酶法制備雞血抗氧化肽及其抗氧化活性

寧芯 ，黎梓玉，班薇薇，黃小惠，莫紫梅，汪磊 *

1. 廣西農(nóng)產(chǎn)資源化學(xué)與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（玉林 537000）；2. 廣西高校桂東南特色農(nóng)產(chǎn)資源高效利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（玉林 537000）；3. 玉林師范學(xué)院化學(xué)與食品科學(xué)學(xué)院（玉林 537000）；4. 廣西-東盟食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心（南寧 530001）

自由基是需氧生物在正常生理過(guò)程中產(chǎn)生的一類(lèi)性質(zhì)活潑的化學(xué)物質(zhì)，這類(lèi)物質(zhì)在生物機(jī)體內(nèi)扮演重要作用，包括信號(hào)傳遞、預(yù)防感染和排除毒素等[1]。自由基在正常生物機(jī)體內(nèi)處于動(dòng)態(tài)平衡，若失衡，長(zhǎng)期過(guò)量的自由基通過(guò)與脂類(lèi)、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子作用，易引發(fā)癌癥、心腦血管疾病、關(guān)節(jié)炎癥、老年性視力障礙等疾病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，自由基侵害約占影響人體健康因素的85%[2-3]。

適量攝入具有抗氧化活性的物質(zhì)能有效降低機(jī)體的自由基水平，防止脂類(lèi)物質(zhì)過(guò)氧化，提高機(jī)體免疫力[4]。各類(lèi)抗氧化物質(zhì)中，從某些動(dòng)植物組織中提取的天然抗氧化劑具有抗氧化能力強(qiáng)、穩(wěn)定性強(qiáng)和安全性高等特點(diǎn)，深受消費(fèi)者青睞，但其含量普遍較低[5-6]，實(shí)際意義不大。科研人員在近期研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)：可控酶法水解蛋白質(zhì)制備具有抗氧化活性的多肽具有反應(yīng)溫和、可控性好和安全性高等優(yōu)點(diǎn)，是當(dāng)前生產(chǎn)天然抗氧化劑的主要方法[7]。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)肉雞年出欄量高達(dá)40億只，肉雞含血量在80～100 g/只，粗略估計(jì)，雞血年產(chǎn)量約36萬(wàn) t，數(shù)量相當(dāng)可觀(guān)[8]。研究表明：雞血干物質(zhì)含量約17.9%，其中91.8%為優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)[9]，是一種具有良好開(kāi)發(fā)潛力的蛋白質(zhì)資源。豬血[10]、牛血[11]、鵝血[12]和鴨血[13]等畜禽動(dòng)物血液均可作為廉價(jià)蛋白質(zhì)來(lái)源制備抗氧化肽，而當(dāng)前我國(guó)雞血主要經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單加工后作為飼料添加物使用，附加值極低?；诖耍w亮等[14]、鄭召君等[15]和曾利平等[16]嘗試以雞血血球?yàn)樵现苽淇寡趸?，但制備過(guò)程中產(chǎn)生大量的雞血血漿（以體積計(jì)，血漿約占血液的55%），降低了雞血蛋白的利用率，影響雞血的高值化利用。此次試驗(yàn)以新鮮雞血為原料，通過(guò)滲透吸水破壞雞血血球細(xì)胞結(jié)構(gòu)，在此基礎(chǔ)上采用酶法水解制備雞血抗氧化肽，研究各單因素（pH、加酶量、酶解溫度和酶解時(shí)間）對(duì)雞血酶解產(chǎn)物還原能力的影響，并采用響應(yīng)面法優(yōu)化雞血酶解條件，旨在為雞血高值化利用提供有益途徑和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

新鮮雞血（取自白羽肉雞，市售）；堿性蛋白酶（生化試劑，2×105U/g，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；氫氧化鈉、鹽酸、鐵氰化鉀、三氯乙酸等（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 主要儀器與設(shè)備

電子天平（AR224CN型，奧豪斯儀器（常州）有限公司）；磁力攪拌水浴鍋（SHJ-2A型，常州金壇良友儀器有限公司）；臺(tái)式高速離心機(jī)（H1850R型，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)（ST2100型，奧豪斯儀器（常州）有限公司）；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-1600型，上海美譜達(dá)儀器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 雞血抗氧化肽的制備工藝

新鮮雞血→加入濃度為4%的抗凝劑（檸檬酸鈉）→破胞（加3倍體積蒸餾水充分?jǐn)嚢瑁鸁嶙冃蕴幚恚?0 ℃，20 min）→冷卻→調(diào)pH→堿性蛋白酶水解→滅酶（沸水浴10 min）→離心（3 500 r/min，15 min）→取上清液→分析檢測(cè)

