添加殘次蘋果發(fā)酵物對稻草青貯品質(zhì)及其微生物數(shù)量的影響

艾 琪 ，蔣 慧 ※，郭 睿 ，蔣 濤 ，蘇華維

（1.塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，阿拉爾 843300；2.塔里木畜牧科技兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，阿拉爾 843300；3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，北京 100193；4.動物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

0 引 言

2017年國蘋果栽培面積為 250.96 萬 hm2，比 2016年增加1.73%，總產(chǎn)量達(dá)到4 548.40萬t，比2016年增長3.65%[1]。傷殘爛果率一般為 18%～20%，殘次蘋果加工利用率不到 20%[2]。蘋果產(chǎn)業(yè)作為新疆林果業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)，在新疆經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。2018年，僅南疆阿克蘇地區(qū)蘋果產(chǎn)量就達(dá)到了50～60萬t[3]。新疆南疆作為偏遠(yuǎn)地區(qū)，因?yàn)槿鄙偕罴庸?、運(yùn)輸成本較高、產(chǎn)業(yè)鏈短的現(xiàn)象，嚴(yán)重制約著新疆蘋果產(chǎn)業(yè)的優(yōu)化升級，導(dǎo)致殘爛果率高于全國平均水平，而殘次蘋果加工利用率低于全國平均水平，絕大多數(shù)殘次蘋果被拋棄，腐敗變質(zhì)，污染環(huán)境，資源浪費(fèi)相當(dāng)之大。將殘次蘋果制作成發(fā)酵物，能保存其營養(yǎng)價值以便進(jìn)一步利用。目前，有關(guān)殘次蘋果發(fā)酵物作為反芻動物飼料加工利用方面鮮見報道，大多都是研究蘋果渣在反芻動物飼料加工方面的利用[4-6]。

據(jù)統(tǒng)計，2015年中國農(nóng)作物秸稈可收集資源量高達(dá)9億t，稻草可收集量約為1.97 t，其中7.80%的秸稈被直接焚燒，還有19.9%未利用[7-8]。據(jù)2018年《新疆統(tǒng)計年鑒》顯示，新疆有稻草93.50萬t。稻草中含有豐富的粗纖維類碳水化合物，可作為反芻動物重要的粗飼料來源，但稻草營養(yǎng)價值低、適口性差，單純飼喂很難滿足動物的營養(yǎng)需要，其采食量和飼料轉(zhuǎn)化率也很低[9]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)稻草青貯發(fā)酵有助于改善稻草品質(zhì)，但由于稻草附生乳酸菌較少、可溶性碳水化合物含量低等原因，單一青貯很難獲得成功[10]。陳功軒等[11]研究發(fā)現(xiàn)飼用苧麻與稻草進(jìn)行混合青貯之后改善了青貯品質(zhì)，較好地保持原料的營養(yǎng)特性；全林發(fā)等[12]將菠蘿皮和稻草混貯，發(fā)現(xiàn)添加菠蘿皮能夠降低混貯的pH值和NH3-N含量，增加了青貯飼料的乳酸含量，添加 20%以上的菠蘿皮時效果更佳；Li等[13]添加紅薯藤來改善稻草青貯品質(zhì)，降低了青貯的pH值和NH3-N/TN，提高了青貯的乳酸和乙酸含量；He等[14]將辣木葉和稻草混合青貯，改善了混貯的發(fā)酵品質(zhì)，提高了有氧穩(wěn)定性。本文將殘次蘋果發(fā)酵物添加在稻草中青貯，可克服稻草可溶性糖含量低的缺陷，希望為青貯發(fā)酵提供更充足的發(fā)酵底物，獲得優(yōu)良的發(fā)酵品質(zhì)，有利于充分利用新疆本地的農(nóng)副產(chǎn)品資源。

鑒于以上所述，本研究將不同比例殘次蘋果發(fā)酵物添加于稻草中進(jìn)行青貯，旨在探索添加殘次蘋果發(fā)酵物改善稻草的青貯品質(zhì)及其適宜的添加比例，為殘次蘋果發(fā)酵物和稻草的初步利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

