熊去氧膽酸小檗紅堿酯的制備

龍碩，劉珍寶，彭東明，劉曉欽，蔣婷，劉艷飛

（1.中南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙，410083；2.中南大學(xué)湘雅藥學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙，410013；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙，410208）

小檗堿（berberine，BBR）是天然藥物黃連中的主要有效成分，故又稱為黃連素。小檗堿化學(xué)結(jié)構(gòu)是一類含喹嗪的生物季銨堿[1-2]。研究表明小檗堿作為一類天然產(chǎn)物，毒副作用小，具有降血脂[3]、降血糖[4]、抗菌[5]、抗腫瘤[6]等藥理作用。小檗堿由于其溶解性和滲透性差，在體內(nèi)不容易被吸收，生物利用度低，因此，對(duì)小檗堿進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾成為了研究熱點(diǎn)[7]。目前，對(duì)小檗堿的結(jié)構(gòu)修飾主要集中在其異喹啉環(huán)的N（7），C（8），C（9），C（12）和C（13）這5個(gè)位置單位點(diǎn)或者雙位點(diǎn)改造。BIAN等[8]將小檗堿芳香族季氮還原為叔氮，然后烷基化生成N-烷基衍生物，再氧化生成N-氧化物，并探究了體外的降糖活性。YANG 等[9]以小檗堿為原料，以環(huán)小檗堿為先導(dǎo)化合物合成了一系列新的8-取代環(huán)小檗堿衍生物，研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)革蘭氏陽(yáng)性病菌的抗菌活性比小檗堿的強(qiáng)。LIU 等[10-11]合成了一系列新的9-O 取代小檗堿衍生物，并對(duì)其抗炎活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，與小檗堿相比，布洛芬和萘丙嗪修飾的小檗堿衍生物具有增強(qiáng)抗炎活性的作用。ENKHTAIVAN等[12]在小檗紅堿C（12）上連接哌嗪類分子，合成了哌嗪類小檗堿衍生物，并發(fā)現(xiàn)小檗堿衍生物的抗流感活性較小檗堿的強(qiáng)，其中，對(duì)氟苯基取代的哌嗪小檗堿抗流感活性較對(duì)照藥物奧司他韋強(qiáng)。PARK等[13]通過在小檗堿和小檗紅堿的13-C中引入不同的芳香基團(tuán)，合成了一系列13-取代芐基的小檗堿和小檗紅堿衍生物，并對(duì)其抗真菌活性進(jìn)行了研究，研究發(fā)現(xiàn)合成的化合物具有比小檗堿和小檗紅堿更強(qiáng)的抗真菌活性。鑒于此，基于小檗堿藥物功能需求，各類不同藥理活性的修飾基團(tuán)或化合物被設(shè)計(jì)并連接于小檗堿各個(gè)位點(diǎn)，為小檗堿衍生物合成提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。熊去氧膽酸（ursodeoxycholic acid，UDCA）最初由北極熊膽內(nèi)提取出來，作為一種次級(jí)膽酸[14]，其結(jié)構(gòu)中包含甾體母體及羥基、羧基雙官能團(tuán)。傳統(tǒng)中藥中熊膽曾被用來清除毒素、治療肝疾和眼疾[15]。現(xiàn)階段研究報(bào)道UDCA 具有溶解膽固醇結(jié)石[16]，有利于治療膽汁淤積性肝功能疾病，并顯著降低膽汁中膽固醇飽和度的優(yōu)良藥物性能[17]。在藥理學(xué)方面，因?yàn)樗哂泻芎玫寞熜覜]有毒副作用，被認(rèn)為是很好的治療膽結(jié)石的藥物[18]。因此，UDCA 在臨床上主要用于治療高血脂和肝膽疾病[19]。本文作者擬以熊去氧膽酸修飾9-O 小檗堿，期望2種具有降脂功能的藥物能在體內(nèi)發(fā)揮出協(xié)同作用，并通過引入熊去氧膽酸，改善小檗堿酯油水分配系數(shù)以提高生物利用度，增強(qiáng)降脂活性。通過直接偶聯(lián)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，小檗紅堿修飾位點(diǎn)酚羥基酯化活性較低，且空間位阻大，難以與熊去氧膽酸直接酯化連接，故采用橋連[20]的方法修飾小檗堿。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 樣品與試劑

