宏基因組學探究原料乳冷藏過程菌群變化規(guī)律

王媛媛，劇 檸，茍 萌，羅玉龍，李璞鈺

（寧夏大學食品與葡萄酒學院，銀川 750021）

0 引 言

原料乳因其營養(yǎng)全面、接近中性的pH值、較高的水分活性為微生物的生長提供了良好的環(huán)境。近年來，原料乳微生物多樣性的研究逐步深入。研究顯示，原料乳中的乳酸桿菌、嗜熱鏈球菌能夠促進乳制品的發(fā)酵；假單胞菌、梭菌、芽孢桿菌是導致乳品腐敗的主要原因；李斯特菌、沙門氏菌、大腸桿菌等可引起食源性疾病；此外乳中還含有能夠產(chǎn)生真菌毒素的真菌[1]。原料乳中微生物多樣性受生理狀態(tài)（如擠奶次數(shù)、內(nèi)源性抗菌酶系統(tǒng)等）以及環(huán)境因素的影響有較大差異。研究表明健康奶牛與乳腺炎奶牛相比，其生產(chǎn)的原料乳具有更高的微生物多樣性和豐富度[2]。有報道還說明原料乳微生物隨季節(jié)及牧場維度的變化存在顯著差異[3-4]。冷藏是抑制原料乳微生物繁殖的重要方法之一，但無法抑制其中的嗜冷微生物。嗜冷微生物通過合成磷脂來適應冷藏溫度，同時水解蛋白質(zhì)與脂肪使原料乳變色、產(chǎn)生異味、黏度增加、凝膠化、酸敗等[5]。有研究利用遺傳多樣性分析探究了冷藏原料乳中與腐敗相關的嗜冷菌，87.5%的菌株表現(xiàn)出蛋白水解和脂解活性[6]?，F(xiàn)階段對原料乳的研究主要集中在嗜冷菌多樣性、菌體生物膜形成能力和產(chǎn)生的酶的特性等方面。有關原料乳嗜冷菌腐敗潛力的研究中指出嗜冷菌的產(chǎn)酶、細胞生物膜形成是菌群數(shù)量增加的主要原因[7]。然而目前對原料乳冷藏期間的菌群變化規(guī)律鮮有報道。

自然界中 99%的微生物無法培養(yǎng)，隨著測序技術的發(fā)展，依托16S rRNA高變區(qū)的高通量測序技術在乳品微生物領域得到普遍應用，但其測序深度和準確性決定了該技術對微生物的注釋僅在屬水平范圍，無法滿足對細菌更深層次的分析研究。宏基因組測序技術將微生物基因組隨機打斷重新組裝成較長序列來探究微生物進化，能夠?qū)⑽锓N注釋到種水平乃至菌株水平，并解析基因功能，成為更為有效的研究手段[8]。了解原料乳微生物及其隨冷藏時間的變化情況，對生鮮乳保藏、液態(tài)乳滅菌控制、奶酪和乳粉加工及乳制品安全具有重要意義[9]。因此，本試驗對 4 ℃冷藏原料乳中的微生物，利用 Illumina Hiseq宏基因組測序平臺，研究貯藏期間細菌群落的變化規(guī)律，從微觀揭示其品質(zhì)變化的機理，從而為冷藏乳及乳制品加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料乳收集及細菌計數(shù)

乳罐原料乳樣品于2019年冬季12月自寧夏銀川市當?shù)啬翀霾蓸?，該牧場原料乳除牧場自產(chǎn)外，還收集當?shù)剞r(nóng)戶優(yōu)質(zhì)原料乳。牧場原料乳平均體細胞數(shù)＜20萬個/mL，菌落總數(shù)＜10 萬個/mL，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度＞3.0 g/100 mL。采樣時無菌取樣并保持4 ℃冷藏，2 h內(nèi)運回實驗室無菌分裝至10 mL分裝瓶繼續(xù)4 ℃下冷藏。根據(jù)國家食品安全衛(wèi)生標準對原料乳進行菌落總數(shù)測定、大腸菌群計數(shù)、嗜冷菌計數(shù)和乳酸菌計數(shù)。細菌計數(shù)冷藏時間點為 2、24、48、72 h，每個時間點取3個乳罐原料乳樣品，共計12個樣品。

