口岸植物檢疫脫毒處理技術(shù)研究進展

張麗杰，劉 娟，鄭春生*，王娓辰，姜 濤，魏亞東

1中國海關(guān)科學(xué)技術(shù)研究中心，北京 100026；2天津海關(guān)動植物與食品檢測中心，天津 300461

隨著世界貿(mào)易的不斷發(fā)展，我國深度參與到頻繁的國際農(nóng)業(yè)貿(mào)易中，如種苗、花卉、水果、蔬菜等植物及其產(chǎn)品的貿(mào)易往來和世界園藝博覽會等園藝展覽活動。上述農(nóng)業(yè)貿(mào)易的發(fā)展，在帶動國內(nèi)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的同時，也極大地提升了包括植物病毒在內(nèi)的有害生物的傳入風(fēng)險。經(jīng)中國檢驗檢疫科學(xué)研究院動植物檢疫信息資源共享服務(wù)平臺(http:∥info.apqchina.org/)查詢，近年來我國多次在進境植物及其產(chǎn)品中檢出檢疫性病毒，例如：2017年2月，天津口岸首次在澳大利亞進境的燕麥AvenasativaL.干草中檢出小麥線條花葉病毒(Wheatstreakmosaicvirus, WSMV)；2017年5月，福州口岸首次從荷蘭進境花卉種球中檢出虎眼萬年青花葉病毒(Ornithogalummosaicvirus, OrMV)；同年12月，廈門口岸首次從旅客進境攜帶的行李中截獲了攜帶朱頂紅花葉病毒(Hippeastrummosaicvirus, HiMV)和尼潤潛隱病毒(Nerinelatentvirus, NeLV)的花卉種子。僅2017、2018年，我國進境植物及其產(chǎn)品檢出檢疫性病毒近600余批次，植物病毒疫情高發(fā)嚴(yán)重威脅我國生物安全。

目前，由于缺乏有效的病毒脫除技術(shù)，口岸對截獲的攜帶檢疫性病毒的貨物一般做退運或銷毀處理。但是，實際工作中，對于價值較高的貨物或從國外引進的一些稀有種質(zhì)資源、優(yōu)質(zhì)種苗在發(fā)現(xiàn)攜帶病毒后直接銷毀處理，不管從經(jīng)濟價值還是科研應(yīng)用價值考慮都不夠理想，不能滿足行業(yè)發(fā)展的需要。因此，研究植物檢疫脫毒處理技術(shù)，在保證我國生物安全的前提下，將更多的優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源和植物及其產(chǎn)品引入國內(nèi)，對于促進我國經(jīng)濟貿(mào)易和種業(yè)生態(tài)多樣化發(fā)展具有重要意義。本文對現(xiàn)有的植物病毒脫毒技術(shù)進行了簡要介紹，重點對不同種類貨物可采用的檢疫脫毒處理技術(shù)進行總結(jié)，以期為植物檢疫脫毒處理技術(shù)的研究與應(yīng)用提供相關(guān)依據(jù)。

1 植物脫毒處理技術(shù)概述

植物脫毒處理是指應(yīng)用物理、化學(xué)、生物學(xué)等方法，去除植物所感染的病毒，使之無害化的過程(國家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會，2010)。目前，常用的植物脫毒處理的方法包括莖尖培養(yǎng)脫毒、熱處理脫毒、化學(xué)處理脫毒、低溫療法脫毒、其他脫毒處理和組合技術(shù)應(yīng)用。

1.1 莖尖培養(yǎng)脫毒

植物莖尖脫毒是利用病毒在植物莖尖或生長點分布含量最低或者幾乎無病毒的現(xiàn)象，通過切取莖尖組織進行培養(yǎng)得到無病毒苗的方法。其原理是：病毒的復(fù)制和傳播需借助維管束和胞間連絲，然而維管束一般存在于植物莖、葉等器官中，莖尖中只有胞間連絲，病毒被復(fù)制的速度遠低于細胞生長速度，且大多數(shù)病毒還需要借助運動蛋白來對細胞之間連絲進行修飾，才可能使病毒核酸順利通過，因此該區(qū)域不可能帶有病毒(朱新生和朱玉賢，1997)，可利用這種方法進行莖尖培養(yǎng)脫毒。

