蒜酶HPLC定性檢測方法的建立及應(yīng)用

李心雨 ，羅春霞，敬爽，李新霞

1. 新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院（烏魯木齊 830011）；2. 石河子大學(xué)藥學(xué)院（石河子 832000）；3. 新疆師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院（烏魯木齊 830054）

大蒜（Allium sativumL.）為百合科蔥屬植物蒜的鱗莖，是一種具有悠久歷史的藥食兩用植物[1]。蒜氨酸裂解酶（Alliinase，EC4.4.1.4）簡稱蒜酶，是用來催化大蒜中活性成分蒜氨酸，使其裂解生成大蒜辣素[2-4]。大蒜辣素是公認(rèn)的大蒜活性成分，具有多種藥理活性作用[5-9]。蒜氨酸酶相對分子質(zhì)量為103 kDa[10]，大蒜粉末中蒜酶有兩個(gè)相同的亞基結(jié)構(gòu)，相對分子質(zhì)量為51.5 kDa[11]。一般常采用還原型SDSPAGE凝膠電泳法測定蒜酶相對分子質(zhì)量及蒜酶在大蒜總蛋白中的含量[12]，但是由于蒜酶結(jié)構(gòu)為雙亞基結(jié)構(gòu)[13]，在電泳測定前加入的載樣緩沖液首先使蒜酶中二硫鍵斷裂而最終檢測為蒜酶亞基，不能真實(shí)反映大蒜中的蒜酶分布情況。為了進(jìn)一步確定蒜酶含量和分布，建立蒜酶的HPLC檢測方法，被測蛋白與其他干擾物質(zhì)之間有很好的分離度[13-14]，試驗(yàn)采用高效分子排阻色譜（SEC-HPLC）法檢測蒜酶，根據(jù)凝膠色譜柱的分子篩原理，對蒜酶提取物中的蒜酶二聚體和亞基結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測，進(jìn)一步研究大蒜及大蒜蒜酶提取物中的蒜酶分布和結(jié)構(gòu)特征。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與設(shè)備

LC-20AD-SPD-RID高效液相色譜儀（日本島津）；Exceed-E艾柯超純水機(jī)（成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司）；M1-L213B微波爐（Midea集團(tuán)）；JYL-C020E勻漿機(jī)（九陽股份有限公司）。

1.2 試劑與材料

磷酸氫二鈉（成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)2013100801）；磷酸二氫鉀（天津市福晨化學(xué)試劑廠，批號(hào)20131007）；牛血清蛋白（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)L16M6S2，純度≥98%）；卵清蛋白（美國Sigma-Aldrich公司，批號(hào)SLBM7240V，純度≥98%）。

不同產(chǎn)地大蒜凍干粉（新疆埃樂欣藥業(yè)、山東大蒜、塔城博孜達(dá)克農(nóng)場大蒜、巴里坤農(nóng)豐園大蒜、巴里坤板房溝大蒜）；不同產(chǎn)地鮮蒜（新疆埃樂欣藥業(yè)）；蒜酶提取物（新疆埃樂欣藥業(yè)，批號(hào)201702011，201703013，201703012和201702024）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

蒜酶供試品溶液：精密稱取60 mg蒜酶提取物1置10 mL量瓶中，用純水溶解定容至刻度。

大蒜供試品溶液1：精密稱取約160 mg大蒜凍干粉置10 mL量瓶中，用純水溶解定容至刻度。

大蒜供試品溶液2：精密稱取約640 mg大蒜凍干粉置10 mL量瓶中，用純水溶解定容至刻度。

鮮蒜供試品溶液：取10 g去皮鮮蒜，精密稱定，加35 mL水，勻漿1 min，漿液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，加水定容至刻度，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

牛血清蛋白溶液：稱取20 mg牛血清蛋白溶液，精密稱定，置于10 mL量瓶中，用純水溶解定容，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，備用。

卵清蛋白溶液：稱取20 mg卵清蛋白溶液，精密稱定，置于10 mL量瓶中，用純水溶解定容，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，備用。

2.2 HPLC測定蒜酶方法的建立

Kitamura等[15]采用C8柱測定蒜酶，參考文獻(xiàn)確定蒜酶在325 nm波長下的色譜峰，具有專屬性，所以采用325 nm作為蒜酶提取物液相色譜檢測波長。

