林芝11種大型真菌子實體粗提取物的抑菌作用研究*

劉曉鳳，盧玉君，王孝先，趙偉進，何建清**

（1.西藏農(nóng)牧學(xué)院，西藏 林芝 860000；2.民辦四川天一學(xué)院，四川 德陽 618000）

大型真菌別名蕈菌，一般指可以形成子實體或子囊果的真菌[1]。西藏林芝市位于藏東南雅魯藏布江下游，平均海拔3 100 m[2]，有“西藏的瑞士”之美譽。由于常年空氣稀薄、晝夜溫差較大、氣候宜人、生態(tài)環(huán)境保存較好等原因，該地區(qū)野生動植物資源非常豐富。已有研究人員分別從抑菌活性篩選、物種多樣性、分布環(huán)境、菌絲發(fā)酵條件多方面對大型真菌進行了研究[3-8]。且隨著對大型真菌科考的不斷深入，其作為新型、無污染微生物制劑，在農(nóng)業(yè)上抑制植物病原真菌的應(yīng)用愈加廣泛。但目前關(guān)于西藏大型真菌的抑菌活性研究還很少。通過采用索氏提取法對11種大型真菌子實體進行提取，分別把提取液進行旋轉(zhuǎn)濃縮和冷凍干燥。采取菌絲生長速率法，對植物病原真菌小麥赤霉病菌、馬鈴薯干腐病菌、油菜菌核病菌、小麥根腐病菌、小麥紋枯病菌、番茄早疫病菌進行了抑菌試驗和毒力測定試驗，以期為植物病原真菌的生物防治提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試試劑：95%乙醇（批號：2019061301），成都市科隆公司生產(chǎn)。試驗儀器：RE52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮公司；BXM-30R高壓滅菌鍋，上海博訊公司；SHP-250生化恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設(shè)備公司；ESJ182-4電子分析天平，上海天美公司；超潔凈工作臺，四川匯鴻公司。

11種供試菌種：2018年9月～11月，在西藏林芝地區(qū)采集到樺附毛孔菌 （Trichaptum pargamenum）、龜裂馬勃（Calvatia utriformis）、茶褐擬迷孔菌 （Daedaleopsis tricolor）、白乳菇 （Lactarius piperatus）、黃柄膠地錘（Leotia mareida）、硫磺菌（Laetiporus sulphureus）、粘皮鱗傘 （Pholiota lubrica）、雜色云芝（Coriolus versicolor）、網(wǎng)紋馬勃（Lycoperdon perlatum）、地鱗傘 （Pholiota terrigena）、金黃喇叭（Craterellus aureus） 的子實體的子實體，現(xiàn)保存于西藏農(nóng)牧學(xué)院真菌實驗室。樣品經(jīng)50℃烘箱干燥、萬能粉碎機粉碎后過40目篩，在干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

6種供試病原真菌：小麥紋枯病菌（Rhizoctonia cerealis）、番茄早疫病菌（Alternaria solani）、小麥根腐病菌 （Bipolaris sorokinian）、馬鈴薯干腐病菌（Fusarium coeruleum）、油菜菌核病菌（Sclerotiniasc lerotium)、小麥赤霉病菌（Fusarium gramineaanum），來自西藏農(nóng)牧學(xué)院真菌實驗室。

培養(yǎng)基：馬鈴薯糖瓊脂PDA（批號：BS1823），海博生物科技公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 粗提取物的制備方法研究

1） 濃縮浸膏的制備

將經(jīng)過粉碎后的11種大型真菌子實體粉末各取約5 g，精密稱定置于入索氏提取器[9]。在圓底燒瓶中加入95%乙醇50 mL，回流提取7 h。取提取液旋轉(zhuǎn)濃縮（80℃，-0.08 MPa） 至稠膏狀[10]。稱取前后質(zhì)量，提取率（E1，%）計算公式為：

