碳氮源對廣葉繡球菌液體發(fā)酵的影響*

馬 璐 ，楊 馳 ，肖冬來 ，江曉凌 ，應(yīng)正河 ，林衍銓 **

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，福建 福州 350014；2.特色食用菌繁育與栽培國家地方聯(lián)合工程研究中心，福建 福州 350014）

廣葉繡球菌（Sparassis latifolia） 又名繡球菌、繡球菇、花瓣茸，隸屬擔(dān)子菌門（Basidiomycota）傘菌綱 （Agaricomycetes） 多孔菌目 （Polyporales） 繡球菌科（Sparassidacea） 繡球菌屬（Sparassis），是一種藥食同源的大型真菌，近年來已成功實現(xiàn)工廠化栽培。繡球菌味道鮮美、營養(yǎng)豐富、富含多種生物活性物質(zhì)，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實，繡球菌中的β-葡聚糖具有抗腫瘤[1]、調(diào)節(jié)免疫[2]等多種功效，可促進鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的傷口愈合[3]，提高環(huán)磷酰胺所致骨髓造血功能受到抑制小鼠的造血功能[4]。因此，繡球菌是一種藥食同源的健康保健食品。

食用菌菌種按形態(tài)特征可分為固體菌種和液體菌種，與傳統(tǒng)的固體菌種相比，液體菌種具有培養(yǎng)菌種菌齡一致、制備周期短、便于機械化接種等諸多優(yōu)勢[5]，已逐漸成為食用菌工廠化栽培菌種制備的發(fā)展方向。據(jù)統(tǒng)計，全國金針菇（Flammulina velu－tipes）產(chǎn)量前十位的企業(yè)均采用液體菌種，杏鮑菇（Pleurotus eryngii）固體菌種正在被逐漸替代，真姬菇（Hypsizygus marmoreus） 液體菌種也處于探索過程[6]，平菇 （Pleurotus ostreatus）、香菇 （Lentinus edodes）、黑木耳 （Auricularia auricula） 等液體菌種生產(chǎn)技術(shù)也在迅猛發(fā)展[5]。

碳源與氮源是繡球菌菌絲生長過程中的重要營養(yǎng)物質(zhì)，為了制備出優(yōu)良的液體菌種，首先要對液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方進行篩選。繡球菌液體培養(yǎng)的適宜碳源有葡萄糖[7]、麥芽糖[8]、可溶性淀粉[9]、玉米淀粉[10]、啤酒酵母、蜂蜜粉[11]等；最適氮源以牛肉浸膏[8]、蛋白胨[7]為主。目前關(guān)于繡球菌液體發(fā)酵的研究較多，但多數(shù)以提高次生代謝產(chǎn)物[8,12]或菌絲體生物量[7,10-11]為最終目的，真正作為液體菌種應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)的研究卻鮮有報道。前期試驗結(jié)果表明，葡萄糖、魚粉蛋白胨可作為繡球菌液體培養(yǎng)的適宜碳源及氮源[13]，由于液體發(fā)酵過程中，當(dāng)培養(yǎng)基碳氮比保持不變時，培養(yǎng)基中碳源與氮源的添加量可有較大變化。因此，液體發(fā)酵培養(yǎng)基應(yīng)同時兼顧二者的比例及實際用量。

本試驗在前期研究結(jié)果基礎(chǔ)上，結(jié)合菌球形態(tài)特征，研究培養(yǎng)基中碳氮源比例及實際用量對繡球菌液體發(fā)酵的影響，以期為繡球菌液體菌種應(yīng)用于工廠化栽培提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

廣葉繡球菌 （S.latifolia）（閩認(rèn)菌 2013005），由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所提供。

1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基（PDPA）：馬鈴薯200 g·L-1、葡萄糖 20 g·L-1、魚粉蛋白胨 2 g·L-1、瓊脂粉16 g·L-1，pH自然。液體種子培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g·L-1、葡萄糖 20 g·L-1、2 g·L-1魚粉蛋白胨，pH自然。碳氮比試驗基礎(chǔ)培養(yǎng)基：KH2PO40.30 g·L-1、MgSO40.15 g·L-1，pH 自然。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種活化

