多穗柯根皮苷微波輔助提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性評(píng)價(jià)

王代波，李冰晶，趙景芳，羅麗平，劉國(guó)華，徐青

貴州省生物研究所（貴陽(yáng) 550009）

多穗柯（Lithocarpus polystachyrusRehd）系殼斗科櫟屬常綠植物[1-2]，富含根皮苷（phiiorizn）[3]。根皮苷為根皮素和葡糖糖結(jié)合而成的苷[4]，是自然界很少存在的“少數(shù)黃酮”二氫查爾酮苷類(lèi)（chalcoensglycoside）[5]，主要存在于多穗柯、蘋(píng)果、梨等植物的組織中[6]，因在嫩葉、莖、根皮中的含量較高而得名[7]。近年研究發(fā)現(xiàn)根皮苷具有多種生物活性，如“三降”（降血壓[8]、降血糖[9]、降血脂[10]）、“三抗”（抗氧化[11-12]、抗過(guò)敏[13]、抗癌變[14]）、抑菌效果[15]、改善記憶力[16]等，因而根皮苷在醫(yī)藥、化妝品、食品等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。試驗(yàn)主要對(duì)多穗柯根皮苷的3種提取工藝進(jìn)行比較及對(duì)多穗柯根皮苷的抗氧化性進(jìn)行研究，以期對(duì)多穗柯根皮苷的深入開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

多穗柯老葉（采自貴州羅甸）、純水、食品級(jí)乙醇、根皮苷對(duì)照品（純度＞98%，批號(hào)GT67195，酷爾化學(xué)科技有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

800電動(dòng)離心機(jī)（上海梅香儀器有限公司）；JEA502型中藥粉碎機(jī)（北京市泰和格潤(rùn)儀器有限公司）；SHIMADZU UV-1750紫外分光光度計(jì)；FW135/FW200電子天平（上海譜春計(jì)量?jī)x器有限公司）；KQ-800DE微波儀器（昆山市微儀器公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 根皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分析天平精確稱(chēng)量根皮苷標(biāo)準(zhǔn)品6.0 mg，甲醇完全溶解定容于50 mL容量瓶中，得0.12 mg/mL根皮苷標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取0.5，1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 mL的0.12 mg/mL根皮苷標(biāo)準(zhǔn)溶液用甲醇定容于10 mL容量瓶中。用0.018 mg/mL根皮苷標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，確定根皮苷最大吸收波長(zhǎng)為284 nm。在284 nm處測(cè)定吸光度，得根皮苷質(zhì)量濃度Y（mg/mL）與吸光度X的回歸方程：Y=31.02X+0.025 3，R2=0.999 5。

1.3.2 提取工藝

烘箱60 ℃將多穗柯葉片樣品烘干，超微粉碎機(jī)將多穗柯葉片粉碎得粗粉，粗粉過(guò)篩（2號(hào)篩，孔徑0.710 mm）得細(xì)粉樣品。準(zhǔn)確稱(chēng)取5.0 g多穗柯樣品置于250 mL錐形瓶中，加入提取液（體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液），微波輔助提取多穗柯根皮苷，提取結(jié)束后，抽濾取定量提取液，稀釋、定容，過(guò)膜測(cè)定根皮苷吸光度，計(jì)算根皮苷得率。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

1.3.3.1 提取時(shí)間對(duì)根皮苷提取率的影響

采用70%乙醇為提取液。提取條件設(shè)定為提取溫度50 ℃、微波提取功率700 W、料液比1∶30（g/mL）。提取時(shí)間采用10，30，50，70和90 min。提取后284 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算根皮苷得率，考察提取時(shí)間對(duì)多穗柯根皮苷提取率的影響。

1.3.3.2 提取溫度對(duì)根皮苷提取率的影響

采用70%乙醇為提取液。提取條件設(shè)定為1.3.3.1取得較優(yōu)提取時(shí)間、微波提取功率700 W、料液比1∶30（g/mL）。提取溫度采用10，30，50，70和90 ℃。提取后284 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算根皮苷得率，考察提取溫度對(duì)多穗柯根皮苷提取率的影響。

1.3.3.3 提取功率對(duì)根皮苷提取率的影響

采用70%乙醇為提取液。提取條件設(shè)定為1.3.3.1取得較優(yōu)提取時(shí)間、1.3.3.2取得較優(yōu)提取溫度、料液比1∶30（g/mL）。微波提取功率采用100，300，500，700 和900 W。提取后284 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算根皮苷得率，考察提取功率對(duì)多穗柯根皮苷提取率的影響。

1.3.3.4 料液比對(duì)根皮苷提取率的影

采用70%乙醇為提取液。提取條件設(shè)定為1.3.3.1取得較優(yōu)提取時(shí)間、1.3.3.2取得較優(yōu)提取溫度、1.3.3.3取得較優(yōu)微波提取功率。采用料液比1∶10，1∶30，1∶50，1∶70和1∶90（g/mL）。提取后284 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算根皮苷得率，考察料液比對(duì)多穗柯根皮苷提取率的影響。