1.2 熱處理脫毒

熱處理脫毒是利用病毒對高溫的忍耐性和敏感性差異，通過一段時間的高溫處理，達到殺滅病毒的方法。熱處理脫毒技術(shù)的原理是：高溫可以斷裂病毒的RNA，使病毒顆粒鈍化；病毒內(nèi)部酶的裂解造成病毒顆粒破壞；一些輔助酶，如特定的RNA聚合酶的鈍化導(dǎo)致病毒RNA停止合成；在高溫下，病毒外殼蛋白構(gòu)型發(fā)生變化，病毒包裝受阻(詹康英，2018)。

1.3 化學(xué)處理脫毒

化學(xué)處理脫毒法是指將相應(yīng)的抗病毒藥劑添加于培養(yǎng)基(培養(yǎng)基中為莖尖外植體離體培養(yǎng)環(huán)境)中，得到無病毒苗的方法。其原理是：抗病毒藥劑在三磷酸狀態(tài)下會阻止病毒RNA 帽子結(jié)構(gòu)形成，同時抑制病毒核酸合成，從而抑制病毒復(fù)制，達到除去病毒的目的(王超，2014)。許多化學(xué)藥品(包括嘌呤、嘧啶類似物、氨基酸和抗菌素等)對離體組織和原生質(zhì)體具有脫毒效果，如三氮唑核苷(病毒唑)、5-二氫尿嘧啶(DHT)、雙乙酰-氫-5-氮尿嘧啶(DA-DHT)、8-氮鳥嘌呤、2-硫脲嘧啶、放線菌素、慶大霉素、堿性孔雀綠及環(huán)乙酰鞍等。

1.4 低溫療法脫毒

低溫療法脫毒技術(shù)是指將植物的細胞、組織或器官置于極低溫度條件下(通常用液氮，-196 ℃)的保存技術(shù)(Bustametal., 2016)。其原理是：基于超低溫保存對細胞的選擇性破壞，將組織培養(yǎng)和病毒檢測技術(shù)相結(jié)合以達到脫毒的目的。從理論上來說，超低溫處理條件下，易感染病毒的大細胞內(nèi)含水量較大，處理過程中易受冷凍危害死亡，而頂部分生組織水分較少，細胞質(zhì)地濃，小莖尖容易成活，分化成小芽，長成脫毒苗(趙習(xí)武等，2013)，這樣處理后可得到無毒的植物苗。

1.5 其他脫毒處理方法

除上述幾種脫毒處理方法外，目前的植物脫毒處理方法還包括離體微型嫁接、霧化脫毒、基因抗病毒方法等。離體微型嫁接是在超凈工作臺上將植物的莖尖切取下來嫁接到組培砧木上，以達到脫除病毒的方法(張卉等，2003)。霧化脫毒是將植物根系組織放置在避光的容器里，通過霧化營養(yǎng)液對其定期噴灑，植物根系可以借此獲得營養(yǎng)，滿足生長過程中所需的營養(yǎng)和水分，脫去病毒。基因抗病毒是對病毒進行基因介導(dǎo)抗性。Liuetal.(2007)將6個侵染核果類病毒李痘病毒(Plumpoxvirus, PPV)、李矮縮病毒(Prunedwarfvirus, PDV)、李屬壞死環(huán)斑病毒(Prunusnecroticringspotvirus, PNRSV)、番茄環(huán)斑病毒(Tomatoringspotvirus, ToRSV)、美國李線紋病毒(Americanplumlinepatternvirus, APLPV)、桃花葉病毒(Peachmosaicvirus, PMV)的部分片段融合為400～500 bp大小的嵌合基因，構(gòu)建 RNAi載體，接種轉(zhuǎn)基因本生煙Nicotianabenthamiana植株后獲得PDV、PPV和ToRSV 抗性轉(zhuǎn)基因株系。