1.2 DNA提取

宏基因組學通常會從 16S rRNA分析結果中選取適宜樣本點進一步分析。前期16S rRNA預試驗中，對物種組間差異進行2組比較，發(fā)現(xiàn)差異均不顯著（P＞0.05）。于是結合細菌計數(shù)的方法篩選樣本點。細菌計數(shù)結果顯示組間兩兩比較具有差異性，個別24 h樣本與48 h樣本差異不顯著，可舍去一個時間點。通過16S rRNA物種柱形圖（圖1），發(fā)現(xiàn)24 h樣本為門水平物種豐度的轉折點，因此宏基因測序時間點選擇2、24、72 h。每個時間點取3個乳罐原料乳DNA樣，共計9個樣品，分組編號A0(A01/A02/A03)、A1(A11/A12/A13)、A3(A31/A32/A33)。采用試劑盒改良法進行乳樣DNA的提取，具體如下：將10 mL均質(zhì)原料乳樣在5 000 ×g，4 ℃下離心10 min，去除上清液和脂肪，再加入3 mL無菌水，使用渦旋混勻器將無菌水和菌體沉淀混勻后，5 000 ×g，4 ℃下離心5 min，去除上清液和脂肪，加入2 mL磷酸緩沖鹽溶液（Phosphate Buffer Saline，PBS），混勻后吸取2 mL菌液。使用 QIAGEN DNeasy PowerFood MicrobialKit（100）試劑盒，完成DNA抽提后，運用核酸濃度測試儀和1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性。DNA檢測合格后保存在-20 ℃以便后續(xù)分析。

圖1 基于16S rRNA分析門水平細菌組成Fig.1 16S rRNA analysis of bacteria at phylum level

1.3 宏基因組測序

1.4 基因集構建與豐度計算

使用CD-HIT軟件對預測基因序列進行聚類（參數(shù)設置為：95% identity、90% coverage），每類最長的基因序列用于構建非冗余基因集。使用SOAPaligner軟件將每個樣品的高質(zhì)量reads 與非冗余基因集對比（95% identity），統(tǒng)計基因在對應樣品中的豐度信息。豐度計算方法選用RPKM（Reads Per Kilobase Million）法。

1.5 物種與功能注釋

使用BLASTP（BLAST Version 2.2.28+）將非冗余基因集序列與非冗余蛋白庫（Non-Redundant Protein Sequence Database，NR）、直系同源蛋白分組比對數(shù)據(jù)庫（evolutionary genealogy of genes：Non-supervised Orthologous Groups，eggNOG）（Version 4.5）、京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）進行比對（BLAST比對參數(shù)設置期望值e-value為1e-5），獲得對應的物種注釋與功能注釋后計算豐度。

1.6 統(tǒng)計分析

原料乳細菌計數(shù)按照平均值±標準差計算。物種與功能分析將分組樣本按照求均值進行計算，將豐度小于0.01的物種或功能合并為 others。使用 R語言工具進行Venn圖繪制、群落柱形圖繪制、箱式圖繪制以及基于Bray-Curtis 距離的主坐標分析（Principal Co-ordinates Analysis，PCoA）。組間顯著性差異檢驗運用單因素方差分析（One-way ANOVA）。LEfSe分析選用all-against-all多組比較策略，對樣本按照不同的分組進行線性判別分析（Linear Discriminant Analysis，LDA），找出對樣本劃分產(chǎn)生顯著性差異影響的功能。

2 結果與分析

2.1 原料乳細菌計數(shù)

原料乳中主要可培養(yǎng)微生物隨冷藏時間的變化見表1，結果顯示：原料乳冷藏72 h期間，菌落總數(shù)、嗜冷菌數(shù)、乳酸菌數(shù)、大腸菌群數(shù)均顯著變化（P＜0.001），呈上升趨勢。單因素方差分析顯示嗜冷菌數(shù)、乳酸菌數(shù)、大腸菌群數(shù)在冷藏24 h與48 h無顯著差異，菌落總數(shù)在冷藏24 h與48 h雖呈現(xiàn)顯著差異，但數(shù)量相近。說明24 h與48 h兩樣本點結果差異較小。另外，各細菌計數(shù)冷藏48 h至72 h增幅較大。72 h可做為冷藏期間微生物控制的重要時間點。

表1 原料乳4 ℃冷藏下細菌計數(shù)結果Table 1 Bacterial count of raw milk under refrigeration at 4 ℃

