雙孢蘑菇子實(shí)體氨基酸對(duì)運(yùn)動(dòng)性肌肉酸痛的保護(hù)作用*

楊 靜，白 波

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)體育教學(xué)部，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古大學(xué)體育學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021）

雙孢蘑菇（Agaricus bisporus） 是一種被世界各國(guó)消費(fèi)者廣泛熟知的食用菌[1]，其肉質(zhì)肥厚、營(yíng)養(yǎng)豐富，并含有大量蛋白質(zhì)和氨基酸，能夠增強(qiáng)人體免疫力、滋補(bǔ)強(qiáng)身[2]。人們常在健身運(yùn)動(dòng)后產(chǎn)生疲勞，且長(zhǎng)時(shí)間或過(guò)量的運(yùn)動(dòng)會(huì)使肌肉產(chǎn)生酸痛，影響第二天的工作生活，這實(shí)際是肌肉細(xì)胞輕微受損的表現(xiàn)[3]。已有研究表明，氨基酸是促進(jìn)人體肌肉合成和生長(zhǎng)的重要物質(zhì)[4]。除了可以通過(guò)按摩、拉伸、休息等方式減輕酸痛癥狀外，更重要的是需要給肌肉補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)，特別是補(bǔ)充氨基酸類(lèi)物質(zhì)[5]，以加速人體代謝促進(jìn)乳酸排出，修復(fù)肌肉細(xì)胞，緩解酸痛?？茖W(xué)合理的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)給是緩解肌肉酸痛的重要方法。通過(guò)研究雙孢蘑菇子實(shí)體氨基酸對(duì)運(yùn)動(dòng)性肌肉酸痛的保護(hù)作用，探討雙孢蘑菇氨基酸的功效。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

新鮮雙孢蘑菇，購(gòu)自莘縣七盛菌業(yè)有限公司。特級(jí)菇，菌蓋直徑在 3.0 cm～5.0 cm，菌蓋厚度≥3.0 cm，開(kāi)傘度≤7，水分≤85%，雜質(zhì)≤0.2%，殘缺菇≤1.0%。

試驗(yàn)選用健康雄性SPF級(jí)小鼠，由長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘） 2019-0014。體重（20±3） g，按標(biāo)準(zhǔn)小動(dòng)物飼養(yǎng)方式對(duì)小鼠進(jìn)行分籠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

二水乙酸鋰（AR）、氫氧化鋰（AR），湖北鑫潤(rùn)德化工有限公司；冰乙酸，濟(jì)南英出化工科技有限公司；鹽酸（AR）、氫氧化鈉（AR），河南東科化工產(chǎn)品銷(xiāo)售有限公司；苯酚，山東聚富鑫旺化工有限公司；二甲基亞砜（AR），無(wú)錫市晶科化工有限公司；水合茚三酮、還原茚三酮，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；高純氮?dú)?，唐山錮泰煜氣體銷(xiāo)售有限公司；T-SOD試劑盒，上海研謹(jǐn)生物科技有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

PX124ZH/E電子天平，成都川弘科生物技術(shù)有限公司；新恩FSD-100A植物粉碎機(jī)，吉林省鼎立機(jī)械設(shè)備有限公司；DHG-9240型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，成都瑞派斯科技有限公司；SHA-B雙功能型水浴恒溫振蕩器，常州金壇良友儀器有限公司；NAI-WHC2Z型超聲波微波組合反應(yīng)系統(tǒng)，上海那艾精密實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備；LBA800氨基酸分析儀，天津市蘭博實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司；756PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海醫(yī)用激光儀器廠；QG2015030310型動(dòng)物實(shí)驗(yàn)跑臺(tái)，上海企戈實(shí)業(yè)有限公司；BK-200全自動(dòng)生化分析儀，江陰市飛揚(yáng)器械有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 總抗氧化能力試驗(yàn)

通過(guò)鐵離子還原法對(duì)雙孢蘑菇氨基酸的體外總抗氧化能力進(jìn)行測(cè)定。分別配置30 mg·L-1、20 mg·L-1和10 mg·L-13種濃度的雙孢蘑菇氨基酸溶液，加入三吡啶吖嗪測(cè)試液，混勻后35℃水浴15 min。取出后在595 nm處測(cè)量吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中總鐵的濃度。重復(fù)3次，比較不同濃度的雙孢蘑菇氨基酸溶液的總抗氧化能力。

2.2 雙孢蘑菇氨基酸溶液制備

采用超聲波輔助方法進(jìn)行雙孢蘑菇氨基酸的提取。雙孢蘑菇清洗干凈后經(jīng)切片、烘干、制粉、過(guò)篩，再以1∶30的料液比加水混勻。放入恒溫水浴振蕩器水浴24 h，振蕩器溫度參數(shù)設(shè)置為35℃，振蕩次數(shù)200 r·min-1。取出后再放入超聲微波組合反應(yīng)系統(tǒng)中進(jìn)行提取，超聲波功率參數(shù)設(shè)置為350 W、超聲處理時(shí)間3 min，過(guò)濾后即得雙孢蘑菇氨基酸溶液。