式中：M1為提取物干重（g）；M2為原料干重（g）。

2）冷凍干燥物的制備

將經(jīng)過粉碎后的11種大型真菌子實體粉末各取約5 g，精密稱定后放入索氏提取器。在圓底燒瓶中加入95%乙醇50 mL，于89℃回流提取7 h。將提取液過濾后冷凍干燥[11]，稱取前后質(zhì)量，提取率計算方法同式（1）。

1.2.2 大型真菌粗提取物抑菌活性初篩

采用菌絲生長速率法[12]，分別對2種不同方法得到的粗提取物進行抑菌活性測定。取各樣品約100 g，精密稱定，用95%乙醇全部溶解后，定容到100 mL（此時相當于每毫升溶液中含有真菌干粉1 g）。無菌條件下，精密移取藥液10 mL置融化的（約45℃） PDA培養(yǎng)基90 mL中混勻[10]，制成含真菌干粉濃度為100 mg·mL-1的培養(yǎng)基。將培養(yǎng)基放置在通風(fēng)櫥中24 h，以揮發(fā)去除95%乙醇溶劑。用直徑6 mm的打孔器打取生長整齊一致病原真菌菌餅，再將病原真菌餅接種到抑菌真菌培養(yǎng)基的中心。1個培養(yǎng)皿1個病原真菌菌餅，每個樣品設(shè)3個重復(fù)。PDA培養(yǎng)基里加入95%乙醇溶液1 mL為對照（CK）。使菌絲面向下接觸培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)3 d～5 d，用十字交叉法測量并記錄菌落直徑，抑菌率（E2，%） 計算公式為：

式中：L1為對照菌落直徑（mm）；L2為各處理菌落直徑（mm）。

1.2.3 大型真菌子實體粗提取物抑菌活性復(fù)篩

對初篩中菌絲生長抑制率＞80%的真菌子實體粗提物進行抑菌活性復(fù)篩，選用冷凍干燥提取物進行研究。將各提取物分別配成濃度為100.00 mg·mL-1、50.00 mg·mL-1、25.00 mg·mL-1、12.50 mg·mL-1、6.25 mg·mL-1樣品溶液，以1.2.2方法計算不同濃度大型真菌子實體粗提取物抑菌率。將抑菌率換算成幾率值，提取液濃度取常用對數(shù)，幾率值當縱坐標，劑量對數(shù)當橫坐標，做出線性回歸方程。依據(jù)相關(guān)方程計算抑菌率50%時對應(yīng)殺菌劑濃度，即EC50[13]。

2 結(jié)果

2.1 11種大型真菌不同方法提取的提取率

2種不同方法得到的11種大型真菌粗提取物的提取率見表1。

表1 11種大型真菌子實體提取率情況Tab.1 Extraction rate of fruiting bodies of 11 kinds of macrofungi

由表1可知，2種方法取率區(qū)別不大，旋轉(zhuǎn)濃縮提取率略高于冷凍干燥提取率，可能由于冷凍干燥實際操作過程中有些不可避免的損失，導(dǎo)致其提取得率略低于旋轉(zhuǎn)濃縮。11種大型真菌中，粘皮鱗傘子實體提取率最高，提取率達9.91%，其次為白乳菇和龜裂馬勃，子實體提取率分別為8.94%和8.15%，最低的是樺附毛孔菌和茶褐擬迷孔菌，其提取率＜4%。