1.6 組合技術(shù)脫毒

根據(jù)植物感染病毒種、寄主耐受性以及病毒濃度等，使用多種脫毒技術(shù)組合的方法進行植物脫毒。組合技術(shù)脫毒主要采用莖尖培養(yǎng)與其他脫毒技術(shù)組合的方式，如熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒，熱處理脫毒周期長，脫毒率較低，而莖尖培養(yǎng)脫毒效果好，但植株或繁殖材料存活率較低，將2種脫毒方法相結(jié)合以達到更好的脫毒效果。此外，化學(xué)藥劑結(jié)合莖尖培養(yǎng)、熱處理脫毒技術(shù)，不但可以降低莖尖培養(yǎng)的難度，還可以降低化學(xué)藥劑的濃度或減少化學(xué)藥劑的使用。

2 進境植物及產(chǎn)品的檢疫脫毒主要技術(shù)應(yīng)用

根據(jù)我國進境的植物及其產(chǎn)品主要種類及其可能傳帶的檢疫性病毒，本文歸納總結(jié)了不同種類貨物檢疫性病毒的脫毒處理技術(shù)，旨在為口岸植物病毒的脫毒處理提供參考。

2.1 種球及苗木

我國為花卉種球進口大國，主要進口的花卉種球有郁金香TulipagesnerianaL.、百合Liliumbrowniivar.viridulumBaker、水仙Narcissusspp.、風(fēng)信子HyacinthusorientalisL.等。此外，還進口蘋果MaluspumilaMill.、葡萄VitisviniferaL.樹苗等多種苗木。種球和苗木可傳帶多種檢疫性病毒，如果沒有有效的檢疫脫毒處理技術(shù)，將嚴(yán)重影響種苗的擴繁和相關(guān)種植業(yè)的發(fā)展。目前，國內(nèi)外對種球和苗木中傳帶的檢疫性病毒，主要采用熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)組合處理方法，該方法可有效脫除此類貨物中傳帶的檢疫性病毒，得到無病毒種苗，用于擴繁和種植。

高慧卿等(2010)將攜帶百合無癥病毒(Lilysymptomlessvirus, LSV)的百合切去0.2～0.5 mm莖尖進行組織培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單獨進行莖尖培養(yǎng)與30 min熱處理后進行莖尖培養(yǎng)比較，脫毒率由63.89%提高到74.65%。劉博(2009)采用剝莖尖(約2 mm)結(jié)合高溫變溫(白天38 ℃、10 h，夜間32 ℃、14 h)對東方百合″Tiber″攜帶LSV商品球進行全暗培養(yǎng)，持續(xù)處理一個月后，脫毒率達100%。鄭荔丹等(2018)研究證明，對蝴蝶蘭PhalaenopsisaphroditeRchb.F.中的齒蘭環(huán)斑病毒(Odontoglossumringspotvirus, ORSV)，采用熱處理和莖尖培養(yǎng)相結(jié)合的方法進行無病毒苗木的培育，所取莖尖大小一般為0.5～2.0 mm，熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)可將脫毒率提高30%～40%。

Zhaoetal.(2018)使用莖尖培養(yǎng)脫毒技術(shù)對蘋果莖溝病毒(Applestemgroovingvirus, ASGV)進行脫毒，發(fā)現(xiàn)在1.5 mm的莖尖內(nèi)，含有4～5個葉原基的莖尖成活率能達到100%。研究表明，將離體的蘋果試管苗在恒溫39 ℃熱處理6 d后，切取一定大小的莖尖培養(yǎng)，可完全脫出″Idared″蘋果中的病毒(Paprsteinetal.,2008)。將“金冠”“紅星”和“國光”3個蘋果品種在(37±1)℃ 條件下恒溫?zé)崽幚恚?5～28 d后進行莖尖培養(yǎng)，蘋果莖痘病毒(Applestempittingvirus, ASPV)、ASGV和蘋果褪綠葉斑病毒(Applechloroticleafspotvirus, ACLSV)脫除率達100%(Paprsteinetal.,2009; Paunovic & Jevremovic,2006)。

