柱層析純化甜菊糖苷工藝技術(shù)

童紅梅，王保平，高淑美，宋巧，周薇，郭敏

甘肅醫(yī)學(xué)院（平?jīng)?744000）

甜菊糖苷是從甜葉菊（Stevia rebaudiana（Bertoni）Hemsl.）的莖、葉中提取的一類高甜度、低熱量、對人體無副作用的天然甜味劑，屬于四環(huán)二萜類化合物[1]。其純品為白色結(jié)晶性粉末，分子式為C38H60O18，熔點(diǎn)198 ℃，易溶于水，可溶于甲醇、乙醇、四氫呋喃，不溶于苯、醚、氯仿等有機(jī)溶劑，有較好的耐熱性和穩(wěn)定性[2]。甜菊糖苷對肥胖病、糖尿病、高血壓病、心臟病、齲齒等有一定輔助治療作用[3]。對高純度甜菊糖苷的制備方法報(bào)道主要有乙醇沉淀法、樹脂吸附法和膜分離技術(shù)等，但提取的甜菊糖苷純度不高、顏色深、甜味不純正，導(dǎo)致甜菊糖苷不能大批量地應(yīng)用于食品工業(yè)中[4]。

試驗(yàn)以甘肅酒泉產(chǎn)甜葉菊為原料，通過超聲技術(shù)提取甜菊糖苷粗提樣品，用80%乙醇沉淀除雜、微孔膜過濾得到粗提樣品，用酸性氧化鋁（或氧化鎂）作為固定相，乙醇作為流動(dòng)相，去除粗提樣品中的雜質(zhì)，收集洗脫液結(jié)晶，得到純化樣品。通過比較氧化鋁和氧化鎂兩種吸附劑柱層析工藝條件（吸附劑種類、用量、洗脫劑種類、用量）對甜菊糖苷提取率、純度影響進(jìn)行研究，以得到純度較高的甜菊糖苷純品，解決生產(chǎn)中甜菊糖苷提取樣品純度低、顏色深、后味發(fā)苦甜味不純正的問題。

1 材料與方法

1.1 樣品

甜葉菊（購自酒泉市肅州區(qū)農(nóng)貿(mào)市場，由肅州區(qū)農(nóng)業(yè)局農(nóng)技科專家鑒別，冷藏于0 ℃?zhèn)溆茫?/p>

1.2 設(shè)備與儀器

中藥超聲提取機(jī)（JBT/C-YCL500T/3P，山東金百特）；Heidolp旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國）；微孔過濾器（天津雙吉實(shí)驗(yàn)材料經(jīng)營部）；紫外分光光度計(jì)（UV-1780島津蘇州公司）；數(shù)顯電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（101-2型，上海錦屏儀器儀表有限公司）；JP-1500B高速多功能粉碎機(jī)（永康市久品工貿(mào)有限公司）；HZK-JA 210電子天平（福州華志科學(xué)儀器有限公司）；SHHW-600三用電熱恒溫水箱水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.3 試劑

無水乙醇、氧化鋁（酸性，110 ℃烘干12 h，46～74 μm）、氧化鎂、蒽酮、濃硫酸（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；其他試劑均為分析純；甜菊糖苷標(biāo)準(zhǔn)品甜菊糖苷（STV，純度＞99.0%，日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社）。

1.4 方法

1.4.1 甜菊葉預(yù)處理

將甜葉菊干葉去雜去屑，水洗烘干（40 ℃，60 h）后粉碎粒度140 μm，干燥備用。

1.4.2 甜菊糖苷樣品提取制備

利用前期研究的提取方法，取冷凍干燥樣品10 g，液氮中充分研磨后加入80%乙醇（料液比1∶50 g/mL），充分混勻后功率200 W、60 ℃超聲處理40 min，反復(fù)提取3次，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸干，80%乙醇定容250 mL后離心（5 000 r/3 min）去掉沉淀，過0.30 μm微濾膜過濾得到粗提液。

1.4.3 柱層析純化

取直徑1 cm×16 cm玻璃層析柱，下端塞少許棉花，從頂端灌入干燥活化的5 g酸性氧化鋁粉末，要求柱體均勻、無空隙。將樣品用微量移液器從柱床上面慢慢均速加入到氧化鋁層析柱，待樣品全部滲入床面，用80%乙醇進(jìn)行洗脫，洗脫液用量約50 mL，在層析柱下端收集洗脫液，待全部樣品全部洗脫完畢，減壓回收乙醇，干燥得白色粉末狀甜菊糖苷純品，稱量，計(jì)算甜菊糖苷純度。重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.5 檢測方法