2.2 11種大型真菌抑菌活性初篩

2.2.1 旋轉(zhuǎn)濃縮粗提物對植物病原真菌抑制效果

采用菌絲生長速率法測定了11種大型真菌子實體旋轉(zhuǎn)濃縮的粗提取物對植物病原真菌的抑制效果，見表2。

由表2可知，供試的11種大型真菌中，每種大型真菌子實體粗提取物分別對6種病原真菌的抑制作用呈現(xiàn)較大差異。雜色云芝、粘皮鱗傘、茶褐擬迷孔菌、網(wǎng)紋馬勃、龜裂馬勃、黃炳膠地捶子實體的粗提取物在6種植物病原真菌的抑制效果上表現(xiàn)均不理想；白乳菇子實體粗提取物對小麥赤霉病原菌抑制效果較好，抑制率＞75%，對其余的5種病原真菌抑菌效果不理想；樺附毛孔菌子實體粗提取物對小麥紋枯病原菌抑制效果較好，抑制率＞70%，對另外的5種病原真菌抑菌效果不佳；硫磺菌子實體粗提取物馬鈴薯干腐病原菌抑制率＞70%，對小麥赤霉病原菌抑制效果較好，抑制率＞80%，對另外的4種病原真菌抑菌效果不佳；金黃喇叭子實體粗提取物對番茄早疫病菌、小麥根腐病菌、油菜菌核病菌抑制效果較好，抑制率均＞75%，對其余的3種病原真菌抑制效果均不理想。

表2 11種大型真菌子實體使用旋轉(zhuǎn)濃縮的粗提取物對6種植物病原真菌的抑制情況Tab.2 Inhibition of 11 macrofungi fruiting bodies crude extracts concentrated by rotary evaporation against 6 plant pathogenic fungi

2.2.2 冷凍干燥粗提物對植物病原真菌抑制效果

11種大型真菌子實體冷凍干燥粗提取物對植物病原真菌的抑制效果，見表3。

表3 11種大型真菌子實體使用冷凍干燥粗提取物對6種植物病原真菌的抑制情況Tab.3 Inhibition of 11 macrofungi fruiting bodies freeze-dried crude extracts against 6 plant pathogenic fungi

由表3可知，冷凍干燥的真菌子實體粗提取物對小麥赤霉病菌、油菜菌核病菌、小麥紋枯病菌、番茄早疫病菌、小麥根腐病菌和馬鈴薯干腐病菌的抑制效果和旋轉(zhuǎn)濃縮法相似。雜色云芝、粘皮鱗傘、茶褐擬迷孔菌、網(wǎng)紋馬勃、龜裂馬勃、黃炳膠地捶子實體的粗提取物在6種植物病原真菌的抑制效果上表現(xiàn)均不理想；白乳菇子實體粗提取物對小麥赤霉病原菌抑制效果較好，抑制率達80%以上，對其余的5種病原真菌抑菌效果不佳；樺附毛孔菌子實體粗提取物對小麥紋枯病原菌抑制效果較好，抑制率達80%以上，對其余的5種病原真菌效果不佳；硫磺菌子實體粗提取物對馬鈴薯干腐病原菌、小麥赤霉病原菌抑制效果較好，抑制率均達在80%以上，對另外的4種病原真菌效果不佳；金黃喇叭子實體粗提取物對番茄早疫病菌、小麥根腐病菌、油菜菌核病菌抑制效果較好，抑制率達80%以上，對其余的3種病原真菌效果不理想。

由表2、表3可知，大型真菌子實體的粗提取物使用冷凍干燥法（以下簡稱2法）的抑制效果高于旋轉(zhuǎn)濃縮法（以下簡稱1法）。使用1法的白乳菇子實體粗提取物僅對小麥赤霉病原菌抑制率效果較好，抑制率達78.33%，使用2法的白乳菇子實體粗提取物對小麥赤霉病原菌抑制率達83.43%；使用1法的樺附毛孔菌子實體粗提取物對小麥紋枯病原菌抑制率為70.23%，使用2法的樺附毛孔菌子實體粗提取物的抑制率是80.87%；使用1法的硫磺菌子實體粗提取物對馬鈴薯干腐病原菌和小麥赤霉病原菌抑制率分別是77.64%、80.05%，使用2法的硫磺菌子實體粗提取物對馬鈴薯干腐病原菌以及小麥赤霉病原菌的抑制率分別是82.69%和85.75%；使用1法的金黃喇叭子實體粗提取物對番茄早疫病菌、小麥根腐病菌、油菜菌核病菌抑制率分別是77.17%、78.54%、78.15%；使用2法的金黃喇叭子實體粗提取物對番茄早疫病菌、小麥根腐病菌、油菜菌核病菌抑制率均在80%以上。其原因可能是濃縮法的提取液經(jīng)受熱濃縮后得到，冷凍干燥物是由提取液直接冷凍干燥得到，比濃縮液受熱時間短，有效物質(zhì)被破壞得少所致。