2.2 植物種子

我國每年大量進口各類植物種子，包括如黃瓜CucumissativusL.、甜菜BetavulgarisL.、菠菜SpinaciaoleraceaL.、辣椒CapsicumannuumL.、苦瓜MomordicacharantiaL.、蘿卜RaphanussativusL.、芫荽CoriandrumsativumL.、胡蘿卜DaucuscarotaL.var.sativaHoffm.、番茄LycopersiconesculentumMill.、生菜LactucasativaL.var.ramosaHort.等蔬菜種子以及草種、花種，部分種子中也檢出多種病毒，如從印度尼西亞辣椒種子種截獲ToRSV，從俄羅斯進境的黃瓜種子截獲黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumbergreenmottlemosaicvirus, CGMMV)，從意大利和丹麥進境的菠菜種子中截獲藜草花葉病毒(SowbanemosaicSobemovirus, SoMV)。目前，蔬菜種子中含有的檢疫性病毒可采用化學(xué)藥劑處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)方式進行脫毒處理，得到無毒種子。該方法在口岸種子脫毒中的應(yīng)用目前還未見報道。

早在20世紀(jì)20年代Duggar & Armstrong(1925)就從商陸PhytolaccaacinosaRoxb中得到了具有抗煙草花葉病毒(Tobaccomosaicvirus, TMV)的活性物質(zhì)。Schusteretal.(1990)從化學(xué)合成的物質(zhì)中篩選出DHT(2,4-二氧六氫-1，3，5-三嗪)能夠?qū)︸R鈴薯X病毒(PotatovirusX, PVX)、馬鈴薯Y病毒(PotatovirusY, PVY)、馬鈴薯A病毒(PotatovirusA, PVA)、黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus, CMV)、番茄花葉病毒(Tomatomosaicvirus, ToMV)和煙草脆裂病毒(Tobaccorattlevirus, TRV)有一定的抑制作用。曲岐凡等(1999)進一步研究發(fā)現(xiàn)，合成的1，3，5-三(氯乙酸)-三乙基DHT的酯類化合物，對TMV的抑制率可達90%。謝嘉華和袁建軍(2002)證明，三氮唑核苷對CMV、PVX、TMV等多種病毒生長具有抑制作用，用添加三氮唑核苷的培養(yǎng)基培養(yǎng)帶毒植株一段時間后，取萌發(fā)的頂芽移植到不含三氮唑核苷的培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，可增加產(chǎn)生無病毒后代植株的百分率。目前，應(yīng)用于植物病毒病的新藥劑還包括植病靈乳劑，其對小麥TriticumaestivumL.、蔬菜及煙草的花葉病ChrysanthemumvirusB、蕨菜病有良好的抑制效果，對番茄花葉病和矮縮病的抑制率在85%以上。83增抗劑能降低病毒在植物體內(nèi)的擴散速度。弱毒疫苗N14和衛(wèi)星核糖核酸S52能夠抑制花葉病毒。此外，結(jié)合口岸實際處理情況，應(yīng)用干熱處理方式脫除種子病毒的研究較多，效果更為理想。

2.3 糧谷等大宗散貨

糧谷、飼草等大宗散貨是植物病毒傳帶的主要載體，在進境飼草中檢出小麥線條花葉病毒(Wheatstreakmosaicvirus, WSMV)，我國口岸在進境大豆中檢出菜豆莢斑駁病毒(Beanpodmottlevirus, BPMV)等。

除借助接穗、種子或塊莖間摩擦傳染外，植物病毒主要通過節(jié)肢動物、線蟲、真菌在寄主表皮形成傷口的方式進行傳播。數(shù)據(jù)表明，在700多種植物病毒中，76%的病毒被證明或懷疑是由節(jié)肢動物、線蟲或真菌傳播，這些植物病毒有1/4侵染植物并可造成生物學(xué)上的病害(Franckietal.,1991)。由于傳毒介體具有自主移動性，因此，它比寄主植物具有更強的傳毒能力。