2.2 宏基因組測序和質(zhì)量控制

本研究對3個時期（2，24，72h）的樣本A0、A1、A3（n=3）共計 9個樣品進行了宏基因組測序，測序與組裝信息見表2，結果顯示平均每個樣本產(chǎn)生了43 291 358個總長度為6.5×109bp的原始序列，經(jīng)過質(zhì)控處理后，干凈序列（clean reads）占原始序列的98%以上。拼接組裝得到contigs數(shù)平均為1 003 897，通過基因預測，平均ORF序列數(shù)為398 999。以上數(shù)據(jù)保證了結果的完整性與有效性。

表2 宏基因測序與組裝信息Table 2 Metagene sequencing and assembly information

2.3 物種群落多樣性分析

原料乳4 ℃冷藏樣本物種分布Venn圖（圖2）顯示：屬水平上共注釋到589個菌屬，種水平上共注釋到1 668個菌種。表3為基于種水平的Alpha多樣性分析結果，冷藏期間Chao1指數(shù)與ace指數(shù)呈上升趨勢，說明物種隨冷藏時間的增加而增加；Shannon指數(shù)與Simpson指數(shù)綜合菌群組成豐富度與均勻度反映了樣本的多樣性，數(shù)據(jù)顯示樣本多樣性A0大于A3大于A1，這可能因為原料乳冷藏24 h后不耐冷微生物的豐富度大幅降低，冷藏72 h后嗜冷微生物的大量繁殖使物種多樣性增加。另外，各樣本基于種水平的PCoA分析結果顯示（圖3），組內(nèi)樣本點較聚集，差異較小，各樣本組間區(qū)分較明顯，組間差異較大。說明分組有意義，物種在原料乳冷藏期間有顯著變化。

表3 基于菌種水平的Alpha多樣性Table 3 Alpha diversity based on species level

2.4 物種分類學注釋

2.4.1 屬水平菌群組成分析

本研究注釋到相對豐度大于 0.01的菌屬有 11個（圖4a）。A0樣本中優(yōu)勢菌屬有不動桿菌屬（Acinetobacter）（55.61%）、鏈球菌屬（Streptococcus）（11.53%）、無漿體屬（Anaplasma）（8.59%）、梭菌屬（Clostridium）（2.40%），總占比達78.13%。A1樣本中相對豐度最高的是不動桿菌屬（93.97%）；其次為假單胞菌屬（Pseudomonas）（1.18%）、黃桿菌屬（Flavobacterium）（0.54%）、鏈球菌屬（0.41%），總占比達 96.10%。A3樣本中的優(yōu)勢菌屬為不動桿菌屬（54.21%）、黃桿菌屬（18.26%）、假單胞菌屬（13.57%）、乳球菌屬（Lactococcus）（4.54%），總占比達90.58%。單因素方差分析結果顯示（圖4b）以上菌屬皆為引起組間差異的差異菌屬（P＜0.05）。隨著冷藏時間的延長，不動桿菌屬相對豐度先上升后下降，以冷藏24 h后最高；鏈球菌屬、無漿體屬、梭菌屬相對豐度大幅下降；黃桿菌屬、假單胞菌屬、乳球菌屬相對豐度均大幅上升。原料乳冷藏72 h內(nèi)的菌屬由不動桿菌屬、鏈球菌屬、無漿體屬和梭菌屬向黃桿菌屬、假單胞菌屬和乳球菌屬逐漸演變。

圖2 原料乳4 ℃冷藏樣本物種分布Venn圖Fig.2 Venn diagram of bacteria distribution of raw milk refrigerated samples at 4 ℃

