣清晰度以及細(xì)菌生長情況、高低劑量抑菌圈直徑值、抑菌圈測量儀、實驗設(shè)計的不確定度、標(biāo)準(zhǔn)品稱量、標(biāo)準(zhǔn)品純度、標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋、供試品量取及稀釋、樣品估計等。藥品微生物檢驗要求檢驗人員一方面要熟練掌握微生物知識，另一方面需要掌握化學(xué)藥品的性質(zhì)，才能夠?qū)y量不確定度不斷降低，從而得出精確且可靠的結(jié)果。

1.2 中成藥及中藥制劑

舒玉萍等[11]對中藥制劑補(bǔ)中益氣丸微生物檢驗的不確定度分析，計算擴(kuò)展不確定度為U=7.3%（k=2）。與一般的測量相比較，補(bǔ)中益氣丸的菌落總數(shù)測定的特點是測量結(jié)果的發(fā)散性較大，測量不確定度的評定有助于減少測量結(jié)果的誤差。呂婷婷等[12]建立板藍(lán)根顆粒霉菌和酵母菌總數(shù)不確定度評定方法，計算擴(kuò)展不確定度為U=15.2%（k=2）。測量結(jié)果的不確定度主要來源于不同人員的重復(fù)性操作。王娟等[13]建立荊防顆粒需氧菌總數(shù)不確定度評定方法，對需氧菌總數(shù)進(jìn)行不確定度評定，并計算擴(kuò)展不確定度為U=8.8%（k=2）。建立的不確定評定方法簡單方便，可新增加檢驗樣本結(jié)果，通過重新計算合并樣本標(biāo)準(zhǔn)差，得到新的不確定度取值范圍。

分析中成藥及中藥制劑微生物檢驗的測量不確定度主要來源于不同人員的重復(fù)性操作、操作環(huán)境、培養(yǎng)基、儀器設(shè)備、菌落計數(shù)、藥品性質(zhì)等因素的影響，導(dǎo)致檢查結(jié)果出現(xiàn)偏差不能準(zhǔn)確判斷。結(jié)果的測量不確定度主要是由多種因素聯(lián)合作用導(dǎo)致，單一因素影響較低[14]。中成藥及中藥制劑微生物檢驗操作煩瑣，對環(huán)境和人員要求嚴(yán)格，檢驗人員應(yīng)進(jìn)行崗前培訓(xùn)并通過考核，以確保檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性、科學(xué)性。

2 食品微生物檢驗

2.1 一般食品

食品是指各種供人食用或者飲用的成品和原料以及按照傳統(tǒng)既是食品又是藥品的物品，但是不包括以治療為目的的物品。食品安全和人們的身體健康具有極為密切的聯(lián)系，是目前我國比較關(guān)注的問題。在進(jìn)行食品檢驗時，微生物檢驗是極為重要的一環(huán)，不但能夠檢驗食品的具體情況，其檢驗成果也比其他檢驗環(huán)節(jié)更加準(zhǔn)確[15]。菌落總數(shù)是食品微生物檢驗的重要衛(wèi)生指標(biāo)之一，因此對菌落總數(shù)檢測結(jié)果進(jìn)行測量不確定度的評定是很有必要的。

徐騰月等[16]對食品微生物檢驗進(jìn)行了測量不確定度評定，以壓縮干糧為例對菌落總數(shù)進(jìn)行了不確定度評定，探討了其對生產(chǎn)過程的指導(dǎo)。測量不確定度來源主要是樣品的重復(fù)測量、稱量過程、稀釋過程及菌落計數(shù)過程。其中重復(fù)測量帶來的不確定度占主要部分。菌落總數(shù)測量不確定度評定可使檢驗結(jié)果更加接近真實值，可用于評價實驗室的檢驗?zāi)芰?，且提高了判定產(chǎn)品合格與否的準(zhǔn)確率。曹艷娟等[17]評定微生物法測定全營養(yǎng)配方食品中生物素的不確定度。計算擴(kuò)展不確定度為U=1.8%（k=2）。測量不確定度來源主要為測量重復(fù)性、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程，次要來源是試樣系列管制備過程、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、紫外分光光度計的偏差和樣液制備過程。毛永楊等[18]對米線中菌落總數(shù)測定結(jié)果的不確定度進(jìn)行評估，計算擴(kuò)展不確定度為U=4.9%（k=2）。影響結(jié)果不確定度的主要因素為樣品的均勻性和重復(fù)測定，該評估系統(tǒng)可為今后實驗室測定食品中菌落總數(shù)的不確定度評估提供參考，為檢驗檢測結(jié)果的科學(xué)表達(dá)提供依據(jù)。趙麗等[19]對糕點中菌落總數(shù)的測量結(jié)果進(jìn)行不確定度評定，計算擴(kuò)展不確定度為U=2.2%（k=2）。糕點菌落總數(shù)檢驗中重復(fù)性檢驗和培養(yǎng)基的菌落生長率對測量不確定度影響最大，需要在檢測過程中注意。

