權(quán)新華,武 鑫,溫 蝶,溫志強(qiáng)**
(1.福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心,福建 福州 350002;2.嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,浙江 嘉興 314016)
灰樹花(Grifola frondosa)又名貝葉多孔菌、栗子蘑、云蕈、蓮花菇、舞茸等,隸屬于擔(dān)子菌亞門(Basidiomycotina) 層菌綱(Hymenomycetes) 非褶菌目(Aphyllophorales) 多孔菌科(Polyporaceae) 樹花菌屬(Grigola),是一種中溫型、好氧、喜光的木質(zhì)腐生菌,在夏、秋季節(jié)常生于櫟樹、板栗樹或其他闊葉樹的樹樁周圍,是一種重要的食藥兼用蕈菌[1],具有巨大的潛在開發(fā)利用價值。
我國灰樹花育種研究較晚,很多菌種都存在適應(yīng)能力差、易染雜菌、生物轉(zhuǎn)化率偏低等問題[2],需要及時育種并篩選出優(yōu)良菌株[3]。雜交是獲得優(yōu)良性狀菌種的一種方法,能使遺傳物質(zhì)在細(xì)胞水平重組,從而將不同類型菌株的優(yōu)良性狀結(jié)合,并可通過菌絲體的無性繁殖穩(wěn)固這種優(yōu)良性狀。
RAPD和ISSR分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食用菌的親緣關(guān)系鑒定[4-7]。鑒此,通過這2種分子標(biāo)記技術(shù),以白色菌株Gr0001+3為雜交核心親本,對與其他5株能正常開片朵型較好的菌株雜交后獲得的13株雜交子進(jìn)行鑒定,進(jìn)一步驗證雜交子分類地位。同時探索適宜雜交子生長的溫度、pH等條件,為雜交子的開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。
1.1.1 菌株
灰樹花(Grifola frondosa) 栽培菌株Gr0001+3與栽培菌株Gr0005、Gr0008、Gr0013、Gr0024、Gr0026單單雜交,觀察篩選出具索狀聯(lián)合性狀的13株雜交子,保藏于福建省食用菌種質(zhì)資源保藏管理中心,菌株編號見表1。
表1 雜交子菌株編號Tab.1 Hybrid strains in the exprement
1.1.2 培養(yǎng)基
PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g·L-1、葡萄糖20 g·L-1、瓊脂 20 g·L-1,pH 自然。
1.2.1 溫度試驗
制作90 mm的PDA平板培養(yǎng)基,每平板培養(yǎng)基定量20 mL。用6 mm打孔器在各雜交母種菌絲相同菌齡位置打孔,菌塊接種于平板中央。接種完成后的平板分別置于15℃、20℃、25℃、30℃、35℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng),每個菌株在不同溫度試驗下設(shè)置3個重復(fù)。用十字交叉畫線法測定菌絲的生長速度。
1.2.2 pH 試驗
用 1 mol·L-1NaOH 和 1 mol·L-1HCl制成不同pH 的 PDA 培養(yǎng)基,pH 分別調(diào)為 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0,每個90 mm平板定量20 mL培養(yǎng)基。用6 mm的打孔器在各雜交母種菌絲相同菌齡位置打孔,菌塊接種于平板中央。每個菌種不同pH做3個重復(fù)。用十字交叉畫線法測定菌絲的生長速度。
1.3.1 菌絲培養(yǎng)及DNA提取
將雜交菌種接種于鋪有玻璃紙的PDA平板上,25℃靜置培養(yǎng)15 d后收集菌絲,采用CTAB法[8]提取全基因組DNA,置于-20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>
1.3.2 引物與 PCR 擴(kuò)增
選取經(jīng)過多次檢驗且具有多拷貝的6條ISSR引物和RAPD引物。引物由上海生工生物工程有限公司合成,引物信息見表2。RAPD-PCR和ISSR-PCR擴(kuò)增體系參照文獻(xiàn)[9]的方法進(jìn)行。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳,電壓110 V,電流50 mA,電泳50 min。后于紫外凝膠成像儀拍照。
