蒸制溫度、時(shí)間對(duì)滇黃精皂苷元及5-HMF含量的影響

劉品華，劉明研，董建偉，楊芬*

1. 曲靖師范學(xué)院化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院（曲靖 655011）；2. 廣西百色農(nóng)業(yè)學(xué)校（百色 533000）

滇黃精（Polygonatum kingianumColl. et Hemsl）為百合科（Liliaceae）黃精屬（PolygonatumMill.）植物，是2015版《中華人民共和國(guó)藥典》中收載的中藥黃精3個(gè)基源品種之一[1]。黃精自古藥食兼用，2002年原國(guó)家衛(wèi)生部（衛(wèi)法監(jiān)發(fā)[2002]51號(hào)）公布為食藥兩用，中國(guó)2 000多年的臨床實(shí)踐表明其保健和疾病治療功效。

薯蕷皂苷歸屬于甾體皂苷類。甾體皂苷具有降低血糖血脂、防治心腦血管等多種疾病[2]。黃精中的皂苷，以薯蕷皂苷為主[3]，是黃精的特征性和主要活性成分之一[4]。滇黃精總皂苷能有效調(diào)和緩解2型糖尿病[5-6]，有明顯的降血糖的功效[7]。

5-羥甲基糠醛（5-HMF）是淡黃褐色固體，有不愉快的氣味，有較高的化學(xué)反應(yīng)活性，其安全風(fēng)險(xiǎn)和保健功效存在爭(zhēng)議。吳毅等[8]、孫瑩等[9]報(bào)道，在疾病治療方面有功效，王歌等[10]、譚俊杰等[11]、吳榕等[12]報(bào)道，認(rèn)為存在風(fēng)險(xiǎn)。5-HMF被認(rèn)為是食品加工內(nèi)源生成的有害成分。

生品黃精需炮制后入藥或食用，而炮制的重要環(huán)節(jié)就是蒸制。黃精炮制方法與皂苷含量關(guān)系研究有報(bào)道，但因炮制方法不同，影響因素較多，加之原料、檢測(cè)方法的影響導(dǎo)致結(jié)果差異較大。5-HMF在黃精的加熱、存儲(chǔ)或發(fā)酵過程都會(huì)產(chǎn)生。因此，試驗(yàn)探究檢測(cè)總皂苷元的方法，以及蒸制溫度、時(shí)間對(duì)滇黃精總皂苷元和5-HMF的影響，為黃精炮制和深加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

滇黃精（云南曲靖市煜欣農(nóng)林生物科技有限公司藥材種植基地）；薯蕷皂苷元（國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；5-羥甲基糠醛（98%，上海思域化工科技有限公司）；香草醛（AR，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；Methyl Alcohol HPLC/Spectro（美國(guó)Tedia天地色譜試劑）；超純水（經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾）；香草醛等試劑（均為分析純）。

1260型高壓液相色譜儀（Agilent Technologies Made in Germany）；TU-1810紫外分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；AL204-IC電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；MS105DU電子天平（Mettler-Toledo GmbH ImLangacher 448606 Greifensee Switzerland）；QL-866漩渦混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；LD-4臺(tái)式離心機(jī)（常州天瑞儀器有限公司）；PS-40超聲波儀（深圳市超藝達(dá)科技有限公司）；HH501超級(jí)恒溫水?。ǔＶ輫?guó)華電器有限公司）；TDL-400離心機(jī)（金壇區(qū)白塔新寶儀器廠）；LC-ZFG002蒸飯柜（廣東樂創(chuàng)電器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蒸制與干燥

1.2.1.1 蒸制時(shí)間相同溫度不同制樣方法

鮮滇黃精洗凈后，切片，裝入蒸煮袋中，每袋約500 g，共裝4袋。捆扎袋口，放入蒸飯柜中，分別采用70，80，90和100 ℃進(jìn)行蒸制，蒸制時(shí)間為48 h。取出裝入不銹鋼網(wǎng)框中，放入鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)，于70℃干燥11 h，取出冷卻，用粉碎機(jī)粉碎后過0.250 mm篩，再放入不銹鋼盤中，烘3 h，得不同溫度蒸制48 h的待檢測(cè)樣，分別裝袋，放入干燥器備用。