繡球菌接種于PDPA培養(yǎng)皿上，24℃～25℃避光倒置培養(yǎng)20 d。

1.3.2 液體種子培養(yǎng)

從活化菌落邊緣挑取直徑7 mm菌塊接種于液體種子培養(yǎng)基中（250 mL三角瓶，裝液量100 mL），24℃～25℃，150 r·min-1避光培養(yǎng)10 d獲得液體種子。

1.3.3 液體培養(yǎng)條件

采用250 mL三角瓶，裝液量100 mL，滅菌后按8%（體積比）接種量接種液體種子培養(yǎng)基，24℃～25℃，避光，150 r·min-1振蕩培養(yǎng) 15 d。

1.4 試驗設(shè)計

根據(jù)前期試驗結(jié)果[13]，以葡萄糖、魚粉蛋白胨為液體發(fā)酵的碳源、氮源，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入不同配比葡萄糖與魚粉蛋白胨，觀察繡球菌液體發(fā)酵效果，各處理重復(fù)3次，具體方案見表1。

表1 試驗因素及水平Tab.1 Independent variable and their corresponding levels

1.5 檢測數(shù)據(jù)

培養(yǎng)結(jié)束后，采用pH計測定培養(yǎng)基pH。使用移液槍，從發(fā)酵液中隨機吸取一定體積培養(yǎng)基，測定菌球個數(shù)；另將培養(yǎng)基中菌球排列成直線，測其總長度后獲得菌球直徑平均值。后用紗布過濾發(fā)酵液，將過濾后的菌球用清水充分沖洗，40℃烘干至恒重，電子天平稱重測定菌絲生物量（W，%）。

式中：M為烘干的菌絲生物量（g）；m為培養(yǎng)基中碳氮源的質(zhì)量（g）。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用 DPS（data processing system，Version7.05） 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加不同碳源、氮源對繡球菌液體發(fā)酵效果的影響

添加不同碳源、氮源液體發(fā)酵對繡球菌培養(yǎng)基pH、菌球直徑及菌球密度的數(shù)據(jù)統(tǒng)計見圖1。

圖1所示，不同碳氮源組合中，液體發(fā)酵結(jié)束時，培養(yǎng)基終點pH在3.2～4.1之間，當(dāng)保持碳氮源添加比例一定時，隨著二者用量的增大，培養(yǎng)基發(fā)酵終點pH逐漸升高，菌球直徑逐漸減小。當(dāng)碳氮源添加比例為30:1時，菌球密度先升高后降低，最高為14.78個/mL。繡球菌液體培養(yǎng)效果見圖2。

由圖2所示，供試范圍內(nèi)，菌球直徑、菌球密度相差不大。當(dāng)碳氮源添加比例為10:1或50:1時，供試范圍內(nèi)隨著二者添加量增大，菌球密度逐漸增大，最高分別為 11.0個/mL、12.2個/mL，但無顯著性差異。

2.2 不同碳氮源添加量對菌絲體生物量的影響

不同碳源、氮源比例下菌絲生物量見圖3。

由圖3所示，當(dāng)葡萄糖和魚粉蛋白胨添加比例為 10∶1、二者實際用量在 3∶0.3～9∶0.9 之間時，隨著二者添加量的增大，菌絲體生物量逐漸升高，最高（3.56±0.32） g·L-1，達到顯著性差異，隨后菌絲體生物量逐漸減小。葡萄糖和魚粉蛋白胨添加比例為30∶1時也有類似趨勢，菌絲體生物量最高為（2.76±0.25） g·L-1。當(dāng)葡萄糖和魚粉蛋白胨添加比例為50∶1、二者實際用量為分別為12%和0.24%時，菌絲體生物量達到最大值 （2.23± 0.15） g·L-1，此后菌絲體生物量雖有減小，但與最大值無顯著性差異。魚粉蛋白胨添加量對繡球菌液體培養(yǎng)的影響見圖4。