殘次蘋果發(fā)酵物是在市場上購買的殘次蘋果添加本研究團(tuán)隊篩選的幾種乳酸菌組合經(jīng)厭氧發(fā)酵而得發(fā)酵產(chǎn)物[15]，稻草購買于周邊團(tuán)場。青貯原料的營養(yǎng)成分和微生物數(shù)量見表1。

表1 原料營養(yǎng)成分和微生物數(shù)量Table1 Nutrient composition and number of microorganisms of raw materials

1.2 試驗(yàn)設(shè)計

試驗(yàn)采用完全隨機(jī)設(shè)計，將殘次蘋果發(fā)酵物與稻草按不同質(zhì)量百分比混合，比例分別為Ⅰ全部為稻草、Ⅱ（1∶9）、Ⅲ（3∶7）、Ⅳ（5∶5）、Ⅴ（7∶3）、Ⅵ（9∶1）共6個處理，每個處理3個重復(fù)。

1.3 青貯飼料的調(diào)制

將稻草切成2～3 cm 左右的長度，殘次蘋果發(fā)酵物和稻草按試驗(yàn)設(shè)計的質(zhì)量百分比混勻，含水率低的組用自來水調(diào)節(jié)含水率至 70%左右（以便壓實(shí)），直接壓入潔凈的 1 L 玻璃廣口瓶中，每組裝填濃度分別為Ⅰ：651 g/L、Ⅱ：662 g/L、Ⅲ：698 g/L、Ⅳ：726 g/L、Ⅴ：755 g/L、Ⅵ：788 g/L，蓋上蓋子后用凡士林和膠帶密封，室溫下保存。青貯制作時對不同比例混合的原料分別進(jìn)行取樣，用于化學(xué)成分分析；90 d 后開蓋取樣，分析青貯飼料營養(yǎng)成分和發(fā)酵品質(zhì)；同時檢測發(fā)酵罐開蓋后第0、1、3、7、15、30天各處理有氧暴露下 pH值和微生物的數(shù)量。

1.4 測定指標(biāo)與方法

1.4.1 青貯原料與青貯飼料營養(yǎng)成分的測定

分別稱取各混合比例發(fā)酵前和發(fā)酵后各 500 g 在烘箱中65 ℃ 烘干至恒質(zhì)量，粉碎后過1 mm篩密封保存?zhèn)溆谩８晌镔|(zhì)（Dry Matter，DM）用 105 ℃ 烘干法測定（DHG-9240A，上海齊欣），粗蛋白質(zhì)（Crude Protein，CP）采用凱氏定氮法測定，中性洗滌纖維（Neutral Detergent Fiber，NDF）和酸性洗滌纖維（Acid Detergent Fiber，ADF）含量用范氏洗滌纖維法測定[16]；可溶性碳水化合物（Water Soluble Carbohydrate，WSC）用蒽酮-硫酸比色法測定[17]。

1.4.2 青貯飼料的感官評定、pH值及發(fā)酵品質(zhì)的測定

青貯90 d后，參考續(xù)元申等方法進(jìn)行感官評定[18]。開瓶取出青貯飼料后，在自封袋中混合均勻，準(zhǔn)確稱取50 g青貯飼料放入1 L 三角瓶中，加2 ℃ 蒸餾水450 mL，用封口膜封口，放入4 ℃ 冰箱中浸提24 h，其間搖晃3～5 次，用滌綸布過濾，并擠盡殘渣中的提取液，用定量濾紙過濾，所得提取液保存?zhèn)溆?。在提取液中加?25%的偏磷酸（浸提液與偏磷酸的體積比為 5∶1），靜置30 min，在1 500 r/min，4 ℃ 狀態(tài)下離心15 min，上清液經(jīng) 0.45μm 濾膜過濾，用高效氣相色譜儀測定乳酸、乙酸等含量[19]。pH值用酸度計（PHSJ-5，上海雷磁）測定。氨態(tài)氮（NH3-N）用苯酚-次氯酸鈉比色法測定[20]。