樣品有小檗堿（湖南湘泉制藥有限公司生產(chǎn)）和熊去氧膽酸（湖南云港生物科技有限公司生產(chǎn)），其他試劑和溶劑均為分析純。

1.2 小檗紅堿的制備

稱取10.0 g（0.028 mol）小檗堿，在溫度為190 ℃、壓力為2.67 kPa 真空干燥箱中反應(yīng)0.5 h，小檗堿黃色粉末完全變?yōu)榘导t色固體。將小檗堿黃色粉末冷卻至室溫，將其用中性氧化鋁柱（流動(dòng)相用乙醇與二氯甲烷體積比（V（乙醇）：V（二氯甲烷））為1：9）進(jìn)行分離，濃縮收集液，于35 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到暗紅色純品化合物Ⅰ小檗紅堿，產(chǎn)率為94.6%。

1.3 直接酯化法制備熊去氧膽酸小檗紅堿酯

稱取0.50 g（1.56 mmol）小檗紅堿置于50 mL圓底燒瓶中，加入20 mL 除水CH3CN，超聲使其充分溶解，然后在體系中加入0.095 g （0.78 mmol）4-二甲氨基吡啶（DMAP）和0.61 g（1.56 mmol）熊去氧膽酸，在恒溫磁力攪拌器上攪拌5 min 后加入0.15 g （0.78 mmol）1-乙基-（3-二甲基氨基丙基碳二亞胺鹽酸鹽）（EDCI），在25 ℃下攪拌反應(yīng)12 h，利用薄層色譜（TLC）（V（乙醇）：V（二氯甲烷）=1：10 為流動(dòng)相）監(jiān)測(cè)反應(yīng)。

1.4 熊去氧膽酸-β-溴乙酯的制備

稱取1.0 g（2.55 mmol）熊去氧膽酸白色粉末置于50 mL圓底燒瓶中，將其溶于10 mL二甲基甲酰胺（DMF）溶液并在體系中滴加3 mL 1，2-二溴乙烷，在不斷攪拌下加入1.4 g K2CO3。對(duì)反應(yīng)體系在常溫（25 ℃）下攪拌，利用TLC（V（乙酸乙酯）：V（石油醚）=2：1，為流動(dòng)相）監(jiān)測(cè)，4 h反應(yīng)完全。過濾除去反應(yīng)液中K2CO3固體，加入20 mL 氯仿萃取3次，收集合并萃取液，先后用50 mL飽和NaHCO3溶液、50 mL 飽和NaCl 溶液洗滌，洗滌后加入適量無水MgSO4干燥24 h。于30 ℃旋蒸濃縮反應(yīng)液，以硅膠為固定相，V（乙酸乙酯）：V（石油醚）=1：1為流動(dòng)相進(jìn)行柱層析分離，收集合并分離液，蒸干溶劑得白色粉末狀固體，得目標(biāo)化合物Ⅱ，產(chǎn)率為73.1%。

1.5 熊去氧膽酸-（9-O-乙基）-小檗紅堿酯的合成

稱取0.50 g（1.4 mmol）化合物Ⅰ，0.75 g（1.5 mmol）化合物Ⅱ以及0.025 g KI（0.15 mmol）于50 mL 圓底燒瓶，加入10 mL DMF 使其充分溶解，體系在60 ℃下攪拌反應(yīng)10 h，利用TLC監(jiān)測(cè)，反應(yīng)完全。冷卻至室溫，滴加乙醚至析出晶體，將其抽濾，濾餅于35 ℃真空干燥12 h，得到粗品黃色固體。粗產(chǎn)品以中性氧化鋁柱為固定相，V（乙醇）：V（二氯甲烷）=1：10為流動(dòng)相進(jìn)行柱層析分離得暗黃色最終產(chǎn)物目標(biāo)化合物，產(chǎn)率為72.5%。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 熊去氧膽酸小檗紅堿酯合成

