PRiME凈化-UHPLC-MS/MS法測(cè)定雞蛋中金剛烷胺類藥物殘留

李占彬，王正強(qiáng)，黃永橋，楊鴻波

貴州省分析測(cè)試研究院（貴陽(yáng) 550014）

金剛烷胺類藥物具有飽和三環(huán)癸烷的結(jié)構(gòu)，主要有金剛烷胺（Amantadine）、金剛乙胺（Rimantadine）、美金剛（Memantine）等（圖1），具有抗流感病毒、抗帕金森氏綜合征等藥理作用[1-4]。在家禽養(yǎng)殖過(guò)程中，金剛烷胺類藥物被廣泛用于雞禽流感的預(yù)防和早期治療。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大及流感類疾病的頻發(fā)，金剛烷胺類藥物使用劑量正在日益增加，食用這種有金剛烷胺類藥物殘留的禽產(chǎn)品，會(huì)導(dǎo)致人體對(duì)病毒的耐藥性增加[5-7]。農(nóng)業(yè)部在2005年發(fā)布的農(nóng)業(yè)部第560號(hào)公告中明確禁止金剛烷胺類抗病毒藥物生產(chǎn)、銷售及使用，但在實(shí)際養(yǎng)殖過(guò)程中，仍存在非法使用該類藥物，這已成為我國(guó)畜禽產(chǎn)品安全的重要影響因素，因此亟需建立一種快速檢測(cè)該類藥物殘留的檢測(cè)方法。

目前已報(bào)道的金剛烷胺類藥物檢測(cè)的方法主要有高效液相色譜法[8-10]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11-14]、氣相色譜法[15-17]，這些方法測(cè)定的基質(zhì)各異。其中，湯曉艷等[5]建立的雞蛋中金剛烷胺殘留測(cè)定方法中，樣品處理過(guò)程繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、使用大量有試劑，且方法檢出限較大，難以滿足快速分析的需要；林濤等[19]和吳銀良等[18]建立的雞蛋中金剛烷胺類藥物殘留量的測(cè)定方法，樣品前處理使用QuCHERS試劑進(jìn)行凈化，該方法雖然簡(jiǎn)單快速，但其去除干擾物質(zhì)的能力較SPE柱略差，對(duì)結(jié)果的準(zhǔn)確性有一定影響。

此次試驗(yàn)的樣品前處理使用PRiME HLB進(jìn)行凈化，前處理簡(jiǎn)單，并且基質(zhì)干擾較小、靈敏度較高，能得到較為滿意的效果。通過(guò)優(yōu)化UHPLC-MS/MS條件，并對(duì)雞蛋樣品進(jìn)行測(cè)定，建立了同時(shí)測(cè)定3種金剛烷胺類藥物的快速檢驗(yàn)方法，并采用同位素內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析。該方法具有操作簡(jiǎn)單、快速、定性定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，適用于雞蛋中金剛烷胺類藥物的測(cè)定，為金剛烷胺類藥物的檢測(cè)提供更多的技術(shù)選擇。

圖1 3種物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

1.1.1 主要儀器與設(shè)備

Agilent 1290超高效液相色譜儀、Agilent 6470 QQQ三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜，配有ESI源（美國(guó)Agilent公司）；Blixer3攪拌機(jī)（法國(guó)ROBOT COUPA公司）；LT2002電子天平（常熟市天量?jī)x器有限公司）；UMV-2多管渦旋混合器（北京普立泰科儀器有限公司）；離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；Milli-Q超純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）；Supelco 12管固相萃取裝置（美國(guó)Supelco公司）；氮吹儀（上海安普實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；陶瓷均質(zhì)子（迪馬科技有限公司）；Oasis PRiME HLB固相萃取小柱（美國(guó)Waters公司）；0.22 μm PTFE濾膜（上海安普實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）。