青貯品質(zhì)的綜合評分：將有機(jī)酸占總酸比例的得分和氨態(tài)氮占總氮的得分相結(jié)合，兩者各占50 %，即綜合得分=（乳酸得分＋乙酸得分＋丁酸得分）/2＋氨態(tài)氮得分[18]。

1.4.3 青貯飼料有氧暴露下微生物數(shù)量的測定

青貯90 d 后，青貯飼料開蓋后各處理分別在第0、1、3、7、15、30天稱取20 g樣品，加入180 mL的滅菌水，并做倍比稀釋，每個稀釋梯度做 3個重復(fù)，采用稀釋平板涂布法對微生物菌落進(jìn)行計數(shù)[21]。乳酸菌、霉菌、酵母菌分別用MRS培養(yǎng)基、高鹽察氏培養(yǎng)基、麥芽糖浸粉瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用分析軟件DPS v3.01專業(yè)版和Excel處理，做單因素方差分析，并做Duncan氏法多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 青貯飼料的感官評定

青貯90 d后，通過觀察殘次蘋果發(fā)酵物與稻草混貯的色澤、氣味、質(zhì)地等對其進(jìn)行評分并將各處理的評價結(jié)果如圖1和表2。處理Ⅰ顏色為黑褐色、有明顯的發(fā)霉腐爛、質(zhì)地發(fā)黏結(jié)塊，pH值是 5.03，青貯感官得分20，等級為劣；處理Ⅱ的pH值是4.45，顏色為淺褐色、有淡酸味、質(zhì)地松軟不黏手，青貯感官得分為50，等級為中；處理Ⅲ和處理Ⅳ的 pH值是 4.07、4.01，顏色為亮黃色、甘酸味舒適、質(zhì)地松軟不黏手，青貯感官得分分別是78、80，等級都是優(yōu)；處理Ⅴ和處理Ⅵ的pH值分別為 3.94、3.43、顏色呈淺褐色和褐黃色、甘酸味舒適、質(zhì)地松軟但黏手，青貯感官得分分別是65、56，等級都是良。

圖1 發(fā)酵90 d后的殘次蘋果發(fā)酵物和稻草混合青貯外觀Fig.1 The appearance of mixed silage with defective apple and rice straw after 90 days fermentation

2.2 混合青貯發(fā)酵前、后的營養(yǎng)成分

由表3可知，各混合青貯比例發(fā)酵前，處理Ⅰ和處理Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的DM含量顯著高于處理Ⅴ、Ⅵ（P＜0.05）。發(fā)酵后，處理Ⅰ和處理Ⅲ、Ⅳ的 DM 含量差異不顯著（P＞0.05），但顯著高于處理Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ（P＜0.05）；混合青貯發(fā)酵前和發(fā)酵后CP含量均隨著殘次蘋果發(fā)酵物在青貯中的比例增加而增加，處理Ⅰ的CP含量顯著低于Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ這4個處理（P＜0.05）；發(fā)酵前和發(fā)酵后處理Ⅰ的 NDF、ADF的含量均顯著高于其他5個處理（P＜0.05），其他各處理中隨著殘次蘋果發(fā)酵物的增加 NDF、ADF的含量逐漸降低；發(fā)酵前 WSC含量隨著殘次蘋果發(fā)酵物的增加逐漸增加，且各處理之間差異顯著（P＜0.05）。發(fā)酵后處理Ⅰ的WSC含量顯著低于其他各處理Ⅵ（P＜0.05），處理Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ之間差異不顯著（P＞0.05）。

表2 混合青貯飼料感官評分Table 2 The sensory evaluation of mixed silage

表3 稻草發(fā)酵前、后的營養(yǎng)品質(zhì)Table 3 Nutritional quality of rice straw before or after fermentation %