取白色結(jié)晶粉末0.1 g，用25 mL無水乙醇溶解定容為樣品液，取1.20 mL樣品液，加1.5%蒽酮溶液0.30 mL，濃硫酸3.00 mL，于80 ℃恒溫水浴鍋中顯色15 min，用蒽酮比色法進(jìn)行定量分析，在621 nm波長處分別測定各體系的吸光度，取平均值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品甜菊糖苷的質(zhì)量濃度，計(jì)算甜菊糖苷的提取率與純度。

1.5.1 甜菊糖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精準(zhǔn)稱取甜菊糖苷標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確配置0.20，0.30，0.40，0.50，0.60，0.70和0.80 mg甜菊糖苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液，置于10 mL容量瓶中，用80%乙醇溶液定容，渦旋混勻后加1.5%蒽酮溶液0.30 mL，濃硫酸2.00 mL，于80 ℃恒溫水浴鍋中顯色15 min（蒽酮比色法），于621 nm波長處分別測定各體系的吸光度。以甜菊糖苷質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性回歸方程為y=0.938 9x+0.199 1，相關(guān)系數(shù)r2=0.998 3。

1.5.2 甜菊糖苷提取率、純度的計(jì)算

樣品提取方法同前，合并濾液并真空濃縮，干燥得粗甜菊糖苷。取0.1 g粗提甜菊糖苷樣品，置于25 mL容量瓶中，80%乙醇超聲溶解并定容至刻度線。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法在最大吸收波長621 nm處測定吸光度，計(jì)算甜菊糖苷提取率[5]。

式中：m1為甜菊糖苷粗提品質(zhì)量，g；m2為甜葉菊葉質(zhì)量，g；X為甜菊糖苷粗取率，%。

式中：C為樣品甜菊糖苷質(zhì)量濃度，mg/mL；m3為稱取的粗甜菊糖苷粗提品質(zhì)量，g；V為樣品體積，25 mL；Y為甜菊糖苷提取率，%。

式中：m4為純化樣品甜菊糖苷質(zhì)量，g；m5為粗甜菊糖苷質(zhì)量，g；Z為甜菊糖苷純度，%。

1.5.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均用x±s表示，多組均數(shù)間比較用F檢驗(yàn)，2組間均數(shù)差異以SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。以p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同吸附劑對柱層析純化甜菊糖苷的影響

用1.4.3的方法稱取等量的用相同方法處理的氧化鋁、氧化鎂吸附劑各3份裝柱層析，用1.4.2的方法制備的樣品上樣，用80%乙醇洗脫，收集洗脫液，用紫外分光光度計(jì)蒽酮比色法，測定甜菊糖苷粗提品中甜菊糖苷的質(zhì)量，計(jì)算甜菊糖苷提取率與純度，結(jié)果見表1。

圖1 甜菊糖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 不同吸附劑對甜菊糖苷提取與純度的影響

結(jié)果表明，采用氧化鋁作吸附劑，甜菊糖苷的提取率平均為22.41%，甜菊糖苷純度為90.88%，樣品顏色略帶淡黃色；采用氧化鎂作吸附劑，甜菊糖苷的提取率平均為28.37%，甜菊糖苷純度為92.21%，樣品顏色為無色；氧化鎂層析與氧化鋁層析比較表明，甜菊糖苷的提取率氧化鎂層析高于氧化鋁層析5.96%（p＞0.05），差異不顯著；甜菊糖苷純度氧化鎂層析高于氧化鋁層析1.33%（p＞0.05），差異不顯著；氧化鎂作為吸附劑優(yōu)于氧化鋁，脫色效果很好，樣品純度高。但是，以氧化鎂作為吸附劑層析時(shí)間比較長，流速慢，主要原因可能是氧化鎂粉末的粒度（75～150 μm）比氧化鋁小，吸附力強(qiáng)[6]。

2.2 吸附劑用量對純化甜菊糖苷的影響

用1.4.3的方法制備層析柱6份，分別按照m（原料）∶m（酸性氧化鋁）=1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5，1∶6和1∶7，精密稱取酸性氧化鋁1，2，3，4，5，6和7 g并分別裝好柱，柱層析，收集洗脫液，用紫外分光光度計(jì)蒽酮比色法，測定甜菊糖苷粗提品中甜菊糖苷的質(zhì)量，計(jì)算甜菊糖苷提取率與純度，結(jié)果見表2。