精密稱定牛血清蛋白、卵清蛋白、大蒜凍干粉（供試品溶液2）、鮮蒜和蒜酶提取物，按2.1小節(jié)的方法制備供試品溶液。

色譜條件：采用TSK gel G3000SWXL（7.8 mm×300 mm，7 μm）色譜柱；檢測波長325 nm；流動(dòng)相：0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（7.098 g磷酸氫二鈉，6.803 g磷酸二氫鉀，加水至1 000 mL）；流速0.5 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量15 μL。

采用凝膠色譜柱定性測定蒜酶提取物中蒜酶，根據(jù)凝膠色譜柱分子篩原理大相對分子質(zhì)量的物質(zhì)先出峰，即保留時(shí)間越短，相對分子質(zhì)量越大。牛血清蛋白和卵清蛋白的相對分子質(zhì)量分別是66.4和44.5 kDa，在色譜圖中的保留時(shí)間分別是18.850和20.225 min（圖1）。蒜酶單個(gè)亞基相對分子質(zhì)量為51.5 kDa[10]，蒜酶二聚體相對相對分子質(zhì)量為103 kDa。蒜酶提取物和大蒜凍干粉（圖2和圖3）在14和19 min處均有色譜峰出現(xiàn)，出峰時(shí)間較牛血清蛋白提前，可以確定在325 nm檢測波長處，14 min的色譜峰為蒜酶二聚體峰，而另一個(gè)在牛血清蛋白和卵清蛋白保留時(shí)間之間的峰（19 min）可以確定為蒜酶的單個(gè)亞基峰。色譜圖結(jié)果還顯示，蒜酶提取過程，除去了部分大蒜蒜酶中蒜酶亞基結(jié)構(gòu)。

圖1 牛血清蛋白、卵清蛋白液相色譜圖

圖2 大蒜凍干粉中蒜酶HPLC測定液相色譜圖

圖3 蒜酶提取物中蒜酶HPLC測定液相色譜圖

2.3 大蒜凍干粉和蒜酶提取物中蒜酶的檢測

精密稱定不同批次蒜酶提取物和不同產(chǎn)地大蒜凍干粉，4批蒜酶提取物A1～A4，4個(gè)不同產(chǎn)地大蒜凍干粉G1～G4。按照2.1的方法制備蒜酶供試品溶液和大蒜供試品溶液1，按照2.2的色譜條件測定蒜酶提取物和大蒜凍干粉中的蒜酶。

表1 HPLC測定不同批次蒜酶提取物和大蒜提取物中蒜酶

根據(jù)大蒜凍干粉和蒜酶提取物中蒜酶及蒜酶亞基的峰面積測定結(jié)果，對比它們在大蒜凍干粉和蒜酶提取物中的相對含量。結(jié)果如表1和圖4所示，蒜酶提取物中蒜酶二聚體含量較高，且有些批次的蒜酶提取物不含蒜酶亞基，僅有蒜酶二聚體；大蒜凍干粉中蒜酶二聚體的含量較低，不同產(chǎn)地的大蒜凍干粉均含有蒜酶二聚體和蒜酶亞基。所以大蒜凍干過程中保留了蒜酶二聚體和亞基結(jié)構(gòu)，而經(jīng)過提取純化的蒜酶提取物中二聚體得以富集，亞基比例降低。

圖4 大蒜凍干粉和蒜酶提取物中蒜酶二聚體和亞基峰面積柱狀圖

2.4 不同產(chǎn)地大蒜凍干粉中蒜酶相對含量比較

精密稱定不同產(chǎn)地大蒜凍干粉，按照2.1的方法制備大蒜供試品溶液，采用2.2的色譜條件測定17個(gè)不同產(chǎn)地大蒜凍干粉。結(jié)果列入表2。

不同產(chǎn)地大蒜凍干粉的蒜酶HPLC檢測結(jié)果顯示，來源于17個(gè)產(chǎn)地大蒜凍干粉中蒜酶二聚體有較大差異，蒜酶二聚體峰面積均高于蒜酶亞基峰面積，兩者峰面積比值為2.75±0.79（均值±SD，n=17）。采用SPSS分析軟件對17個(gè)產(chǎn)地大蒜凍干粉中蒜酶二聚體和蒜酶亞基峰面積進(jìn)行配對樣本t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析。相關(guān)分析結(jié)果顯示，蒜酶二聚體峰面積與蒜酶亞基峰面積的相關(guān)系數(shù)r=0.624，p值（Sig）=0.007＜0.05，表明兩者存在相關(guān)關(guān)系。同時(shí)按照建立的方法，對不同產(chǎn)地大蒜凍干粉中的蒜氨酸進(jìn)行測定，對蒜酶與蒜氨酸含量進(jìn)行相關(guān)關(guān)系分析，結(jié)果顯示蒜酶含量高低與蒜氨酸含量之間不存在相關(guān)關(guān)系。