表2 RAPD和ISSR引物序列Tab.2 The primer sequence about RAPD and ISSR
1.3.3 數(shù)據(jù)分析與圖表繪制
使用Excel統(tǒng)計分析數(shù)據(jù),取3組重復(fù)數(shù)據(jù)平均值繪制條形統(tǒng)計圖。
不同溫度下雜交子菌絲生長情況見圖1。
由圖1所示,在PDA平板上,雜交子菌絲在15℃~30℃均可生長,生長速度呈先升后降的趨勢,當(dāng)溫度升高到35℃時菌絲不再生長。雜交子最適生長溫度25℃,同一對親本雜交產(chǎn)生的雜交子在不同溫度下生長速度也不同。25℃條件下,Z5-1、Z8-1、Z8-2菌絲生長速度最快。
不同pH下雜交子菌絲生長情況見圖2。
由圖2可知,不同pH條件下雜交子菌絲生長速度不同,菌絲在pH 4~pH 8均可生長,生長速度呈先快后慢的趨勢,其中最適生長pH為5,說明灰樹花菌絲喜弱酸性,當(dāng)pH為5時,雜交子Z5-1、Z5-3、Z8-1、Z8-2、Z26-2菌絲生長優(yōu)于其他雜交子。
RAPD和ISSR兩種分子標(biāo)記擴(kuò)增雜交子與親本條帶電泳圖見圖3。
由圖3所示,RAPD分子標(biāo)記驗證中使用S1518對Gr0001+3與Gr0005雜交產(chǎn)生的雜交子Z5-1擴(kuò)增效果較好,親本菌株與優(yōu)勢雜交子間的特異性條帶較明顯,從圖中可以看出雜交子Z5-1的條帶中同時包含了Gr0001+3和Gr0005的特異性條帶,從而在DNA分子水平上證明了Z5-1是Gr0001+3和Gr0005真正的雜交子。
同理ISSR分子標(biāo)記驗證中,ISSR2、ISSR4、ISSR12、ISSR13、ISSR816也對多個雜交子及親本擴(kuò)增良好,親本菌株與優(yōu)勢雜交子間的特異性條帶較明顯,從圖3中可以看出雜交子同時含有兩親本特異性條帶,證明了雜交子的真實性,也驗證了這幾個ISSR引物鑒定灰樹花雜交子的可行性。
現(xiàn)有的6個引物并不能鑒定所有的雜交子菌株,其余雜交子菌株P(guān)CR電泳圖只含有一個親本菌株的條帶,如雜交子Z13-1。當(dāng)以ISSR4為引物進(jìn)行擴(kuò)增,Z13-1雜交子的電泳條帶與Gr0013親本的相似,不含有Gr0001+3的特異性條帶,無法證明Z13-1是雜交子菌株。
雜交可以使親本的基因重新組合,獲得不同類型的雜交子,為選擇提供豐富的材料。雜交子篩選是從大量雜交子中選出獲得優(yōu)良性狀的雜交子菌株,雜交子在菌絲生長速度、菌絲耐受性等多方面存在一定差異。本研究將雜交獲得的13個雜交子菌株放置于不同溫度、不同pH條件下培養(yǎng),并測定菌絲生長速度,結(jié)果表明13個灰樹花雜交子的菌絲最適生長溫度均為25℃,菌絲最適生長pH為5,不同灰樹花雜交子菌株菌絲生長速度不同,其中Z5-1、Z5-3、Z8-1、Z8-2、Z26-2等菌株生長速度比其他菌株快。
雜交子代的鑒定和篩選是雜交育種中的另一個關(guān)鍵環(huán)節(jié),可以通過觀察鎖狀聯(lián)合、拮抗試驗、同工酶分析、分子標(biāo)記、菌絲長速、出菇試驗等方法進(jìn)行鑒定和篩選[10]。分子標(biāo)記分析待鑒定雜交子與雙親間的DNA特異性條帶,若其同時具有雙親獨有的條帶,則可以斷定其為雜交子,若其與任一親本的條帶完全一致,則不能確定其為雜交子[11-12]。DNA分子標(biāo)記技術(shù)是基于基因水平上的分子鑒定,其具有不受環(huán)境影響且精確度高等優(yōu)點,使鑒定結(jié)果更為可信。試驗中選用RAPD和ISSR分子標(biāo)記,對通過觀察具有索狀聯(lián)合篩選得到的雜交子進(jìn)行驗證,用6個引物對13株灰樹花菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增,其中7株灰樹花雜交子菌株均包含各自雙親的特異性條帶,因此,在DNA分子水平上證明這7株菌株是真正的雜交子,證明了RAPD分子標(biāo)記和ISSR分子標(biāo)記在驗證灰樹花雜交子方面的可行性。由于篩選的引物數(shù)量較少,僅有6個引物能鑒定出雜交子,而且還有6株雜交菌株并未鑒定出,其也有可能是真正的雜交子,需要篩選更多引物進(jìn)一步驗證。