2.3 混合青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)及綜合評價

不同比例殘次蘋果發(fā)酵物與稻草混合青貯發(fā)酵品質(zhì)及綜合評價如表4所示。處理Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ的乳酸含量差異不顯著（P＞0.05），但顯著高于處理Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（P＜0.05）；乙酸含量隨著殘次蘋果發(fā)酵物在青貯中的比例增加而增加，處理Ⅰ的AA含量顯著低于其他各處理組（P＜0.05）；處理Ⅱ和處理Ⅵ的丙酸含量均為微量，處理Ⅴ丙酸含量最高；處理Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ之間的丁酸含量差異不顯著（P＞0.05），但顯著低于處理Ⅰ和處理Ⅵ（P＜0.05）；處理Ⅰ的 NH3-N/TN的比值顯著高于其他 5個處理（P＜0.05）。

由綜合評價可知，處理Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ的LA/TA比值均高于50%，處理Ⅰ和處理Ⅱ的LA/TA比值分別為22.37%、30.38%；AA/TA的比值隨著殘次蘋果發(fā)酵物的增多而升高，處理Ⅵ的AA/TA的比值最高（36.10%）；處理Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ的BA/TA比值均低于4%，處理Ⅰ的BA/TA比值最高（28.95%）；各處理綜合得分分別為37.5、76.0、94.5、95.0、90.5、85.0，處理Ⅳ的得分最高。

2.4 有氧暴露后pH值和微生物數(shù)量的變化

pH值的變化如圖2所示。有氧暴露期間，處理Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ的pH值上升緩慢，且差異不顯著（P＞0.05），但顯著低于處理Ⅰ、Ⅱ和Ⅵ（P＜0.05）；并且隨著有氧暴露時間的延長，各處理的 pH值逐漸升高，在有氧暴露第30 天時各處理的pH值均達(dá)到最高。

乳酸菌的數(shù)量隨著有氧暴露時間的延長而減少；在有氧暴露的0～30 d內(nèi)，處理Ⅰ的乳酸菌數(shù)量均顯著低于其他5個處理（P＜0.05）；處理Ⅰ和處理Ⅵ的乳酸菌數(shù)量減少的幅度較大。到有氧暴露第 30 天 時處理Ⅰ的乳酸菌數(shù)量顯著低于其他5個處理（P＜0.05），處理Ⅳ的乳酸菌數(shù)量最多。

酵母菌數(shù)量變化隨著有氧暴露時間的延長而增多，處理Ⅰ、Ⅱ和Ⅵ的酵母菌數(shù)量增多的幅度較大；在有氧暴露第0～7天，處理Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ和Ⅵ酵母菌的數(shù)量迅速增長，以后增長緩慢，處理Ⅳ的酵母菌數(shù)量增加緩慢，并顯著低于其他處理（P＜0.05）；當(dāng)有氧暴露 30 d時，處理Ⅰ的酵母菌數(shù)量仍顯著高于其他各處理（P＜0.05），處理Ⅵ的酵母菌數(shù)量最少。

霉菌數(shù)量隨著有氧暴露時間的延長逐漸增多，處理Ⅰ和Ⅵ的霉菌數(shù)量顯著高于其他處理（P＜0.05）；處理Ⅲ、Ⅳ的霉菌數(shù)量最低，顯著低于其他幾個處理（P＜0.05）。

圖2 有氧暴露過程中混合青貯pH值和微生物數(shù)量的變化Fig.2 Changes of pH value and microbial quantity in mixed silage during oxygen exposure

3 討 論

3.1 添加比例對感官品質(zhì)的影響

感官評價是通過青貯的色澤、質(zhì)地、氣味等來進(jìn)行初步評價青貯是否成功[22]。優(yōu)質(zhì)青貯飼料顏色應(yīng)與青貯原料顏色相近，氣味酸醇有芳香，質(zhì)地柔軟稍濕潤，且無霉變發(fā)生[23]。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，稻草單一青貯90 d后，有明顯腐爛且有霉味，說明稻草單獨(dú)青貯不成功。而添加了殘次蘋果發(fā)酵物的處理Ⅱ～Ⅳ青貯90 d后，由淡酸味變?yōu)楦仕嵛?，顏色由褐黃色變?yōu)榱咙S色；在質(zhì)地方面，松散柔軟不黏手，說明添加殘次蘋果發(fā)酵物可以改善稻草青貯的感官品質(zhì)。處理Ⅴ和處理Ⅵ顏色較深，發(fā)黏結(jié)塊，這可能是由于加入殘次蘋果發(fā)酵物比例較高使得青貯水分含量過高造成的。感官評分中顯示添加殘次蘋果發(fā)酵物與稻草的比例在3:7～5:5之間感官評分最高。