1.2.1.2 蒸制溫度相同時(shí)間不同制樣方法

鮮滇黃精洗凈，切片，約2 kg，放入蒸煮袋中，捆扎袋口。放入蒸飯柜中，于90 ℃進(jìn)行蒸制。蒸制到24，48，72和96 h時(shí)分別取出約500 g，裝入不銹鋼網(wǎng)框中，在鼓風(fēng)干燥箱中，于70 ℃干燥11 h，冷卻后用粉碎機(jī)粉碎過60目篩，再放入不銹鋼盤中，烘3 h，得90 ℃蒸制不同時(shí)間的待檢測(cè)樣，分別裝袋放入干燥器備用。

1.2.1.3 自然干燥樣品制樣方法

鮮滇黃精洗凈，切片，陽(yáng)光下自然曬干，粉碎后過60目篩，放入鼓風(fēng)干燥箱70 ℃干燥至恒重，得自然干燥的對(duì)照待檢測(cè)樣，裝袋放入干燥器備用。

1.2.2 總皂苷的檢測(cè)

參考楊圣賢等[13]、苑璐等[14]、尤新軍等[15]的研究，對(duì)制備檢測(cè)液方法進(jìn)行修改。同一待檢測(cè)樣平行制備檢測(cè)液3份。每份檢測(cè)液再平行顯色檢測(cè)3次。

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品薯蕷皂苷元溶液的制備

準(zhǔn)確稱取25 mg薯蕷皂苷元標(biāo)準(zhǔn)品到25 mL容量瓶中，加約10 mL二氯甲烷溶解，再繼續(xù)添加到刻度，搖勻，得1.00 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。置于冰箱冷藏備用（48 h內(nèi)使用）。

1.2.2.2 檢測(cè)液的制備

稱取1～2 g（準(zhǔn)確至0.000 1 g，由預(yù)試驗(yàn)確定稱取量，控制檢測(cè)結(jié)果在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)）待檢測(cè)樣，放入50 mL離心管中。離心管中加入20 mL 80%乙醇，旋渦振蕩1 min，放入240 W超聲儀中60 ℃水浴超聲30 min，取出在4 000 r/min下離心15 min，清液倒入50 mL比色管中。剩余固體再加入15 mL 80%乙醇同法超聲提取，離心后清液合并，同法再提取1次，離心清液合并。將比色管放入80 ℃水浴氮吹至干，加入10.00 mL 2 mol/L硫酸，放入沸水浴中水解60 min，取出冷水浴冷卻后用30%的氫氧化鈉溶液調(diào)整pH至6～8。轉(zhuǎn)入分液漏斗，分別用15，10和10 mL二氯甲烷萃取3次，每次萃取靜置的時(shí)間為2～2.5 h。萃取后的二氯甲烷合并到50 mL比色管中，用60 ℃水浴氮吹至干，加入10 mL沸點(diǎn)為60～90 ℃石油醚，于240 W超聲儀中冷水浴超聲1 min，取出靜置至澄清后把石油醚轉(zhuǎn)入25 mL容量瓶。比色管中的殘留物再用15 mL石油醚分2次同法萃取，同法轉(zhuǎn)入容量瓶。用石油醚定容后靜置過夜，得待檢測(cè)液。同一待檢測(cè)樣，制備3份檢測(cè)液。

1.2.2.3 顯色方法

取一定量待檢測(cè)液到20 mL具塞試管中，于70 ℃水浴氮吹至干。加入0.20 mL 5%香草醛冰乙酸溶液，搖動(dòng)溶解固體后，再各加入0.80 mL高氯酸，搖勻。加蓋后放入60 ℃超級(jí)恒溫水浴中保溫20 min，取出用冷水浴冷卻至常溫。加入5.00 mL冰乙酸，搖勻，完成顯色（30 min內(nèi)檢測(cè)）。得待用紫外分光光度儀檢測(cè)液。