分析食品微生物檢驗的測量不確定度主要來源于樣品的重復(fù)測量、稱量過程、菌落計數(shù)過程、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程、試樣系列管制備過程、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、樣液制備過程等因素的影響，導(dǎo)致檢查結(jié)果出現(xiàn)偏差不能準(zhǔn)確判斷。各級食品藥品檢驗機(jī)構(gòu)在實施食品微生物檢驗的過程中，應(yīng)做好對檢驗設(shè)備、實驗室內(nèi)外部環(huán)境的管理。工作人員要按照相應(yīng)的規(guī)章制度進(jìn)行檢驗，根據(jù)檢驗標(biāo)準(zhǔn)對檢驗過程化質(zhì)量控制。通過對食品微生物檢驗進(jìn)行測量不確定度評定，讓食品檢驗結(jié)果更加可信，提高食品檢驗的質(zhì)量，從而保證食品安全。

2.2 保健食品

保健食品是指具有特定保健功能或者以補(bǔ)充維生素、礦物質(zhì)為目的的食品，即適宜于特定人群食用、具有調(diào)節(jié)機(jī)體功能、不以治療疾病為目并且對人體不產(chǎn)生任何急性、亞急性或者慢性危害的食品[20]。保健食品的保健作用在當(dāng)今的社會中，也正在逐步被廣大群眾所接受。對保健食品的微生物檢驗進(jìn)行測量不確定度評定，可以使檢驗結(jié)果更加準(zhǔn)確可信。

鄭東宇等[21]對不同性狀的保健品在微生物定量檢驗過程中的主要量值進(jìn)行不確定度評定分析。使用大腸埃希氏標(biāo)準(zhǔn)菌株制備人工染菌測試液，對膠囊樣品、片劑樣品與液體樣品保健品進(jìn)行菌落總數(shù)定量檢測。膠囊樣品擴(kuò)展不確定度為U=4.1%（k=2），片劑樣品擴(kuò)展不確定度為U=7.7%（k=2），液體樣品擴(kuò)展不確定度為U=3.6%（k=2）。測量不確定度主要來源為實驗室內(nèi)再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)偏差，次要來源為樣品制備和樣品加樣過程。微生物檢驗實驗室在進(jìn)行不確定度評定時應(yīng)充分考慮樣品基質(zhì)對再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)偏差的影響，按照樣品類別區(qū)分進(jìn)行測量不確定度評定。

2.3 飲用水

飲用水屬于食品范疇，但是又是特殊的存在，因為飲用水關(guān)乎民生，其中微生物的指標(biāo)又直接反映飲用水的污染程度。但微生物檢驗過程復(fù)雜，影響其檢驗質(zhì)量的因素較多[22]。對飲用水微生物檢驗進(jìn)行測量不確定度評定能最大可能地避免實驗誤差，減少環(huán)境影響，確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，更好地為飲用水檢驗服務(wù)。