圖3 種水平細菌主成分分析Fig.3 PCoA of bacteria at species level

有關原料乳微生物多樣性的報道中優(yōu)勢菌屬及組成不盡一致。Hahne等[7]使用16S rRNA測序技術對冷藏原料乳進行物種多樣性分析，其結果與本研究較一致，即不動桿菌屬、鏈球菌屬、假單胞菌屬為原料乳主要菌屬，其中不動桿菌屬相對豐度最高。Porcellato等[3]指出寒冷季節(jié)的原料乳中假單胞菌屬含量最多，其次為不動桿菌屬、鏈球菌屬、乳球菌屬和黃桿菌屬。這與本研究注釋到的菌屬種類較一致，但菌屬占比有所差異。Tilocca等[9]指出原料乳中典型的菌屬組成為：乳球菌屬、鏈球菌屬、乳桿菌屬、明串珠菌屬、腸球菌屬、黃桿菌屬、假單胞菌屬、不動桿菌屬、氣單胞菌屬。本研究中，注釋到的明串珠菌屬、氣單胞菌屬相對豐度遠小于1%?？梢?，原料乳中的優(yōu)勢菌屬組成大致相同，相對豐度卻有所差異，產(chǎn)生差異的原因可能與原料乳擠出時的初始環(huán)境、乳本身營養(yǎng)成分及冷藏時間有關。

冷藏 72 h期間原料乳中的微生物菌屬顯著改變（P＜0.05）。鏈球菌屬和梭菌屬可能對原料乳體系的抗菌肽的作用比較敏感，如乳鐵蛋白、溶菌酶、過氧化物等[10-12]，其相對豐度在冷藏24 h后大幅度降低，即鏈球菌屬相對豐度從11.53%降至0.41%，梭菌屬相對豐度從2.4%降至0.03%。無漿體屬是革蘭氏陰性嚴格寄生性致病菌，在牛的紅細胞中生長繁殖[13]，Zhang等[14]從健康山羊分泌的乳汁中檢測到該菌屬。本研究中，無漿體屬由于對環(huán)境的適應性較差，在冷藏24 h后相對豐度大幅降低（8.59%～0.32%）。與此同時，不動桿菌屬由于其耐受低溫的特性，大量的繁殖，成為相對豐度最高的菌屬。這與Quigley等[1]指出不動桿菌在原料乳冷藏期間能夠快速生長的結果相吻合。原料乳中的營養(yǎng)物質(zhì)被微生物不斷消耗，同時產(chǎn)生一系列代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物同樣可以提供給微生物生長所用[9]。本研究中原料乳冷藏72 h，假單胞菌屬、黃桿菌屬、乳球菌屬得到了足夠的生長所需物質(zhì)，成為優(yōu)勢菌屬。

圖4 屬水平細菌組成分析Fig.4 Analysis of bacteria composition at genus level

2.4.2 種水平菌群組成分析

本研究注釋到豐度大于0.01的菌種有16個（圖5a）。A0樣本中優(yōu)勢菌種有不動桿菌TTH0-4（Acinetobactersp.TTH0-4）（41.98%）、嗜吞噬細胞無漿體（Anaplasma phagocytophilum）（8.57%）、肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）（6.06%）、變形鏈球菌（Streptococcus mutans）（5.45%），總占比達62.06%。A1樣本中豐度最高的為不動桿菌 TTH0-4（73.02%），其次為鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii）（2.54%）、約氏不動桿菌（Acinetobacter johnsonii）（1.49%）、波希不動桿菌（Acinetobacter bohemicus）（1.36%），總占比達78.41%。A3樣本中豐度最高的為不動桿菌 TTH0-4（41.63%），其次為寒冷黃桿菌（Flavobacterium frigidarium）（15.24%）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）（9.77%）、魚乳球菌（Lactococcus piscium）（3.29%），總占比達69.93%。單因素方差分析結果（圖5b）顯示以上菌種皆為引起組間差異的菌種（P＜0.05）。所檢測到的優(yōu)勢菌種變化趨勢與相應優(yōu)勢菌屬對應。隨冷藏時間的延長，乳中菌種由不動桿菌TTH0-4、嗜吞噬細胞無漿體、肺炎鏈球菌和變形鏈球菌向寒冷黃桿菌、熒光假單胞菌和魚乳球菌逐漸演變。