熊去氧膽酸小檗紅堿酯的直接偶聯(lián)法合成路線見圖1。

通過對(duì)反應(yīng)條件的多次探究，發(fā)現(xiàn)小檗紅堿與熊去氧膽酸難以直接酯化，分析其原因可能是：一方面，熊去氧膽酸是一類天然有機(jī)弱酸，作為酯化反應(yīng)中心的羧基表現(xiàn)出較低的反應(yīng)活性；另一方面，小檗紅堿中羥基為酚羥基，受苯環(huán)共軛效應(yīng)與臨位甲氧基空間位阻的影響，難以同熊去氧膽酸酯化縮合。而橋連法能有效解決分子間因空間位阻較大而難以偶聯(lián)的難點(diǎn)，因此，將熊去氧膽酸小檗紅堿酯的合成策略改變?yōu)闃蜻B合成法。

熊去氧膽酸小檗紅堿酯的橋連法合成路線見圖2。

圖1 化合物L(fēng)1的合成路線Fig.1 Synthesis route of compound L1

圖2 化合物L(fēng)2的合成路線Fig.2 Synthesis route of compound L2

對(duì)所合成的化合物使用Bruker Avance III 400 MHz 核磁儀進(jìn)行氫譜和碳譜表征，使用Bruker compact Q-TOF質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜表征。

中間體熊去氧膽酸-β-溴乙酯的核磁共振氫譜圖如圖3所示。其1H NMR（400 MHz，CDCl3）表征數(shù)據(jù)為：化學(xué)位移δ 4.38（t， J=6.1 Hz， 2H），3.58 （dd，J=10.3， 5.5 Hz， 2H），3.51 （t， J=6.1 Hz，2H），2.40（ddd， J=15.1， 9.9， 5.1 Hz， 2H），2.34～2.20 （m， 2H），0.95（s，6H），0.68（s，3H）（其中，s指單峰，d指雙重峰，t指三重峰，m指多重峰，dd指雙二重峰，ddd指對(duì)稱的2 個(gè)dd 峰）。由圖3 可以看出：在接入溴乙基之后，在化學(xué)位移4.38和3.58處出現(xiàn)2組三重峰，為溴乙基上乙基的峰，表示小檗紅堿酯成功與熊去氧膽酸相連接，而由于溴乙基的影響，熊去氧膽酸環(huán)上面氫的化學(xué)位移都產(chǎn)生微小變化。

圖3 熊去氧膽酸-β-溴乙酯的核磁共振氫譜圖Fig.31H NMR spectrum of ursodeoxycholic acid-βbromoethyl ester

目標(biāo)化合物熊去氧膽酸小檗紅堿酯的核磁共振氫譜如圖4所示。其1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）表征數(shù)據(jù)為：化學(xué)位移δ 9.85 （s， 1H），8.99（s， 1H），8.22 （d， J=9.1 Hz， 1H），8.02 （d， J=9.1 Hz，1H），7.81（s，1H），7.10（s，1H），6.18（s，2H），4.95（t， J=5.9 Hz， 2H），4.54 （d， J=4.2 Hz， 2H），4.47（t， J=3.4 Hz， 2H），4.07 （s， 3H），0.86 （s， 6H），0.54（s，3H）。由圖4 可知：在化學(xué)位移6~8 之間出現(xiàn)多組峰；對(duì)應(yīng)的是小檗堿母體苯環(huán)上氫的峰；化學(xué)位移4.95 和4.47 對(duì)應(yīng)的是溴乙基的峰；化學(xué)位移0.5~2.5之間對(duì)應(yīng)的是熊去氧膽酸母體的峰。