2.3 雙孢蘑菇氨基酸含量測(cè)定

2.3.1 基本原理

使用氨基酸分析儀，采用茚三酮（NIN）柱后衍生法進(jìn)行雙孢蘑菇氨基酸含量測(cè)定，根據(jù)氨基酸經(jīng)陽(yáng)離子交換色譜柱分離后，與茚三酮反應(yīng)，測(cè)量生成的紫色化合物的吸光度。

2.3.2 茚三酮衍生試劑的配制

1） 乙酸鋰溶液配制

稱(chēng)取氫氧化鋰168 g，加入冰乙酸279 mL，用水稀釋至1 000 mL，再用濃鹽酸或50%的氫氧化鈉溶液調(diào)pH至5.2。

2）衍生試劑的配制

取二甲基亞砜150 mL和乙酸鋰溶液50 mL，加入水合茚三酮4.00 g和還原茚三酮0.12 g，攪拌至完全溶解。用 0.22 μm～0.45 μm 的微濾膜過(guò)濾配好的衍生試劑，放置在棕色瓶中充氮進(jìn)行保護(hù)，以防止氧化。

2.3.3 雙孢蘑菇測(cè)試液的配制

稱(chēng)取上述制備的雙孢蘑菇氨基酸溶液100 mL，加 6 mol·L-1的鹽酸 10 mL～15 mL，加 2 滴～3 滴新蒸餾的苯酚。冷凍抽真空，充高純氮?dú)猓貜?fù)抽真空充氮3次，封管。將水解管放于恒溫干燥箱，105℃～110℃水解24 h，取出后冷卻，打開(kāi)水解管，過(guò)濾水解液，洗滌水解管。將水解液轉(zhuǎn)至50 mL容量瓶定容。吸取濾液1 mL于5 mL容量瓶?jī)?nèi)，真空干燥器40℃～50℃水浴蒸干。殘留物用1 mL～2 mL水溶解，再干燥，重復(fù)2次后蒸干。用1 mL的pH 2.2的緩沖液溶解，供氨基酸分析儀進(jìn)行測(cè)定。

2.4 小鼠運(yùn)動(dòng)性肌肉酸痛試驗(yàn)

適應(yīng)性飼養(yǎng)后，按體重將小鼠分成4組（每組10只）開(kāi)展試驗(yàn)。采用動(dòng)物跑臺(tái)建立小鼠肌肉酸痛模型，每天讓小鼠在跑臺(tái)上進(jìn)行2次跑步訓(xùn)練直至力竭。在訓(xùn)練期間，按高劑量組3.0 g·kg-1、中劑量組 2.0 g·kg-1、低劑量組 1.0 g·kg-1，每天經(jīng)口灌胃制備好的雙孢蘑菇氨基酸溶液1次，對(duì)照組灌胃同等劑量的純凈水，連續(xù)30 d。

最后1次小鼠訓(xùn)練結(jié)束后，采用頜下靜脈取血法采集小鼠血樣，用全自動(dòng)生化儀操作規(guī)程進(jìn)行血液指標(biāo)檢測(cè)，主要比較血尿素氮（BUN）和血清肌酸激酶（CK） 水平。

2.5 T-SOD測(cè)定

對(duì)采集的血樣嚴(yán)格按照T-SOD試劑盒操作規(guī)程測(cè)定各組小鼠的T-SOD活性。

2.6 試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，比較高劑量組、中劑量組、低劑量組與對(duì)照組的差異，P＜0.05表示差異具顯著性。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 總抗氧化能力

3種不同濃度的雙孢蘑菇氨基酸溶液的總抗氧化活性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 雙孢蘑菇氨基酸溶液總抗氧化比較Tab.1 Comparison of total antioxidation of amino acid solution of Agaricus bisporus

由表1可知，30 mg·mL-1的雙孢蘑菇氨基酸溶液還原力最強(qiáng)，隨著濃度的下降還原能力逐步降低。高濃度的雙孢蘑菇氨基酸溶液的總抗氧化能力最強(qiáng)，與低濃度組相比具有顯著差異性（P＜0.05）。

3.2 雙孢蘑菇氨基酸含量

經(jīng)分析儀測(cè)定，雙孢菇18種氨基酸含量見(jiàn)表2。

表2 雙孢菇氨基酸含量Tab.2 Amino acid content of Agaricus bisporus

3.3 對(duì)BUN、CK水平的影響

小鼠血液中血尿素氮（BUN）和血清肌酸激酶（CK） 水平檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 血液BUN、CK水平比較Tab.3 Comparison of BUN and CK levels

由表3可以看出，與對(duì)照組相比，高劑量組、中劑量組的BUN和CK水平均具有顯著差異性（P＜0.05），但低劑量組沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異性。說(shuō)明灌胃高劑量組、中劑量的雙孢蘑菇氨基酸溶液，BUN顯著上升而CK則顯著降低，而低劑量的效果不明顯。