1.3.4 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)四因素（A提取時(shí)間、B提取溫度、C提取功率、D料液比）三水平的L9(34)正交試驗(yàn)，計(jì)算各組條件的提取率，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得出優(yōu)化工藝條件。

1.4 根皮苷粗提物抗氧化性試驗(yàn)

照1.3.4所優(yōu)化的提取條件，制備多穗柯根皮苷粗提液，將粗提液減壓濃縮至干，真空冷凍干燥成粉．將多穗柯細(xì)粉、根皮苷固體樣品和VC配制成0.1 mg/mL水溶液，分別測(cè)定自由基的清除能力，平行測(cè)定3次．羥自由基（·OH）清除能力按照文獻(xiàn)[17]所述方法測(cè)定；超氧陰離子（O2-·）清除能力按照文獻(xiàn)[18]所述方法測(cè)定；1, 1-二苯代苦味?；杂苫―PPH·）清除能力按照文獻(xiàn)[19]所述方法測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 提取時(shí)間對(duì)根皮苷提取率的影響

如圖1所示，根皮苷提取率隨提取時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)出先增長(zhǎng)后降低趨勢(shì)，提取時(shí)間50 min時(shí)提取率達(dá)到峰值，因此選用提取時(shí)間50 min進(jìn)行后續(xù)的單因素試驗(yàn)。

2.1.2 提取溫度對(duì)根皮苷提取率的影響

提取率在提取溫度50 ℃時(shí)取得峰值，提取溫度＜50 ℃時(shí)，溫度越高，提取率越高。提取溫度＞50 ℃時(shí)，溫度越高，提取率越低。因此選用提取溫度50 ℃進(jìn)行后續(xù)單因素試驗(yàn)。

2.1.3 微波提取功率對(duì)根皮苷提取率的影響

如圖3所示，根皮苷提取率隨提取功率升高而升高，提取功率700 W時(shí)取得峰值，提取功率大于700 W時(shí)，提取率開(kāi)始隨功率升高而降低，故提取功率700 W時(shí)能取得較好提取效果，選用其進(jìn)行后續(xù)單因素試驗(yàn)。

圖1 不同時(shí)間提取根皮苷得率

圖2 不同溫度提取根皮苷得率

圖3 不同功率提取根皮苷得率

2.1.4 料液比對(duì)根皮苷提取率的影響

由圖4可知，料液比小于1∶30（g/mL）時(shí)，提取率隨料液比快速升高。料液比大于1∶30（g/mL）時(shí)，提取率隨料液比增大緩慢下降，因此，料液比1∶30（g/mL）即可以達(dá)到較好的提取效果。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)出的最適宜提取條件，進(jìn)行四因素（A提取時(shí)間、B提取溫度、C提取功率、D料液比）三水平的L9(34)正交試驗(yàn)，因素水平表如表1所示，重復(fù)3次試驗(yàn)取均值，結(jié)果如表2所示，4因素極差滿(mǎn)足RA＞RB＞RD＞RC，表明以70%乙醇為提取液時(shí)，影響多穗柯根皮苷提取得率的因素依次為提取時(shí)間、提取溫度、料液比、提取功率，且較優(yōu)提取條件為A2B2C2D2，即以70%乙醇為提取液時(shí)，微波輔助提取多穗柯甜茶根皮苷的最佳條件為提取時(shí)間50 min、提取溫度50 ℃、微波提取功率700 W、料液比1∶30（g/mL）。

圖4 不同料液比提取根皮苷得率

表1 L9(34)因素水平表

表2 L9(34)正交試驗(yàn)直觀分析表

2.3 根皮苷粗提物抗氧化性試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3.1 根皮苷粗提物對(duì)·OH清除效果

如圖5所示，多穗柯粉和VC清除·OH的能力大致相當(dāng)，根皮苷粗提物清除·OH的能力顯著強(qiáng)于穗柯粉和VC，根皮苷經(jīng)微波輔助提取后，其清除·OH的能力顯著增強(qiáng)，且強(qiáng)于VC。

2.3.3 根皮苷粗提物對(duì)DPPH·清除效果

如圖7所示，根皮苷粗提物和VC清除DPPH·的能力均高于多穗柯粉；VC清除DPPH·能力高于多穗柯粉和根皮苷粗提物。根皮苷經(jīng)過(guò)提取后清除DPPH·能力有所提高，但還不及VC。

圖5 多穗柯粉、根皮苷粗提物、VC對(duì)·OH清除率

圖6 多穗柯粉、根皮苷粗提物、VC對(duì)清除率

圖7 多穗柯粉、根皮苷粗提物、VC對(duì)DPPH·的清除率

3 結(jié)論與討論

采用正交試驗(yàn)優(yōu)化微波提取多穗柯根皮苷的提取條件，確定優(yōu)化提取條件為提取時(shí)間50 min、提取溫度50 ℃、微波提取功率700 W、料液比1∶30（g/mL）。此條件下根皮苷提取率為1.392%，各因素對(duì)根皮苷提取率的影響大小排序?yàn)樘崛r(shí)間＞提取溫度＞料液比＞提取功率。經(jīng)過(guò)微波輔助法提取的根皮苷氧化性明顯強(qiáng)于多穗柯粉，表現(xiàn)良好抗氧化性。