1.3.2 還原能力的測(cè)定

參照Ye等[17]的方法。取2.5 mL雞血酶解液，分別加入2.5 mL磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH 6.6）和2.5 mL 10 mg/mL鐵氰化鉀，充分混勻，于50 ℃水浴20 min，再加入2.5 mL 100 mg/mL三氯乙酸，混勻后10 000 r/min離心15 min，取2.5 mL上清液，分別加入0.5 mL 1 mg/mL三氯化鐵和2.0 mL蒸餾水，混勻后于700 nm波長(zhǎng)比色。

1.3.3 清除DPPH自由基能力測(cè)定

參考Wu等[18]的方法，配制不同濃度的雞血酶解物溶液，于517 nm波長(zhǎng)比色，計(jì)算溶液清除DPPH自由基能力。

1.3.4 清除羥自由基能力測(cè)定

參考王強(qiáng)等[19]的方法，配制不同濃度的雞血酶解物溶液，于536 nm波長(zhǎng)比色，計(jì)算溶液清除羥自由基能力。

1.3.5 單因素試驗(yàn)

試驗(yàn)分別以pH（8.0，9.0，10.0，11.0和12.0）、加酶量（4 000，6 000，8 000，10 000和12 000 U/g）、酶解溫度（40，45，50，55和60 ℃）和酶解時(shí)間（20，40，60，80和100 min）為影響因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，研究單因素對(duì)雞血酶解物還原能力的影響。

1.3.6 響應(yīng)面試驗(yàn)

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)（BBD）的試驗(yàn)原理，選取對(duì)雞血酶解物還原能力有顯著性影響的pH、加酶量、酶解溫度和酶解時(shí)間為自變量，以雞血酶解物的還原能力為響應(yīng)值，采用四因素三水平的響應(yīng)面分析法優(yōu)化雞血酶解工藝。響應(yīng)面因素水平編碼表見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平

1.4 統(tǒng)計(jì)處理

應(yīng)用SPSS 17.0軟件和Design-Expert 8.0軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)。采用Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，p＜0.05判定為變化顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 pH

pH對(duì)雞血酶解物還原能力影響顯著（圖1），雞血酶解物還原能力隨pH的增大呈現(xiàn)先增大后下降的趨勢(shì)。當(dāng)pH為11.0時(shí)，雞血酶解物的還原能力最強(qiáng)。其主要原因是試驗(yàn)所用堿性蛋白酶的最適pH為11.0，如偏離蛋白酶的最適pH，酶活明顯降低，影響酶解物的水解度和還原能力。

2.1.2 加酶量

加酶量顯著影響雞血酶解物的還原能力。圖1表明：在4 000～10 000 U/g范圍內(nèi)，雞血酶解物的還原能力隨加酶量的增加而增強(qiáng)，當(dāng)加酶量超過(guò)10 000 U/g時(shí)，雞血酶解物還原能力變化不顯著。其原因可能是在一定的底物質(zhì)量濃度下，增加酶用量提高了堿性蛋白酶與雞血蛋白的結(jié)合率，進(jìn)而加快了酶解的速率，但當(dāng)酶蛋白分子過(guò)于飽和后，酶解速率無(wú)顯著性增大，酶解產(chǎn)物的還原能力趨于平穩(wěn)，如繼續(xù)加大蛋白酶的用量反而會(huì)增加生產(chǎn)成本，因此選擇10 000 U/g作為最適加酶量。

2.1.3 酶解溫度

通常情況下，酶促反應(yīng)隨著溫度的升高而加快，但是當(dāng)溫度超過(guò)一定范圍后，酶的活性隨之下降甚至?xí)冃允セ钚?。試?yàn)研究了酶解溫度對(duì)雞血酶解物還原能力的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。酶解溫度對(duì)雞血酶解物還原能力影響顯著，隨溫度的升高，雞血酶解物的還原能力呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)酶解溫度為45 ℃時(shí)，雞血酶解物的還原能力最大。

2.1.4 酶解時(shí)間

圖1表明：雞血酶解物還原能力隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)酶解時(shí)間為80 min時(shí)，雞血酶解物還原能力最大，進(jìn)一步延長(zhǎng)酶解時(shí)間，雞血酶解物還原能力反而大幅度下降。其原因可能是隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，具有還原能力的肽段進(jìn)一步水解，形成了還原能力較小或不具還原能力的肽段[20]。

圖1 各因素對(duì)雞血酶解物還原能力的影響

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化雞血抗氧化肽酶解工藝

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取pH（A）、加酶量（B）、酶解溫度（C）和酶解時(shí)間（D）為影響因素，以雞血酶解物還原能力為響應(yīng)值，進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面分析，試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2.2 回歸方程方差分析

利用Design-Expert 8.0對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得到以雞血酶解物還原能力（Y吸光度）對(duì)各因素的回歸方程：