2.5 滅酶處理方法對蒜酶二聚體和亞基含量的影響

按照2.1的方法制備鮮蒜供試品溶液和滅酶鮮蒜供試品溶液，采用2.2的色譜條件對不同產(chǎn)地鮮蒜進(jìn)行檢測。

圖6顯示，鮮蒜經(jīng)勻漿處理，有14 min處的蒜酶二聚體和19 min處蒜酶亞基色譜峰，而同一鮮蒜經(jīng)微波滅酶處理，檢測不到蒜酶的色譜峰，供試品溶液中蒜酶二聚體和蒜酶亞基色譜峰均消失。鮮蒜經(jīng)滅酶處理，蒜酶因變性而聚集沉淀，溶解度下降，在樣品前處理的過程中滅酶供試品溶液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，樣品溶液中蒜酶因沉淀而無法透過濾膜，所以HPLC方法檢測不到滅酶鮮蒜供試品的蒜酶色譜峰。

表2 不同產(chǎn)地大蒜凍干粉中蒜酶峰面積和蒜氨酸含量

圖5 不同產(chǎn)地大蒜凍干粉柱狀圖

圖6 鮮蒜滅酶和不滅酶處理液相色譜圖

表3 不同產(chǎn)地鮮蒜中蒜酶二聚體和蒜酶亞基峰面積

圖7 不同產(chǎn)地鮮蒜的蒜酶二聚體及蒜酶亞基峰面積柱狀圖

3 討論與結(jié)論

試驗(yàn)采用HPLC法分別測定蒜酶提取物、大蒜凍干粉和鮮蒜中蒜酶，在大蒜樣品中分別檢測到蒜酶和蒜酶亞基存在，而經(jīng)過提取純化的蒜酶提取物中蒜酶亞基含量減少。研究建立的方法與SDS-PAGE法比較，不用破壞蒜酶結(jié)構(gòu)，并且可以分別檢測到蒜酶和蒜酶亞基的色譜峰。據(jù)文獻(xiàn)[16]報(bào)道，蒜酶分子作為二聚體，具有生物活性，是由于它的活性位點(diǎn)由兩個(gè)亞基的殘基構(gòu)建，需組成二聚體才具有活性。所以蒜酶活力是由蒜酶二聚體結(jié)構(gòu)決定的，試驗(yàn)通過采用HPLC法檢測蒜酶中二聚體結(jié)構(gòu)，為后續(xù)提取純化蒜酶具有指導(dǎo)意義，為進(jìn)一步探索蒜酶催化蒜氨酸產(chǎn)生大蒜辣素的機(jī)制奠定研究基礎(chǔ)。

根據(jù)表3和圖7可知，不同產(chǎn)地鮮蒜中均含有蒜酶二聚體和蒜酶亞基，兩者峰面積比值為3.01±0.84（均值±SD，n=7）。表3顯示大蒜凍干粉中蒜酶二聚體與蒜酶亞基峰面積的比值為2.75±0.79（均值±SD，n=17），與鮮蒜中比值一致。所以鮮蒜經(jīng)冷凍干燥處理，不影響鮮蒜中蒜酶二聚體及亞基結(jié)構(gòu)，而微波處理后蒜酶變性，使其溶解度下降而未能檢出。

對不同產(chǎn)地的鮮蒜中的蒜酶二聚體和蒜酶亞基峰面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)相關(guān)分析，結(jié)果顯示，相關(guān)系數(shù)r=0.852，p值（Sig）=0.015＜0.05，表明蒜酶二聚體峰面積與蒜酶亞基峰面積存在相關(guān)關(guān)系。對不同產(chǎn)地鮮蒜中蒜酶峰面積與蒜氨酸含量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示蒜酶峰面積與蒜氨酸含量之間不具有相關(guān)關(guān)系。這一結(jié)果與大蒜凍干粉一致。