圖5 種水平細菌組成分析Fig.5 Analysis of bacteria composition at species level

值得注意的是，除此前研究報道的原料乳中主要致腐菌熒光假單胞菌外，本研究檢測到的不動桿菌TTH0-4、寒冷黃桿菌和魚乳球菌鮮有報道。不動桿菌屬攜帶多種抗生素耐藥因子，在食品安全中受到了較高的重視[3,15]。同時不動桿菌屬具有脂解或蛋白水解能力，也能產(chǎn)生生物膜[6]，具有一定的原料乳腐敗潛力。本研究中，種水平上豐度最高的不動桿菌TTH0-4在原料乳中尚未見報道，此前曾被 Zhang等[16]分離自青藏高原的多年凍土區(qū)，并說明其能夠很好適應寒冷的環(huán)境。該菌的檢出可能與牧場的土壤環(huán)境有關。本研究中另一優(yōu)勢菌種，寒冷黃桿菌屬于黃桿菌屬，其對乳及乳制品的影響除了產(chǎn)生蛋白酶外，還產(chǎn)生磷脂酶C，可降解乳脂球膜的磷脂，繼而改變原料乳苦味成分，對干酪的產(chǎn)量也具有一定影響[17]。該菌過氧化氫酶試驗呈陽性[18]，其分解過氧化氫的能力可能使原料乳中乳糖氧化酶系統(tǒng)因過氧化氫含量的降低而受到影響甚至不被激活[12]。原料乳中的乳球菌屬能將乳糖分解產(chǎn)生乳酸，能夠參與蛋白質(zhì)水解將氨基酸轉化為風味化合物，也有助于脂肪代謝[19]，與乳品品質(zhì)息息相關。本研究中注釋到的魚乳球菌曾被Carraro等[20]在原料乳中檢出，該菌更傾向于在較低溫度下生長，但是它如何參與原料乳的變化過程還未見明確的報道[21]。本研究也檢測到了原料乳中普遍存在的熒光假單胞菌，它能夠產(chǎn)生APRX堿性金屬蛋白酶，該酶不僅可以降解具有類凝乳酶活性的 k-酪蛋白導致乳品在儲存期間發(fā)生凝膠化，而且參與營養(yǎng)物質(zhì)的利用，促進熒光假單胞菌的生長[22-24]。熒光假單胞菌還具有生物膜形成能力，增加該菌滅菌難度的同時，生物膜胞外聚合物（Extracellular Polymeric Substances，EPS）的保護機制會進一步增強酶的熱穩(wěn)定性[25]。因此，熒光假單胞菌是控制原料乳品質(zhì)的關鍵菌種。

2.5 功能注釋

為深入了解微生物演替產(chǎn)生的原因及對冷藏原料乳的影響，進行了微生物群落的COG功能注釋（圖6）。注釋結果中豐度排名第一位的是S（功能未知）。LDA判別結果（圖7）顯示，S在A0樣本中豐度存在顯著差異，lg（LDA值）為 4.99，造成該結果的原因可能是原料乳冷藏初期未知微生物種類豐富，也可能由于冷藏初期微生物的功能較復雜，COG注釋不足以涵蓋所有功能基因。豐度排名其次為 L（復制重組修復）、J（翻譯、核糖體結構與生物發(fā)生）、M（細胞壁/膜/包膜生物發(fā)生）。這說明乳環(huán)境中微生物群落為了能夠快速適應變換的環(huán)境，抗逆性能增加[26]。眾多微生物中發(fā)現(xiàn)的冷休克蛋白能夠感知低溫環(huán)境，作為RNA的分子伴侶可促進轉錄與翻譯[27]。雙組分系統(tǒng)同樣能夠使微生物快速適應多變的環(huán)境，其組成部分應答調(diào)控蛋白能夠與DNA、RNA等結合以對轉錄或代謝過程進行調(diào)控，與組氨酸激酶的協(xié)同能夠調(diào)控細菌生物膜的形成[28]。另外，微生物細胞壁、膜的產(chǎn)生與變化也能夠感知冷刺激[29]。L、J、與M在A1樣本中豐度存在顯著差異，lg（LDA值）分別為 3.81、4.16、4.09。說明原料乳在冷藏24 h后微生物抗逆相關功能豐度較高。不動桿菌屬在此階段為最優(yōu)勢物種，表明其對多變環(huán)境的適應能力相對較強。邵毅等[30]研究也指出不動桿菌耐環(huán)境脅迫的能力較強。