3.2 添加比例對稻草青貯營養(yǎng)成分的影響

青貯是否成功主要受原料糖分含量、水分及壓實(shí)程度的影響[24]。本研究中稻草的水分少、WSC含量低，單獨(dú)青貯品質(zhì)差；而單一的殘次蘋果發(fā)酵物水分高達(dá)92.12%，WSC的含量達(dá)到了15.56%，能夠彌補(bǔ)稻草青貯水分少、WSC含量低的不足。本試驗(yàn)中，隨著稻草青貯中添加殘次蘋果發(fā)酵物比例的增加，青貯原料的 CP和WSC含量增加，為青貯微生物發(fā)酵提供了豐富的底物，是添加殘次蘋果發(fā)酵物改善稻草青貯品質(zhì)的原因之一。這與羅穎潔等[25]通過添加麥麩增加青貯原料中的 CP和WSC含量改善稻秸與苜?；熨A品質(zhì)；李君臨等[26]添加多花黑麥草增加稻草混貯中的CP和WSC改善二者的混貯品質(zhì)的效果一致。

3.3 添加比例對稻草青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響

pH 值是青貯飼料是否發(fā)酵成功的重要指標(biāo)之一，品質(zhì)優(yōu)良的青貯飼料pH值應(yīng)在3.8～4.2之間，發(fā)酵時pH值越低，青貯飼料越容易保存[27]。pH值低于4.6時，蛋白質(zhì)較穩(wěn)定，只有少部分被分解；pH值高于4.6時，腐敗菌、梭菌等雜菌的含量增多青貯飼料的蛋白質(zhì)進(jìn)一步被分解，營養(yǎng)成分損失較多[28]。有研究報道，青貯飼料低pH值能夠抑制蛋白酶的活性，減少蛋白質(zhì)的降解，而且還可以抑制對青貯有害的細(xì)菌生長，保障青貯品質(zhì)[29]。由本試驗(yàn)結(jié)果可知，單一稻草青貯的pH值是5.03，隨著殘次蘋果發(fā)酵物的增多混貯飼料的pH值在逐漸降低，最低為 3.43，說明添加殘次蘋果發(fā)酵物能降低混合青貯飼料的pH值，抑制有害微生物的繁殖。

有研究表明，青貯飼料在乳酸菌作用下，發(fā)酵飼料中的營養(yǎng)物質(zhì)生成大量有機(jī)酸，使青貯飼料的 pH值降低，抑制有害微生物，使乳酸菌成為青貯的優(yōu)勢菌群[30]。在青貯飼料中乳酸含量越高，pH值也就越低，青貯以乳酸發(fā)酵為主，青貯質(zhì)量也就越好[31]。孫雨坤等[32]的研究表明，添加蘋果渣可以彌補(bǔ)苜蓿青貯所需的可溶性碳水化合物，降低了pH值，乳酸含量增加并抑制了其他有害微生物的繁殖。本試驗(yàn)表明，隨著殘次蘋果發(fā)酵物添加比例的增多，乳酸和乙酸含量也逐漸增多，而丁酸含量呈減少的趨勢。這就說明添加殘次蘋果發(fā)酵物的稻草青貯改善了稻草的發(fā)酵品質(zhì)。雖然處理Ⅴ和處理Ⅵ的乳酸和乙酸含量比其他幾個處理都有都高，但丁酸含量也較高，這有可能是因?yàn)樘幚恝鹾吞幚恝鲋兴州^多干物質(zhì)較少導(dǎo)致的。并且綜合評分從低到高的順序?yàn)棰簪螈酡觫颌瘢@與感官評價的結(jié)果一致。