1.1.2 主要材料與試劑

金剛烷胺、金剛乙胺、美金剛、金剛烷胺-D6、美金剛-D6（純度＞98%，德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司）；甲醇、乙腈（色譜純，德國(guó)Merck公司）；乙腈（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；甲酸（色譜純，上海安普實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；乙酸銨（分析純、西亞試劑）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別精密稱取10 mg（精確至0.000 1 g）金剛烷胺、金剛乙胺、美金剛、金剛烷胺-D6、美金剛-D6標(biāo)準(zhǔn)品于100.0 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容刻度，混勻，配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18 ℃避光保存。分別從金剛烷胺、金剛乙胺、美金剛標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中移取100.0 μL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容，配制成1 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液；移取100.0 μL混合標(biāo)準(zhǔn)中間液于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容，配制成10 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液；備用。分別從金剛烷胺-D6、美金剛-D6標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中移取100.0 μL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容，配制成1 mg/L的混合內(nèi)標(biāo)中間液；移取500.0 μL混合標(biāo)準(zhǔn)中間液于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容，配制成50 μg/L的混合內(nèi)標(biāo)工作液；備用。

1.3 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus-C18反向色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相A：0.1%甲酸水溶液；流動(dòng)相B：乙腈；流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣體積：2.0 μL；梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 洗脫梯度

1.4 質(zhì)譜條件

離子源，電噴霧離子源（ESI），正離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；毛細(xì)管電壓，4.5 kV；霧化器壓力，40 psi；干燥氣流速，10 L/min；干燥氣溫度，300 ℃；鞘氣流速，10 L/min；鞘氣溫度，300 ℃。其他質(zhì)譜條件見(jiàn)表2。

表2 質(zhì)譜條件

1.5 樣品前處理

稱取5.00 g混勻后的樣品于50 mL具塞離心管中，加入0.10 mL混合內(nèi)標(biāo)工作液，準(zhǔn)確加入20 mL 0.2%甲酸乙腈，加蓋后渦旋振蕩10 min，以4 500 r/min常溫離心10 min，吸取約3 mL上清液過(guò)PRiME HLB固相萃取柱（無(wú)需對(duì)小柱進(jìn)行活化、淋洗等步驟），以1滴/s的速度過(guò)柱，棄去前幾滴流出液，收集剩余續(xù)濾液，準(zhǔn)確量取2.0 mL濾液于另一個(gè)15 mL離心管中，在45 ℃在氮吹至近干，用1 mL初始流動(dòng)相溶解殘?jiān)?，渦旋混勻，過(guò)0.22 μm PTFE濾膜，供UHPLC-MS/MS測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

根據(jù)金剛烷胺類藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，其容易得到H+而形成[M+H]+準(zhǔn)分子離子，故試驗(yàn)選擇正離子模式監(jiān)測(cè)，在正離子模式下一級(jí)全掃描質(zhì)譜，得到相應(yīng)的分子離子峰（[M+H]+）；通過(guò)優(yōu)化錐孔電壓，對(duì)母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，得到子離子特征碎片質(zhì)譜圖；選擇特征碎片中離子中響應(yīng)值高、基線噪聲低的2對(duì)離子對(duì)作為定性、定量離子對(duì)，優(yōu)化子離子對(duì)碰撞能量，使其豐度最大；進(jìn)一步優(yōu)化毛細(xì)管電壓、霧化器壓力、干燥和鞘氣的溫度及壓力等質(zhì)譜參數(shù)，經(jīng)優(yōu)化后得到表2的質(zhì)譜參數(shù)。

2.2 色譜條件的選擇

試驗(yàn)采用反相C18色譜柱對(duì)金剛烷胺類藥物進(jìn)行分離。分別考察了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水含2 mmol/L乙酸銨溶液、甲醇-0.1%甲酸水、甲醇-0.1%甲酸水含2 mmol/L乙酸銨溶液等不同洗脫體系對(duì)目標(biāo)物分離能力。結(jié)果表明，使用乙腈-0.1%甲酸水作為流動(dòng)相時(shí)，目標(biāo)物有良好的色譜分離效果，色譜峰峰型更好，且有較好的響應(yīng)值。金剛乙胺和美金剛屬同分異構(gòu)體，同時(shí)它們的碎片離子完全相同，等度洗脫很難將其進(jìn)行分離，故采用梯度洗脫的方式進(jìn)行分離，通過(guò)優(yōu)化流動(dòng)相流速、組成和比例、柱溫等色譜條件，結(jié)果見(jiàn)圖2，經(jīng)優(yōu)化后得到表1的色譜條件。