原料乳中微生物進行著復雜的新陳代謝活動。與代謝相關功能豐度最高的為E（氨基酸轉運與代謝），此外I（脂質(zhì)轉運與代謝）與 G（碳水化合物轉運與代謝）也有注釋。其他被注釋的還有無機離子、輔酶、核苷酸、次級產(chǎn)物的轉運與代謝等。體現(xiàn)出了較為全面的代謝系統(tǒng)。LDA判別結果顯示，I在A1樣本中豐度存在顯著差異，lg（LDA值）為 3.98。不動桿菌屬在此期間相對豐度較高，研究表明不動桿菌屬能夠利用碳源合成脂質(zhì)，并使三脂酰甘油、游離脂肪酸等積累[31]。因此推測不動桿菌屬對原料乳碳源及脂質(zhì)的組成影響較大。A3樣本中豐度存在顯著差異的功能為E和G，lg（LDA值）分別為4.10、3.90。此時原料乳菌落總數(shù)、嗜冷菌數(shù)、乳酸菌數(shù)、大腸菌群數(shù)均顯著增加，黃桿菌屬、假單胞菌屬、乳球菌屬豐度占比上升。可能原因是這些微生物在此階段充分利用原料乳中的碳源與氮源生長繁殖，同時，黃桿菌屬、假單胞菌屬產(chǎn)生的蛋白酶將蛋白質(zhì)分解為氨基酸。有研究表明半胱氨酸、蛋氨酸中含硫，分解產(chǎn)生的硫化物濃度過高會使原料乳產(chǎn)生臭味[32]。亮氨酸能夠脫氨脫羧生成異戊醛使原料乳產(chǎn)生麥芽氣味[33]。說明黃桿菌屬與假單胞菌屬可能與原料乳風味的形成密切相關。另外，原料乳中乳糖經(jīng)乳球菌屬利用分解產(chǎn)生葡萄糖與半乳糖進而經(jīng)糖酵解途徑轉換為乳酸或其他有機酸[34]，當原料乳酸度過高時，不耐酸微生物生長受到抑制，同時酪蛋白、乳球蛋白等可能發(fā)生沉淀，使原料乳出現(xiàn)凝塊甚至乳清析出的現(xiàn)象。

圖6 COG功能注釋Circos圖Fig.6 Circos diagram of COG function annotation

通過KEGG功能注釋驗證上述分析。結果與COG功能注釋結果較一致（圖8）。即遺傳信息處理和碳水化合物、氨基酸、脂質(zhì)代謝為主要功能。將氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝、碳水化合物代謝與主要優(yōu)勢微生物進行相關性分析（圖9），結果表明，脂質(zhì)代謝與不動桿菌的相關性更顯著（P＜0.001），氨基酸代謝和碳水化合物代謝與假單胞菌的相關性更顯著（P＜0.01）。該結果為上述COG的功能分析提供有效支撐?？偠灾?，原料乳在冷藏過程中抑菌物質(zhì)減少，微生物利用蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物等營養(yǎng)物質(zhì)得以大量繁殖。原料乳中的蛋白質(zhì)與脂肪被分解產(chǎn)生醛、酮、醇、硫化物、苦味肽等代謝副產(chǎn)物[35-37]，導致乳成分發(fā)生改變，乳成分的改變又影響著微生物生長。可見微生物演替與乳環(huán)境營養(yǎng)物質(zhì)的損耗以及代謝物的積累密切相關。

圖7 COG功能差異判別分析Fig.7 Linear Discriminant Analysis of COG function

圖8 KEGG功能注釋熱圖Fig.8 Heat map of KEGG function annotation

圖9 主要代謝功能與優(yōu)勢微生物相關性分析Fig.9 Correlation analysis between main metabolic functions and dominant microorganisms

3 結 論

利用宏基因組測序技術對原料乳 4 ℃冷藏過程中微生物群落變化及其功能特征進行研究。結果表明：

1）冷藏過程中微生物有顯著的演替現(xiàn)象。其中不動桿菌TTH0-4、寒冷黃桿菌、魚乳球菌在原料乳中的報道較少，需進一步研究。

2）原料乳冷藏前期，微生物通過L（復制重組修復）、J（翻譯、核糖體結構與生物發(fā)生）、M（細胞壁/膜/包膜生物發(fā)生）等功能增加對多變?nèi)榄h(huán)境的抗逆性。

3）不動桿菌屬與脂質(zhì)代謝顯著相關（P＜0.001），對原料乳冷藏前期脂質(zhì)的組成影響較大。假單胞菌屬與碳水化合物代謝、氨基酸代謝顯著相關（P＜0.01），對原料乳冷藏后期蛋白分解及風味形成影響較大。

下一步可通過代謝組學與宏基因組學進行關聯(lián)分析，進一步發(fā)現(xiàn)原料乳冷藏過程菌群變化的機理。