由圖4可知，葡萄糖添加量在3%～9%之間、且葡萄糖添加量一定時，隨著魚粉蛋白胨用量的增大，菌絲體生物量逐漸升高，達到顯著性差異。葡萄糖用量在12%～15%之間，隨著魚粉蛋白胨用量的增大，菌絲體生物量呈增大趨勢，但無顯著性差異。不同碳氮源組合下菌絲體生物量得率見圖5。

由圖5可知，在供試范圍內(nèi)，當(dāng)葡萄糖用量一定時，隨著碳氮比值的降低，菌絲體生物量得率逐漸升高，當(dāng)葡萄糖用量3%，魚粉蛋白胨用量0.3%時，菌絲生物量得率最高為8.6%。隨著葡萄糖用量的增大，菌絲體生物量得率逐漸下降且趨于穩(wěn)定。

3 討論

液體發(fā)酵培養(yǎng)基可提供菌絲生長所需的各種營養(yǎng)物質(zhì)，且適宜的營養(yǎng)比例可促進菌絲生長及次生代謝產(chǎn)物的積累。阿魏菇（Pleurotus ferulae） 液體發(fā)酵培養(yǎng)基碳氮比為20∶1時，菌球直徑、菌球密度與菌絲球個數(shù)均達到最大[14]；桑黃（Phellinus igniarius） 液體發(fā)酵碳氮比為20∶1～25∶1，菌球數(shù)量多且均勻，但對胞外多糖產(chǎn)量影響不明顯[15]，而適宜桑黃多酚、黃酮和甾醇的碳氮比為80∶1[16]。

繡球菌液體發(fā)酵時，當(dāng)葡萄糖濃度較低時（3%～9%），隨著魚粉蛋白胨用量增大，菌絲生物量逐漸升高，且達到顯著性差異，表明在一定范圍內(nèi)可通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基碳氮比來促進菌絲生長；前期研究結(jié)果也已證實，通過增加培養(yǎng)基中魚粉蛋白胨含量來調(diào)節(jié)碳氮比，可促進菌絲生物量的提高[13]；這也表明，培養(yǎng)基適宜的碳氮比可促進菌絲生長。當(dāng)葡萄糖用量繼續(xù)增大時（12%～15%），雖然仍可通過增加培養(yǎng)基中魚粉蛋白胨用量來調(diào)節(jié)至適宜的碳氮比，但菌絲生物量增大趨勢已趨于緩慢，無顯著性差異，且單位營養(yǎng)物質(zhì)下菌絲體生物量得率也呈現(xiàn)類似趨勢。這也進一步說明，在提及培養(yǎng)基的碳氮比時，應(yīng)同時考慮二者的實際使用量。

液體發(fā)酵過程中，為了達到最大菌絲生物量，可適當(dāng)增加營養(yǎng)物質(zhì)含量，但營養(yǎng)物質(zhì)用量過量將導(dǎo)致培養(yǎng)基黏度及滲透壓增大，最終影響菌球形態(tài)特征。試驗結(jié)果中，保持培養(yǎng)基中碳氮源添加比例一定時，按比例增加二者實際使用量，菌球直徑逐漸減小，達到顯著性差異，菌球密度也有增大趨勢，與阿魏菇的液體發(fā)酵過程類似[14]。因此，綜合考慮培養(yǎng)基成本及發(fā)酵效果，適宜繡球菌液體發(fā)酵的葡萄糖用量為3%，魚粉蛋白胨用量0.3%。

液體菌種培養(yǎng)過程中，除碳氮源之外，培養(yǎng)基pH、微量元素及生長因子、消泡劑等均會影響液體發(fā)酵效果，即使采用相同的培養(yǎng)基，發(fā)酵工藝不同時菌球活力也有差異。因此，在后續(xù)研究中，可進一步對上述因素進行探討，為研發(fā)出高活力的繡球菌液體菌種提供參考。