在口岸植物檢驗檢疫中，應(yīng)考慮來自檢疫性病毒高發(fā)地區(qū)的進境寄主植物。進境檢疫時未檢出病毒，但是檢出了易傳播病毒的介體生物，應(yīng)對其進行檢疫處理，以防止檢疫性病毒在我國境內(nèi)傳播、擴散。我國32種進境植物檢疫性病毒中，能夠傳毒的介體類群主要包括昆蟲(23種病毒)、螨(2種病毒)、線蟲(8種病毒)和真菌(3種病毒)，其中以昆蟲(蚜蟲、粉虱、粉蚧、葉甲和薊馬等)傳播的病毒種類數(shù)最多(馬駿等，2015)。昆蟲是傳播植物病毒的主要介體，以同翅目類昆蟲傳毒最多，其中242種蚜蟲傳染病毒，約占介體傳播病毒種類的50%；其次是薊馬類、甲蟲類、潛葉蠅、螨類等。

對糧谷、飼草等大宗散貨可能傳帶檢疫性病毒的處理，口岸一般采用定點加工和加強后續(xù)監(jiān)管等管理措施進行控制，確保植物病毒疫情無擴散。目前對于此類貨物的植物病毒檢疫應(yīng)用最為成熟的是化學(xué)處理方法。化學(xué)藥劑能夠?qū)崿F(xiàn)對病毒的抑制，同時起到殺滅傳毒介體昆蟲的效果。為防止加工或后續(xù)監(jiān)管過程中的植物病毒隨介體昆蟲或媒介生物進行遠距離傳播，對于蚜蟲等，可采用化學(xué)殺蟲劑進行噴殺，對于貨物中可能發(fā)生的昆蟲、螨類等節(jié)肢動物可采用化學(xué)熏蒸進行處理，防止植物病毒疫情通過傳毒介體生物擴散。

3 小結(jié)與展望

植物病毒的多樣性和傳染性對農(nóng)業(yè)、林業(yè)及花卉養(yǎng)殖的危害巨大。在我國進境植物檢疫性有害生物名錄中(中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部，2007)，對于病毒和類病毒的規(guī)定已達39種(截至2017年6月)，口岸檢驗?zāi)軌驅(qū)⒅参锊《具M行攔截，防止病毒進入我國國境。運用適宜的植物脫毒技術(shù)對這些病毒進行無害化處理是目前研究的重要方向。

植物脫毒技術(shù)的運用，對于減少經(jīng)濟損失，避免帶毒植物對我國生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生危害都具有重要意義。研究植物脫毒方法時應(yīng)結(jié)合實際考慮：一是考慮不同病毒的脫毒方法差異，二是考慮對植物本身是否有影響。在目前已應(yīng)用的脫毒處理方法中，具體選擇使用熱處理脫毒，還是化學(xué)藥劑處理脫毒或者其他的脫毒方式，需根據(jù)待處理的貨物屬性來確定。對花卉種苗、水果進行處理時一般采用熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)的脫毒方法，效果較好且操作方便；化學(xué)藥劑、低溫療法與莖尖培養(yǎng)處理相結(jié)合也能有效地對一些病毒進行脫除。蔬菜種子的脫毒，可以利用隔離溫室培育種苗，然后切取外植體或莖尖添加化學(xué)藥劑進行脫毒處理。糧谷、飼草類貨物的脫毒，考慮到此類貨物病毒或者潛在病毒傳毒介體的影響，可以采用化學(xué)熏蒸和殺蟲劑噴殺的方式進行脫毒處理。這些都需要在處理前考慮病毒植株及繁殖材料的抗性及耐受性?，F(xiàn)行檢疫處理標(biāo)準(zhǔn)中植物脫毒主要是低溫法操作，對其他綜合高效脫毒方法的規(guī)定較少。

本文通過對不同寄主植物攜帶的不同病毒進行脫毒技術(shù)分析與比較，特別是檢疫性病毒高發(fā)地引進的寄主植物的病毒脫毒技術(shù)，為口岸植物病毒的無害化處理工作提供了一些基本參考。筆者認(rèn)為，即使未檢測出病毒，也需對傳毒介體進行處理，以保證不攜帶病毒進入我國境內(nèi)。隨著技術(shù)的發(fā)展與研究的深入，口岸植物檢疫脫毒技術(shù)的方法和應(yīng)用也會進一步創(chuàng)新和完善。