結(jié)果表明，以5 g樣品為對照，可以看出氧化鋁用量愈少，樣品脫色愈差，甜菊糖苷提取率、純度愈??；氧化鋁用量4 g時(shí)，其樣液顏色脫色效果最好，近于無色且透明，樣品純度可達(dá)90.83%。氧化鋁用量＜4 g時(shí)，樣液顏色脫色效果不好且渾濁；氧化鋁用量＞4 g時(shí)，樣液脫色效果好，甜菊糖苷提取率與純度均有提高，表現(xiàn)為劑量與提取率、純度同步增長的趨勢，但是酸性氧化鋁用量過多，造成酸性氧化鋁浪費(fèi)，從而導(dǎo)致生產(chǎn)成本高。因此，氧化鋁用量4 g為宜。

表2 吸附劑用量對甜菊糖苷純化效果的影響

2.3 洗脫劑體積分?jǐn)?shù)對純化甜菊糖苷的影響

用1.4.3的方法稱取4 g酸性氧化鋁制備6個(gè)層析柱，取3 mL樣品液上樣，分別用10%，30%，50%，70%，90%和100%乙醇50 mL洗脫，觀察層析現(xiàn)象，收集洗脫液，用紫外分光光度計(jì)蒽酮比色法，測定甜菊糖苷粗提品中甜菊糖苷的質(zhì)量，計(jì)算甜菊糖苷提取率與純度。結(jié)果見表3。

結(jié)果顯示，以80%乙醇洗脫為對照，乙醇體積分?jǐn)?shù)低于30%時(shí)，洗脫樣品甜菊糖苷提取率低、純度?。╬＜0.01）；50%乙醇50 mL洗脫酸性氧化鋁層析柱，洗脫液為無色透明液體，樣液脫色效果好，樣品純度為82.75%（p＜0.05）；70%乙醇，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)提高，洗脫樣品純度也在提高，但差異不顯著。因此，為得到高純度的樣品，選用70%乙醇洗脫較好。

表3 洗脫劑體積分?jǐn)?shù)對甜菊糖苷純化效果的影響

2.4 洗脫劑用量對純化甜菊糖苷的影響

用1.4.3的方法稱取4 g酸性氧化鋁制備8個(gè)層析柱，取3 mL樣品液上樣，分別采用70%乙醇10，20，30，40，50，60，70和80 mL洗脫，收集洗脫液，用紫外分光光度計(jì)蒽酮比色法，測定甜菊糖苷質(zhì)量，計(jì)算甜菊糖苷提取率與純度。結(jié)果見表4。

結(jié)果顯示，以50 mL洗脫劑為對照，洗脫劑乙醇的用量10 mL時(shí)，甜菊糖苷提取率為13.41%，純度為69.11%，洗脫樣品淡黃色，甜菊糖苷提取率低、純度?。╬＜0.01）；用量20 mL時(shí)，甜菊糖苷提取率為17.73%，純度為73.89%，洗脫樣品無色，甜菊糖苷提取率低、純度?。╬＜0.05）；洗脫劑乙醇的用量大于40 mL時(shí)，洗脫劑的用量增加，對甜菊糖苷提取率、純度影響差異不顯著（p＞0.05），約為10倍柱體積。

表4 洗脫劑用量對甜菊糖苷純化效果的影響

3 結(jié)論與討論

利用柱層析技術(shù)分離純化甜菊糖苷混合物樣品，用酸性氧化鋁（氧化鎂）4 g粉末干法裝柱，徑高比1∶5，上樣量3 mL，用70%乙醇進(jìn)行洗脫，洗脫液用量為10倍柱體積，回收乙醇干燥得白色粉末狀甜菊糖苷粗樣品，用蒽酮比色法計(jì)算甜菊糖苷提取率和純度，采用氧化鋁作吸附劑，甜菊糖苷的提取率平均為22.41%，甜菊糖苷純度為90.88%；采用氧化鎂作吸附劑，甜菊糖苷的提取率平均為28.37%，甜菊糖苷純度為92.21%。氧化鋁層析與氧化鎂層析比較，甜菊糖苷的提取率氧化鎂層析高于氧化鋁層析5.96%，甜菊糖苷純度氧化鎂層析高于氧化鋁層析1.33%，氧化鎂作為吸附劑優(yōu)于氧化鋁。但氧化鎂層析耗時(shí)較長，有待進(jìn)一步改進(jìn)。該工藝與報(bào)道的乙醇沉淀法、微孔膜過濾法、大孔樹脂法[7-8]、分離純化工藝相比，酸性氧化鋁柱層析工藝流程更簡單，且脫色效果好，產(chǎn)品純度高，有一定推廣價(jià)值。