王利艷[23]通過不確定度評定對飲用純凈水中菌落總數(shù)測量結(jié)果臨界值進(jìn)行判斷，擴(kuò)展不確定度為U=14.4%（k=2）。樣品平行測試結(jié)果取對數(shù)值用于菌落總數(shù)不確定度的評定，可以用來對檢測結(jié)果處于超標(biāo)臨界值的合理判定。龔劍等[24]評定了微生物電極法測定地表水中生化需氧量的測量不確定度。擴(kuò)展不確定度U=1.7%（k=2）。測量不確定度主要來自儀器分析的重復(fù)性。李英杰[25]評估水源水中菌落總數(shù)檢測結(jié)果的不確定度，計算擴(kuò)展不確定度為U=6.2%（k=2），樣品測量結(jié)果均在其各自的置信區(qū)間范圍內(nèi)。研究建立的方法同樣適合類似檢測條件下菌落總數(shù)不確定的評定。丁珵等[26]評定生活飲用水及其水源水中菌落總數(shù)測定的不確定度。生活飲用水中菌落總數(shù)的擴(kuò)展不確定度為U=4.7%（k=2），水源水中菌落總數(shù)的擴(kuò)展不確定度為U=2.4%（k=2），適用于菌落總數(shù)不確定度的評定。利用指數(shù)法可以對菌落總數(shù)的不確定度進(jìn)行合理判定。

飲用水是否安全對于人們的身體健康有很大的影響。檢驗機(jī)構(gòu)根據(jù)不同微生物的特點，合理運(yùn)用不同的微生物檢驗技術(shù)，對水質(zhì)進(jìn)行相關(guān)檢驗，通過測量不確定度的評定能夠有效減小檢驗結(jié)果的誤差。

3 化妝品微生物檢驗

微生物檢驗是化妝品進(jìn)入市場中的一個重要環(huán)節(jié)，人們在購買化妝品時也越來越關(guān)注微生物檢驗情況，微生物對化妝品的影響應(yīng)引起相關(guān)檢驗機(jī)構(gòu)的足夠重視[27]。各級食品藥品檢驗機(jī)構(gòu)也承擔(dān)著化妝品檢驗職責(zé)，在化妝品檢驗過程中更應(yīng)注重微生物檢驗。從現(xiàn)狀來看，我國化妝品微生物檢驗起步較晚，檢測技術(shù)還不夠先進(jìn)，微生物檢驗過程中也存在判斷失誤的情況，而化妝品微生物檢驗與藥品微生物檢驗，二者在檢驗標(biāo)準(zhǔn)、實驗室環(huán)境、培養(yǎng)基、樣品采集、方法驗證和菌落報告方式等方面都存在不同[28]，所以化妝品微生物檢驗的測量不確定度評價尤為重要。

鄭萍等[29-30]評定化妝品中霉菌和酵母菌檢測結(jié)果的測量不確定度，計算擴(kuò)展不確定度為U=6.9%（k=2）。評定化妝品中菌落總數(shù)指標(biāo)檢測的測量不確定度，計算擴(kuò)展不確定度為U=3.8%（k=2）?；瘖y品霉菌、酵母菌總數(shù)、菌落總數(shù)的測量不確定度的主要來源均為重復(fù)測定。吳衛(wèi)玲等[31]對乳液中霉菌和酵母菌總數(shù)進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果進(jìn)行不確定度的評定。擴(kuò)展不確定度為U=7.0%（k=2），建立的不確定度評定方法可適用于化妝品的合格性判斷。楊蘭花等[32]為減少實驗計算誤差，對一種化妝品微生物菌落總數(shù)進(jìn)行不確定度的評定。對同一樣品由同一操作人員采用同一方法重復(fù)測試，用兩種不同的評定方法，分別取平均值以及對數(shù)平均值作為測試結(jié)果，表明菌落總數(shù)檢測結(jié)果分散性較大時宜采用對數(shù)平均值作為測試結(jié)果進(jìn)行評定?；瘖y品微生物檢驗的測量不確定度的來源主要包括樣品的均勻性、取樣的重復(fù)性、人員的操作技術(shù)、人員的計數(shù)與修約等。

4 結(jié)語

在我國根據(jù)法律法規(guī)及標(biāo)準(zhǔn)要求進(jìn)行微生物檢驗具有非常重要的現(xiàn)實意義，而測量不確定度經(jīng)過多年的發(fā)展，其計算方法己經(jīng)日趨完善，在微生物檢驗方面應(yīng)用前景非常廣闊，對于提高微生物檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性有著積極意義。測量不確定度在微生物檢驗方面的應(yīng)用將在檢驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計處理、方法學(xué)驗證、限度制訂、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)起草方面發(fā)揮巨大的作用。