圖2 金剛烷胺、金剛乙胺和美金剛標(biāo)準(zhǔn)溶液的TIC色譜圖

2.3 樣品前處理的優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的選擇

雞蛋樣品中富含蛋白質(zhì)和脂肪等物質(zhì)，因此在樣品前處理時(shí)需要考慮沉淀蛋白和去除脂肪。乙腈具有沉淀蛋白的效果，常作為提取劑。試驗(yàn)分別考察了乙腈、80%乙腈、0.2%甲酸乙腈和80%乙腈（含0.2%甲酸）的提取效率。由圖3可知，選取0.1%甲酸乙腈和80%乙腈（含0.2%甲酸）作為提取劑時(shí)，金剛烷胺、金剛乙胺、美金剛的回收率大于90%，略高于乙腈、80%乙腈水的回收率，考慮到沉淀蛋白的效果和氮吹濃縮的時(shí)間，選用80%乙腈（含0.2%甲酸）作為提取溶劑。

圖3 不同提取溶劑的回收率

2.3.2 凈化柱的選擇

試驗(yàn)采用PRiME HLB固相萃取小柱進(jìn)行樣品的凈化?？疾炝嘶旌闲完?yáng)離子交換柱MCX及PRiME HLB固相萃取柱的保留效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用MCX固相萃取柱能減少樣品中雜質(zhì)，且目標(biāo)物損失較少，回收率在90%左右，但是使用MCX小柱凈化操作步驟繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)，且過(guò)程中使用大量有機(jī)試劑，對(duì)人體健康影響較大。采用PRiME HLB，酸化乙腈的提取液直接過(guò)柱，固相萃取小柱無(wú)需活化，目標(biāo)物化合物通過(guò)小柱，樣品中磷脂、脂肪等雜質(zhì)被吸附于萃取柱，這樣既能使干擾物有效去除，又確保待測(cè)組分損失較小，同時(shí)在凈化過(guò)程中省去了溶劑轉(zhuǎn)換的過(guò)程，簡(jiǎn)化了操作步驟，且目標(biāo)物的回收率在90%左右，與MCX固相萃取柱回收率相當(dāng)，故采用PRiME HLB固相萃取小柱進(jìn)行凈化。

2.4 樣品的基質(zhì)效應(yīng)

使用ESI源質(zhì)譜儀分析食品中獸藥殘留時(shí)，基質(zhì)效應(yīng)是時(shí)常遇到的現(xiàn)象，儀器的靈敏度和重現(xiàn)性易受基質(zhì)效應(yīng)的影響，同位素內(nèi)標(biāo)法因其性質(zhì)與目標(biāo)物相似，受基質(zhì)影響程度相同，是液質(zhì)聯(lián)用分析中常采用的降低基質(zhì)效應(yīng)、提高定量準(zhǔn)確性的一種方法[20]。試驗(yàn)選用金剛烷胺-D6和美金剛-D6作為內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行校正，金剛烷胺-D6作為金剛烷胺同位素內(nèi)標(biāo)物，美金剛-D6作為美金剛和金剛乙胺同位素內(nèi)標(biāo)物。由于樣品溶液有已知濃度的同位素內(nèi)標(biāo)物，故減少了樣品基質(zhì)效應(yīng)的影響，確保了方法的靈敏度、重現(xiàn)性和定量分析準(zhǔn)確性。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線與最低檢出限