2.3 大型真菌子實體粗提取物抑菌活性復(fù)篩

采用菌絲生長速率法對白乳菇、樺附毛孔菌、硫磺菌、金黃喇叭子實體粗提取物的抑菌效果進行毒力測定，復(fù)篩結(jié)果見表4～表7。

由表4～表7的復(fù)篩結(jié)果可知，在100 mg·mL-1濃度下，白乳菇、樺附毛孔菌、硫磺菌、金黃喇叭這4種大型真菌抑菌活性較穩(wěn)定，與初篩結(jié)果表現(xiàn)一致，抑菌率均在80%以上。這4粗提物對植物病原真菌菌絲生長的作用與其質(zhì)量濃度變化呈正相關(guān)性，其中白乳菇與硫磺菌子實體粗提物對小麥赤霉病菌菌絲生長的抑菌活性較佳，EC50分別為13.63 mg·mL-1和 14.50 mg·mL-1。經(jīng)過初篩和毒力測定實驗，白乳菇、樺附毛孔菌、硫磺菌、金黃喇叭均可利用制成微生物制劑用于植物病原真菌的生物防治。

表4 白乳菇子實體冷凍干燥粗提取物對植物病原真菌的毒力測定Tab.4 Virulence test of freeze-dried crude extract of Lactarius piperatus fruiting body to plant pathogenic fungi

表5 樺附毛孔菌子實體冷凍干燥粗提取物對植物病原真菌的毒力測定Tab.5 Virulence test of freeze-dried crude extract of Trichaptum pargamenum fruiting body to plant pathogenic fungi

表6 硫磺菌子實體冷凍干燥粗提取物對植物病原真菌的毒力測定Tab.6 Virulence test of freeze-dried crude extract of Laetiporus sulphureus fruiting body to plant pathogenic fungi

表7 金黃喇叭子實體冷凍干燥粗提取物對植物病原真菌的毒力測定Tab.7 Virulence test of freeze-dried crude extract of Craterellus aureus fruiting body to plant pathogenic fungi

3 討論

目前，國內(nèi)外學(xué)者對植物源抑菌物質(zhì)的研究越來越重視，經(jīng)研究分離出很多具有抑菌活性的物質(zhì)[14]。從大型真菌子實體里提取出具有抑制植物病原真菌活性的物質(zhì)，并將其制成無污染型微生物制劑前景很廣闊。目前，對硫磺菌、白乳菇、金黃喇叭子實體粗提取物對植物病原真菌的研究較為少見。

研究結(jié)果表明，各子實體提取液中受熱程度可能影響其抑菌效果，使得其提取率與抑制率并不一定成正比。當粗提取物濃度為100 mg·mL-1時，有4種大型真菌子實體粗提取物對植物病原真菌有較好的抑菌效果，分別是樺附毛孔菌子實體粗提取物對小麥紋枯病菌的抑制效果較好，抑菌率達到81.17%；金黃喇叭菌子實體粗提取物對油菜菌核病菌、小麥根腐病菌的抑菌效果良好，尤其在抑制番茄早疫病菌上效果最佳，抑菌率分別是80.11%、80.82%、83.42%；白乳菇子實體粗提取物對小麥赤霉病菌的抑制作用表現(xiàn)上呈現(xiàn)最佳狀態(tài)，抑菌率是85.21%；硫磺菌子實體粗提取物對小麥赤霉病菌和馬鈴薯干腐病菌都抑菌效果良好，尤其在抑制馬鈴薯干腐病菌上效果最佳，抑菌率達85.39%。

綜上所述，對小麥赤霉病菌、馬鈴薯干腐病菌的防治，可以利用白乳菇和硫磺菌子實體粗提取物對其的抑菌活性，將這些生物資源制作無污染型微生物制劑。但其子實體粗提取物中到底是何種成分具有抑菌活性，這是今后探討的重要課題。子實體提取液與冷凍干燥物抑菌能力不一致，其原因可能是提取液中有效成分受熱損失有關(guān)，有待于進一步深入研究。