1.2.2.4 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

取0.10 mL標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液、2 mL自然干燥樣的待檢測(cè)液分別到20 mL具塞試管中，按1.2.2.3的顯色方法制得待用紫外分光光度儀檢測(cè)液。設(shè)置紫外分光光度儀檢測(cè)范圍為450～650 nm，以純水掃基線，用1 cm石英比色皿進(jìn)行掃描。標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液、自然干燥樣的待檢測(cè)液在540 nm處均有最大吸收，為此確定檢測(cè)波長(zhǎng)為540 nm。

1.2.2.5 制定標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別在6支20 mL具塞試管中移入0，0.10，0.20，0.30，0.40和0.50 mL標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，放熱60 ℃水浴氮吹至干。各試管中分別加入0.20 mL 5%香草醛冰乙酸溶液，按1.2.2.3的顯色方法制得待用紫外分光光度儀檢測(cè)液。以試劑為空白對(duì)照，用1 cm石英比色皿，在540 nm處檢測(cè)吸光度。以質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)作圖，得回歸方程：Y=3.100 0X+0.143 0，R2=0.999。

1.2.2.6 水解時(shí)間的考察

精密稱取1 g自然干燥待檢測(cè)樣，同1.2.2.2檢測(cè)液的制備方法操作，修改水解時(shí)間0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 h。取2.00 mL石油醚定容液到20 mL具塞試管中，按1.2.2.3的顯色方法制得待用紫外分光光度儀檢測(cè)液。以試劑為空白對(duì)照，用1 cm石英比色皿，在540 nm處檢測(cè)吸光度。由標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算皂苷元的含量。同法平行試驗(yàn)2次。

1.2.2.7 總皂苷元的檢測(cè)

取2.00 mL待檢測(cè)液到20 mL具塞試管中，按1.2.2.3的顯色方法制得待用紫外分光光度儀檢測(cè)液。以試劑為空白對(duì)照，用1 cm石英比色皿，在540 nm處檢測(cè)吸光度。由標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算皂苷元的含量。同一待檢測(cè)液，同法平行顯色檢測(cè)3次。檢測(cè)樣中總皂苷元含量按式（1）計(jì)算。

1.2.2.8 回收率考察

在0.9～1.2 g范圍稱取自然干燥的待檢測(cè)樣（精確至0.000 1 g）至50 mL離心管中。加入2.50 mL 1.00 mg/mL薯蕷皂苷元標(biāo)準(zhǔn)品作為標(biāo)樣。按1.2.2.2檢測(cè)液的制備方法操作。取1.00 mL待檢測(cè)液到20 mL具塞試管中，按1.2.2.3的顯色方法制得待用紫外分光光度儀檢測(cè)液。以試劑為空白對(duì)照，用1 cm石英比色皿，在540 nm處檢測(cè)吸光度。由標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算皂苷元含量。同法平行試驗(yàn)3次。

式中：X為加標(biāo)樣后檢測(cè)的薯蕷皂元質(zhì)量，mg；Y為稱取自然干燥的待檢測(cè)樣質(zhì)量，g；Z為自然干燥的待檢測(cè)樣檢測(cè)得到的薯蕷皂苷元含量，%。

1.2.2.9 精密度

精密度數(shù)據(jù)按照GB/T 6379的規(guī)定確定，其重復(fù)性和再現(xiàn)性的值是以95%可信度計(jì)算。皂苷元的檢測(cè)，依據(jù)GB/T 6379.6標(biāo)準(zhǔn)中“限的確定”，在重復(fù)性條件下所得測(cè)試結(jié)果可接受性的檢測(cè)方法，對(duì)重復(fù)性限（r），正態(tài)分布，95%的概率水平下，臨界極差CR0.95(3)=r=3.3×S（S為標(biāo)準(zhǔn)差），如果重復(fù)3次檢測(cè)結(jié)果的極差（Xmax-Xmin）小于r值，表示測(cè)定結(jié)果是可以接受的，結(jié)果取3次的平均值為最終結(jié)果。

1.2.3 5-羥甲基糠醛的檢測(cè)

參照GB/T 18932.18—2003，對(duì)試樣制備方法適當(dāng)修改。

1.2.3.1 液相色譜條件

色譜柱，Agilent Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相，甲醇+水（10+90）；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)285 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