3.4 T-SOD試驗(yàn)結(jié)果

不同劑量組小鼠血液中T-SOD活性檢測(cè)結(jié)果，如表4所示。

表4 血液T-SOD活性比較Tab.4 Comparison of blood T-SOD activity in mice

由表4可以看出，與對(duì)照組相比，高劑量組、中劑量組小鼠的T-SOD的活力均呈現(xiàn)顯著增長(zhǎng)趨勢(shì)（P＜0.05）；而低劑量組小鼠沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著性。說(shuō)明高劑量組、中劑量組的雙孢蘑菇氨基酸溶液抗氧化能力更強(qiáng)，而低劑量組沒(méi)有明顯的抗氧化性。

4 討論

抗氧化能力的提高對(duì)緩解運(yùn)動(dòng)后肌肉酸痛具有重要的作用[7]?？偪寡趸芰κ强寡趸杂苫芰Φ目傮w評(píng)價(jià)，該指標(biāo)反映的是抑制自由基的氧化反應(yīng)的能力。運(yùn)動(dòng)時(shí)產(chǎn)生過(guò)量的羥自由基，是對(duì)機(jī)體損害性較大的一種自由基。而雙孢蘑菇中的氨基酸分子因含有氫離子，可以與羥基自由基結(jié)合而使羥基自由基還原，從而增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力，減少肌肉酸痛現(xiàn)象的產(chǎn)生。

肌肉酸痛產(chǎn)生的機(jī)理可能與肌肉細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂、肌節(jié)結(jié)構(gòu)蛋白的損失和肌纖維損傷等有關(guān)[8]。肌肉酸痛導(dǎo)致骨骼肌纖維結(jié)構(gòu)受損，誘發(fā)肌肉力量下降，炎癥發(fā)生，在生理指標(biāo)上就表現(xiàn)為肌肉特異性蛋白質(zhì)（如CK）的血液水平升高，導(dǎo)致肌肉酸痛。本次試驗(yàn)中建立的小鼠肌肉酸痛模型也發(fā)生了肌細(xì)胞的部分損傷，CK流入血液引起升高。CK升高的作用機(jī)理可能是肌纖維膜通透性增加，或者是肌肉內(nèi)酶合成的增加導(dǎo)致的CK滲出。但由于試驗(yàn)組灌胃了雙孢蘑菇氨基酸，高劑量組、中劑量組血清的CK含量明顯下降。分析其原因是雙孢蘑菇氨基酸對(duì)受損肌細(xì)胞有一定的修復(fù)作用，即氨基酸對(duì)肌細(xì)胞膜的修復(fù)作用，再加上氨基酸本身為細(xì)胞提供了充足的蛋白質(zhì)合成物，促進(jìn)了肌細(xì)胞的合成。從而減少了肌肉酸痛。

本次試驗(yàn)中BUN水平的升高，并非是肌肉細(xì)胞受損所致。而是因?yàn)閿z入蛋白質(zhì)氨基酸過(guò)量而導(dǎo)致的，蛋白質(zhì)氨基酸在運(yùn)動(dòng)時(shí)進(jìn)行過(guò)量的代謝分解，產(chǎn)生了大量的BUN。

T-SOD是一種蛋白酶，其主要作用是催化過(guò)氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)的性質(zhì)，是體內(nèi)天然存在的清除自由基的物質(zhì)。在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的自由基，清除時(shí)需要消耗更多的T-SOD，沒(méi)有外來(lái)營(yíng)養(yǎng)時(shí)，體內(nèi)的T-SOD會(huì)減少。而灌胃了雙孢菇氨基酸增加了SOD的合成速度，更多的SOD可以將自由基分解為無(wú)毒的水，從而阻斷了自由基對(duì)機(jī)體的傷害；同時(shí)，雙孢菇氨基酸也是修復(fù)受損細(xì)胞、促進(jìn)細(xì)胞組織再生的重要物質(zhì)，從提高機(jī)體的抵抗能力和自我修復(fù)能力的方面，讓因運(yùn)動(dòng)而酸痛的肌肉細(xì)胞得到有效修復(fù)，阻斷自由基的傷害。T-SOD水平的高低也表明了身體的抗氧化能力的強(qiáng)弱。試驗(yàn)結(jié)果也顯示，更高劑量的雙孢蘑菇氨基酸溶液能夠顯著地增加T-SOD的活力。

5 結(jié)論

綜上所述，雙孢蘑菇氨基酸由于其強(qiáng)抗氧化性和對(duì)肌細(xì)胞的修復(fù)作用，減少了肌肉細(xì)胞受損機(jī)率；而且能夠修復(fù)受損肌細(xì)胞，從而減少了肌肉酸痛現(xiàn)象的產(chǎn)生。對(duì)運(yùn)動(dòng)性肌肉酸痛有一定的緩解和保護(hù)。