Y=0.57+0.068A+0.034B+0.026C-5.833×104D-0.029AB+5.500×105AC-0.020AD+8.900×103BC-3.400×103BD+5.500×103CD-0.096A2-0.076B2-0.12C2-0.046D2

2.2.3 模型及回歸方程系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)

對(duì)回歸模型方差進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表3。該模型的p=0.000 1＜0.01，說(shuō)明試驗(yàn)所選用的模型具有高度的顯著性，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案正確，可以用來(lái)預(yù)測(cè)響應(yīng)值。模型中A、A2、B2和C2對(duì)雞血酶解物還原能力影響極顯著，B和D2對(duì)雞血酶解物還原能力影響顯著，其他項(xiàng)系數(shù)均不顯著。在選取的因素水平范圍內(nèi)，按照對(duì)結(jié)果的影響排序，pH＞加酶量＞酶解溫度＞酶解時(shí)間。失擬項(xiàng)F值為913.98，表明數(shù)據(jù)中有少量異常點(diǎn)。

根據(jù)分析結(jié)果繪制響應(yīng)面曲面圖，結(jié)果如圖2所示。等高線(xiàn)是橢圓形，則表示兩因素交互作用顯著，同時(shí)沿因素軸向等高線(xiàn)變化越密集，則該因素對(duì)響應(yīng)值影響越顯著，反之越弱[21]。由圖2可知，4個(gè)因素對(duì)雞血酶解物還原能力影響大小順序依次為pH＞加酶量＞酶解溫度＞酶解時(shí)間，結(jié)果與表3一致。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 回歸方程方差分析

圖2 各因素對(duì)雞血酶解物還原能力影響的響應(yīng)面圖

2.2.4 最佳酶解工藝條件的驗(yàn)證結(jié)果

通過(guò)Design-Expert 8.0軟件得到堿性蛋白酶酶解雞血的最佳工藝參數(shù)：pH 11.34，加酶量10 335 U/g，酶解溫度45.56 ℃和酶解時(shí)間78.41 min。在該條件下，雞血酶解物還原能力的吸光度預(yù)測(cè)值為0.581 8；考慮到實(shí)際的可操作性，將上述工藝參數(shù)調(diào)整為pH 11.3，加酶量10 335 U/g，酶解溫度46 ℃和酶解時(shí)間78 min。對(duì)調(diào)整后的優(yōu)化的條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果表明，雞血酶解物還原能力的吸光度為0.570 1，與理論預(yù)測(cè)值基本吻合，因此基于響應(yīng)面法所得的優(yōu)化酶解參數(shù)是準(zhǔn)確可靠的。

2.3 雞血酶解物主要組成成分及抗氧化活性

雞血酶解后凍干，檢測(cè)其主要組成成分，結(jié)果見(jiàn)表4。雞血酶解物凍干粉粗蛋白含量高達(dá)71.15%，脂肪含量低于1%，是典型的高蛋白低脂類(lèi)原料。值得注意的是，由于酶解過(guò)程中需加入較多的酸堿試劑調(diào)節(jié)酶解所需的pH，雞血酶解物凍干粉的灰分含量接近20%，因此后續(xù)使用中需進(jìn)行脫鹽處理。

表4 雞血酶解物主要組成成分

表5 雞血酶解物體外抗氧化能力

將雞血酶解物凍干粉配制成不同濃度的溶液，研究雞血酶解物在化學(xué)模擬體系中的抗氧化活性，結(jié)果見(jiàn)表5。雞血酶解物的還原能力隨濃度的增大而增強(qiáng)，且在該范圍內(nèi)呈現(xiàn)較好的量效關(guān)系（R2=0.94）。雞血酶解物具有良好的清除羥自由基的能力，且與濃度呈顯著正相關(guān)（R2=0.97），當(dāng)雞血酶解物的質(zhì)量濃度為15.0 mg/mL時(shí)，羥自由基的清除率高達(dá)99.2%。此外，雞血酶解物還具備一定清除DPPH自由基的能力，15 mg/mL雞血酶解物DPPH清除率為64.58%。

3 結(jié)論

1) 以新鮮雞血為原料，采用滲透吸水破壞雞血血球細(xì)胞結(jié)構(gòu)，在此基礎(chǔ)上應(yīng)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化雞血的酶解工藝。結(jié)果表明，雞血酶解的最佳參數(shù)為pH 11.3，加酶量10 335 U/g，酶解溫度46 ℃，酶解時(shí)間78 min。與以往酶法水解雞血球制備抗氧化肽相比，該方法有利于雞血蛋白的充分利用。

2) 體外抗氧化活性試驗(yàn)證實(shí)雞血酶解物具有良好的抗氧化能力，15.0 mg/mL的雞血酶解物DPPH自由基清除率和羥自由基的清除率分別為64.58%和99.2%，可有望作為天然抗氧化劑和功能性食品原料。