1.2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液

精密稱取10 mg標(biāo)準(zhǔn)5-羥甲基糠醛，放入50 mL容量瓶，加入5 mL色譜純甲醇，溶解后用超純水定容，配成0.20 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.3.3 繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

進(jìn)樣體積折算為質(zhì)量0.02，0.10，0.20，0.40，1.00，1.50和2.00 μg，停留時(shí)間9 min，回歸方程為Y=7 795.997 3X+25.456 3，R2=1（Y為峰面積；X為5-羥甲基糠醛質(zhì)量，μg）。

1.2.3.4 試樣的制備

在0.1～0.2 g范圍稱取試樣（精確至0.000 1 g），置于100 mL容量瓶中，加入約50 mL 10%甲醇，放入240 W超聲儀中常溫水浴超聲20 min，用10%甲醇定容至刻度，混勻。用0.45 μm的微孔濾膜過濾，濾液用于液相色譜儀紫外檢測(cè)器測(cè)定。

1.2.3.5 平行試驗(yàn)

對(duì)同一試樣進(jìn)行平行試驗(yàn)測(cè)定。

1.2.3.6 空白試驗(yàn)

對(duì)10%甲醇溶液進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果按式（3）計(jì)算。

式中：X為測(cè)定原料中5-羥甲基糠醛含量，mg/kg；m為標(biāo)準(zhǔn)工作曲線得到質(zhì)量，μg；M為測(cè)定稱取原料的質(zhì)量，g；20為進(jìn)樣體積，μL；100為定容體積，mL；1 000為換算系數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel軟件進(jìn)行t-檢驗(yàn)（雙樣本異方差假設(shè)分析）。以自然干燥樣品的試驗(yàn)結(jié)果作為對(duì)照，考察不同蒸制條件下的差異性。

2 結(jié)果與討論

2.1 皂苷

甾體皂苷是由甾體皂苷元與糖、糖醛酸或其它有機(jī)酸縮合而成。共存于植物中的酶，能酶解皂苷。黃精的甾體皂苷元以C1或C12位氧化為特征[16]，糖基部分是形成黃精屬植物甾體皂苷分子多樣性的重要因素[17]。目前確定的滇黃精中甾體皂苷類化合物有32個(gè)[18]，三萜皂苷類化合物有3個(gè)[19-21]。通過品嘗所提取的皂苷，發(fā)現(xiàn)會(huì)麻口，說明黃精中皂苷是麻口刺喉的成分之一。

薯蕷皂苷元用香草醛、高氯酸顯色30 min內(nèi)檢測(cè)穩(wěn)定[14]。蒸制導(dǎo)致成分發(fā)生變化后，呈色成分會(huì)嚴(yán)重影響檢測(cè)的結(jié)果，試驗(yàn)改進(jìn)的方法得到的檢測(cè)液無色透明，確保檢測(cè)結(jié)果的可靠性。新鮮的滇黃精直接進(jìn)行蒸制，可準(zhǔn)確考察蒸制條件的影響。

圖1 水解時(shí)間考察結(jié)果

皂苷由于所鏈糖的不同，用液相色譜儀很難通過標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定量檢測(cè)。因此，通過水解轉(zhuǎn)化為較為單一的皂苷元，用分光光度比色法檢測(cè)是合理的選擇。由圖1可知，水解1 h后皂苷元含量基本穩(wěn)定，水解完成，所以確定水解時(shí)間為1 h。

由表1可知，3份樣中每份樣顯色3次檢測(cè)的極差均小于臨界極差（r），3份的極差也小于臨界極差（r），說明檢測(cè)結(jié)果是可以接受的。從RSD值也可看出該方法有較好的精密度和良好的重復(fù)性。3份樣品檢測(cè)平均回收率為97.145%，達(dá)到檢測(cè)正確度要求。