圖4 化合物L(fēng)2的核磁共振氫譜圖Fig.41H NMR spectrum of compound L2

目標(biāo)化合物熊去氧膽酸小檗紅堿酯的核磁共振碳譜如圖5所示。其13C NMR（101 MHz，DMSO-d6）表征數(shù)據(jù)為：化學(xué)位移173.7，150.6，150.4，148.3， 145.8， 143.0， 138.0， 133.5， 131.1，127.2， 124.1， 122.1， 120.9， 120.8， 108.9，105.9， 102.6， 72.3， 70.2， 70.0， 64.0， 57.6，56.2，55.1，43.6，43.5，42.6，39.1，38.2，37.7，36.3，35.3，34.2，31.3，31.1，30.7，28.6，27.1，26.9，23.8，21.3，18.7，12.5，12.4。碳譜表征結(jié)果與化合物小檗紅堿熊去氧膽酸酯分子式的結(jié)構(gòu)特征相符。

圖5 化合物L(fēng)2的核磁共振碳譜圖Fig.513C NMR spectrum of compound L2

熊去氧膽酸小檗紅堿酯的質(zhì)譜如圖6所示。經(jīng)數(shù)據(jù)分析可知：其分子離子峰質(zhì)荷比（m/z）為740.451 1，這與[C45H58NO8+]的質(zhì)荷比預(yù)測(cè)值740.42相吻合，確定為目標(biāo)化合物。

2.2 反應(yīng)條件優(yōu)化

在酯化反應(yīng)中，將熊去氧膽酸與二溴乙烷反應(yīng)制備出熊去氧膽酸-β-溴乙酯，該步反應(yīng)所優(yōu)化條件與產(chǎn)率見表1。

圖6 化合物L(fēng)2的質(zhì)譜圖Fig.6 Mass spectrum of compound L2

表1 酯化反應(yīng)合成條件Table 1 Synthesis conditions of ester formation reaction

首先對(duì)反應(yīng)溫度進(jìn)行考察。由表1可知：在溫度為20~40 ℃時(shí)，溫度與產(chǎn)率的關(guān)系呈現(xiàn)出近似拋物線關(guān)系；25 ℃時(shí)，產(chǎn)率最高，達(dá)73.1%。造成這種趨勢(shì)的原因在于在堿性環(huán)境中，較低溫度無法提供反應(yīng)所需達(dá)到能壘的能量，從而使得產(chǎn)率稍低；隨著溫度提升，鹵代烴發(fā)生消除反應(yīng)的趨勢(shì)增大，故產(chǎn)率又有所下降，但因?yàn)榭`酸劑K2CO3作為固相與整個(gè)液相體系分離，堿性較低使得下降程度并不十分明顯。而TLC 顯示，反應(yīng)從1 h開始便有產(chǎn)物點(diǎn)生成，4 h后反應(yīng)結(jié)束，延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)率無明顯提升。

選擇DMF、乙酸乙酯（EA）和乙醇（EtOH）為溶劑，發(fā)現(xiàn)熊去氧膽酸能很好地溶于DMF 與EtOH，在EA中溶解度較低，以DMF為溶劑時(shí)產(chǎn)率最高，達(dá)73.1%，而在EA 中反應(yīng)產(chǎn)率稍有降低，這可能是反應(yīng)底物在該溶劑中的溶解度下降所致。雖然底物能很好地溶于EtOH，但產(chǎn)率驟減至17.2%，其原因可能是：作為溶劑的乙醇同時(shí)也是該步親核取代反應(yīng)的競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)，從而導(dǎo)致反應(yīng)不充分，副產(chǎn)物主要為乙基-β-溴乙基醚?？紤]到該步反應(yīng)將產(chǎn)生游離HBr，需要加入適量縛酸劑以促進(jìn)反應(yīng)正向進(jìn)行，根據(jù)已有研究，首先選擇最為常見的K2CO3作為縛酸劑；隨后，考慮到K2CO3的加入使得反應(yīng)體系為非均相反應(yīng)，又選擇常用的有機(jī)縛酸劑吡啶進(jìn)行研究。結(jié)果表明：作為縛酸劑，吡啶的效果略微優(yōu)于K2CO3的效果，產(chǎn)率達(dá)到74.7%，雖然以K2CO3為縛酸劑的產(chǎn)率（73.1%）略低于吡啶為縛酸劑的產(chǎn)率，但考慮到后續(xù)處理簡(jiǎn)便以及試劑的毒性，選擇K2CO3為最優(yōu)縛酸劑。