NH3-N/TN被廣泛用于衡量青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的好壞，其比值越大，說明被分解的蛋白質(zhì)和氨基酸越多，青貯質(zhì)量就越差，優(yōu)質(zhì)青貯飼料的NH3-N/TN含量應(yīng)低于10%[33-34]。本試驗(yàn)中，單一稻草青貯（處理Ⅰ）的處理NH3-N/TN高達(dá) 16.28%，說明發(fā)酵品質(zhì)差；其他各處理NH3-N/TN比值均低于10%，達(dá)到優(yōu)良青貯飼料的要求，表明添加殘次蘋果發(fā)酵物能降低蛋白質(zhì)的降解，更好保存飼料營養(yǎng)物質(zhì)。發(fā)酵產(chǎn)物的綜合評分中顯示添加殘次蘋果發(fā)酵物與稻草的比例在3:7～5:5之間綜合評分最高。

3.4 添加比例對稻草青貯有氧暴露 pH值和微生物的動態(tài)變化

青貯飼料在有氧暴露情況下，好氧性微生物就會利用青貯中的養(yǎng)分進(jìn)行繁殖，酵母菌和霉菌數(shù)量增多，乳酸菌受抑制而數(shù)量減少，使得青貯飼料的pH值上升，有氧穩(wěn)定性差[35]。本試驗(yàn)中，有氧暴露期間，處理Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ的pH值上升幅度緩慢，處理Ⅰ、Ⅱ和Ⅵ的pH值上升幅度較快。表明不添加殘次蘋果發(fā)酵物（Ⅰ）、添加過少（Ⅱ）或過多（Ⅵ）青貯飼料有氧穩(wěn)定性差。

有研究發(fā)現(xiàn)，在有氧暴露情況下乳酸菌數(shù)量逐漸減少，而酵母菌和霉菌等好氣性微生物因條件適宜而大量繁殖，導(dǎo)致青貯飼料營養(yǎng)損失并腐敗[36-37]。在本試驗(yàn)中，有氧暴露后處理Ⅰ、Ⅱ和Ⅵ的乳酸菌數(shù)量減少的幅度較大，而酵母菌數(shù)量增多的幅度較大，處理Ⅳ的乳酸菌保留最多，處理Ⅰ和Ⅵ的霉菌數(shù)量顯著高于其他處理（P＜0.05）；處理Ⅲ、Ⅳ的霉菌數(shù)量最低。這表明處理Ⅰ、Ⅱ和Ⅵ的有氧穩(wěn)定性差，處理Ⅲ、Ⅳ的有氧穩(wěn)定性較好。各處理的乳酸菌數(shù)量均隨著有氧暴露時間的延長而逐漸減少，酵母菌和霉菌的數(shù)量隨著時間的延長逐漸增多，這與Spadaro等[38]和王旭哲等[39]的研究有相似的結(jié)果。處理Ⅴ和處理Ⅵ的酵母菌和霉菌數(shù)量增加幅度較大，這可能是因?yàn)闅埓翁O果發(fā)酵物水分、可溶性碳水化合物含量較高，添加殘次蘋果發(fā)酵物比例越高混貯中水分和可溶性碳水化合物含量就越高。在有氧暴露情況下，酵母菌和霉菌等好氣性微生物更易大量繁殖有關(guān)，這與周瑞等[40]將甜菜塊根和玉米秸稈混貯的結(jié)果一致。

4 結(jié) 論

1）添加殘次蘋果發(fā)酵物能顯著提高（P＜0.05）單一稻草青貯的可溶性碳水化合物和粗蛋白的含量。

2）添加殘次蘋果發(fā)酵物能顯著提高（P＜0.05）稻草青貯的乳酸和乙酸含量，降低 pH值、丁酸含量和NH3-N/TN的比值，改善青貯的感官品質(zhì)和發(fā)酵品質(zhì)。

3）添加殘次蘋果發(fā)酵物與稻草的比例在3:7～5:5之間適宜。