在試驗(yàn)所確定的色譜和質(zhì)譜條件下，分別配制3種藥物質(zhì)量濃度為0.025，0.05，0.10，0.20，0.50，1.25，2.50和5.00 μg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度為0.50 μg/L）。以待測(cè)物標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品定量離子對(duì)與內(nèi)標(biāo)物離子對(duì)峰面積的比值為縱坐標(biāo)，分別繪制3種金剛烷胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液工作曲線。結(jié)果表明，金剛烷胺類藥物在0.025～5.00 μg/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R2）在0.999 2以上，適用于定量分析。通過(guò)向陰性樣品中添加目標(biāo)物來(lái)考察方法的檢出限（LOD，S/N=3）和定量限（LOQ，S/N=10），結(jié)果見(jiàn)表3。說(shuō)明該方法具有較好的靈敏度。

表3 線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)（R2）、檢出限和定量限

2.6 精密度及加標(biāo)回收試驗(yàn)

采用在空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，選取雞蛋陰性樣品，分別添加0.05，0.1和0.5 μg/kg 3個(gè)不同濃度，每個(gè)添加水平做6個(gè)平行，按照1.5小節(jié)方法進(jìn)行提取凈化，3個(gè)加標(biāo)濃度連續(xù)做3 d，以考察方法的準(zhǔn)確度和精密度，準(zhǔn)確度以相對(duì)偏差表示，精密度以變異系數(shù)（C.V.）表示，計(jì)算加標(biāo)回收率、日內(nèi)變異系數(shù)和日間變異系數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白樣品和加標(biāo)樣品的MRM色譜圖見(jiàn)圖4～圖6，結(jié)果如表4所示。目標(biāo)分析物的準(zhǔn)確度均小于15%，日內(nèi)平均回收率為分別為：金剛烷胺，92.6%～102.0%；金剛乙胺，103.4%～109.5%；美金剛，91.6%～96.6%。日內(nèi)變異系數(shù)分別為：金剛烷胺，4.7%～9.8%；金剛乙胺，2.8%～3.0%；美金剛，1.7%～5.2%。日間平均回收率分別為：金剛烷胺，89.9%～99.1%；金剛乙胺，97.9%～105.5%；美金剛，97.4%～98.8%。日間變異系數(shù)分別為：金剛烷胺，2.7%～3.0%；金剛乙胺，3.4%～5.1%；美金剛，3.1%～6.8%。說(shuō)明該方法具有良好的重復(fù)性與穩(wěn)定性，能夠滿足雞蛋樣品中金剛烷胺類藥物殘留分析檢測(cè)的要求。

表4 加標(biāo)回收率和精密度

圖4 金剛烷胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.25 μg/L）MRM色譜圖

圖5 雞蛋空白樣品MRM色譜圖

圖6 雞蛋空白樣品加標(biāo)（0.5 μg/kg）MRM色譜圖

2.7 方法的應(yīng)用

選取100批次市售的雞蛋樣品，按此次試驗(yàn)建立的方法進(jìn)行測(cè)定。其中，3個(gè)樣品檢測(cè)出金剛烷胺，含量分別為0.925，1.69和28.8 μg/kg，其他兩種藥物均未檢出。

3 討論與結(jié)論

此次試驗(yàn)建立了同時(shí)測(cè)定雞蛋中金剛烷胺、金剛乙胺和美金剛殘留量的同位素稀釋超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的快速檢測(cè)方法。以0.1%甲酸乙腈水溶液作為提取劑，用PRiME HLB固相萃取柱凈化。結(jié)果表明，金剛烷胺類藥物在6 min內(nèi)完成分析，相關(guān)系數(shù)在0.999 2以上，檢出限為0.5 μg/kg，在0.5，1和2 μg/kg 3個(gè)添加水平下的準(zhǔn)確度均小于15%，3種藥物平均回收率在89.9%～109.5%之間，日內(nèi)（n=6）變異系數(shù)在1.7%～9.8%之間，日間（n=3）變異系數(shù)在2.7%～6.8%之間。該方法操作簡(jiǎn)單、回收率高、重現(xiàn)性好，具有良好的準(zhǔn)確度和精密度，能夠準(zhǔn)確定性和定量分析金剛烷胺、金剛乙胺和美金剛，為雞蛋中金剛烷胺、金剛乙胺和美金剛殘留量的檢測(cè)提供技術(shù)支撐，為監(jiān)管部門及食品安全提供更多的理論依據(jù)。