制備得到熊去氧膽酸-β-溴乙酯后，將其與小檗紅堿進(jìn)行親核取代反應(yīng)，并對(duì)該步反應(yīng)中的反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、溶劑種類、催化劑種類及用量進(jìn)行條件優(yōu)化，結(jié)果見表2。

由表2可見：隨著溫度升高，醚化反應(yīng)產(chǎn)率與溫度呈拋物線關(guān)系，最優(yōu)溫度為60 ℃。當(dāng)催化劑用量為0.10 時(shí)，產(chǎn)率為72.5%；當(dāng)催化劑用量為0.15時(shí)，產(chǎn)率為72.6%。經(jīng)綜合考慮，最優(yōu)條件選用催化劑用量為0.10。結(jié)合酯化反應(yīng)最高產(chǎn)率為73.1%，所得熊去氧膽酸小檗紅堿酯的總收率為53.0%。

表2 醚化反應(yīng)合成條件Table 2 Synthesis conditions of ether forming reaction

在反應(yīng)過程中，酯化反應(yīng)時(shí)間為4 h，而醚化反應(yīng)需10 h 完成，這也進(jìn)一步說明在小檗紅堿與熊去氧膽酸的縮合連接中，小檗紅堿是整個(gè)反應(yīng)的關(guān)鍵，需解決其羥基活性不足、所受空間位阻較大的問題。

在溶劑的選擇上，已驗(yàn)證EtOH作為溶劑對(duì)反應(yīng)體系的消極影響，改用非質(zhì)子溶劑四氫呋喃（THF）。結(jié)果表明，DMF 仍是最優(yōu)的溶劑。最后，考慮到該步反應(yīng)引入了連接點(diǎn)周圍空間位阻較大的小檗堿，選擇鹵酸鹽進(jìn)行催化反應(yīng)，并對(duì)催化劑的種類與用量進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)當(dāng)不使用任何催化劑時(shí)，該步反應(yīng)產(chǎn)率僅有53.6%，而KI 對(duì)該步反應(yīng)有明顯的催化效果，使得產(chǎn)率增加至72.5%。KCl 對(duì)反應(yīng)幾乎沒有催化作用，產(chǎn)率為56.8%。反常的是，KBr的加入使得反應(yīng)產(chǎn)率較不添加催化劑時(shí)更低，產(chǎn)率僅為39.2%，其原因在于溴化鉀的同離子效應(yīng)使得熊去氧膽酸-β-溴乙酯中的溴元素去除難度增加，從而對(duì)反應(yīng)產(chǎn)生了抑制作用。

3 結(jié)論

1）以小檗堿和熊去氧膽酸為原料，通過小檗堿9-O 位酯化，制備了新型化合物熊去氧膽酸-（9-O-乙基）-小檗紅堿酯，并經(jīng)氫譜、碳譜和質(zhì)譜確證了化合物結(jié)構(gòu)。

2）以1，2-二溴乙烷為橋連試劑，克服了小檗堿和熊去氧膽酸連接位點(diǎn)空間位阻過大且反應(yīng)活性較低等問題，成功得到目標(biāo)化合物。此合成工藝簡(jiǎn)單，條件溫和，得到的產(chǎn)物穩(wěn)定，收率高達(dá)53.0%。

3）基于藥物的協(xié)同作用，該熊去氧膽酸修飾的小檗堿衍生物可望成為一種優(yōu)良的降脂藥物用于臨床。