表1 皂苷元回收率考察結(jié)果（n=3）

由表2可知，所有檢測(cè)的極差均小于臨界極差（r），RSD值也表明精密度較好，平均值的結(jié)果可以接受。與自然干燥相比，70 ℃和80 ℃蒸制均導(dǎo)致皂苷元含量下降，且差異極顯著（p＜0.01）。70 ℃和80 ℃蒸制皂苷元含量均表現(xiàn)出差異極顯著（p＜0.01）。與自然干燥的相比，90 ℃和100 ℃蒸制皂苷元含量沒有差異性（p＞0.05）。原因可能是滇黃精中自身所含的酶，在適當(dāng)溫度的影響下酶活性提高，導(dǎo)致皂苷的轉(zhuǎn)化，從而降低皂苷含量。90 ℃以上溫度導(dǎo)致酶失活，從而減少皂苷轉(zhuǎn)化。皂苷含量的變化與檢測(cè)皂苷元含量的變化一致。有研究報(bào)道，薯蕷皂苷在炮制過程會(huì)轉(zhuǎn)化為延齡草苷和薯蕷皂苷元[22]，蒸制導(dǎo)致其他成分變化[23]，也可能與酶的作用有關(guān)，蒸制滇黃精導(dǎo)致皂苷轉(zhuǎn)化的成分有待進(jìn)一步研究。

表2 不同溫度蒸制48 h皂苷元含量檢測(cè)結(jié)果（n=3）

由表3可知，所有檢測(cè)的極差均小于臨界極差（r），RSD值也表明精密度較好，平均值結(jié)果可以接受。隨著蒸制時(shí)間延長(zhǎng)，總皂苷元含量逐漸降低。與自然干燥的皂苷元含量相比較，蒸制72 h以內(nèi)的下降差異不顯著（p＞0.05），達(dá)到96 h皂苷元含量減少差異極顯著（p＜0.01）。變化規(guī)律與吳英詳[24]、劉玲等[25]、鐘凌云等[26]研究發(fā)現(xiàn)的黃精多次蒸制和炮制后導(dǎo)致總皂苷和皂苷元含量有所降低的結(jié)果一致。焦劼等[27]研究報(bào)道，云南蒙自、保山的滇黃精中薯蕷皂苷元含量分別2.845和2.355 mg/g，與試驗(yàn)檢測(cè)的皂苷元含量結(jié)果相近。

2.2 5-HMF

5-HMF是否對(duì)人體造成傷害，取決于不同的暴露途徑、暴露劑量和頻率[28]。適量攝入蛋白質(zhì)可以消除HMF的危害[29]。

由表4可知，與未蒸制的5-HMF含量相比較，70℃以上蒸制的5-HMF含量增加極顯著（p＜0.01），隨著蒸制溫度升高，5-HMF含量快速增加。從蒸制溫度間差值可以看出，80 ℃以上蒸制5-HMF含量急劇增加。

由表5可知，與未蒸制的5-HMF含量相比較，90℃蒸制24 h增加顯著（p＜0.05），蒸制48 h后增加極顯著（p＜0.01）。從蒸制時(shí)間的差值可以看出，48 h后5-HMF含量急劇增加，72 h后5-HMF增加速度有所降低。與楊云等[30]研究清蒸30 h內(nèi)5-HMF含量基本穩(wěn)定，30 h以后含量急劇上升的情況一致。5-HMF的化學(xué)活性較高，與空氣接觸、受陽(yáng)光照射均利于進(jìn)一步反應(yīng)生產(chǎn)黑精色素。

表3 90 ℃蒸制不同時(shí)間皂苷元含量檢測(cè)結(jié)果（n=3）

表4 不同溫度蒸制48 h 5-HMF的檢測(cè)結(jié)果（n=3）

3 結(jié)論

滇黃精中的皂苷是有效生理活性的主要成分之一，是炮制黃精后希望保留的成分，蒸制導(dǎo)致皂苷轉(zhuǎn)化的成分有待深入研究。5-HMF在治療疾病方面有作用，但同時(shí)也存在安全性風(fēng)險(xiǎn)，其含量是平衡功效與風(fēng)險(xiǎn)的因素。炮制黃精時(shí)，建議讓待蒸黃精溫度快速達(dá)到90 ℃以上，蒸制時(shí)間不應(yīng)超過48 h，并以24 h以內(nèi)最佳。由試驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，40～90 ℃烘干的黃精也會(huì)造成皂苷含量下降，應(yīng)給予重視。