秸稈酶解液脫毒工藝對異養(yǎng)小球藻發(fā)酵的影響

楊磊，辛納慧，李鈺媛，劉雨，畢生雷，張乃群*

1. 南陽師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院（南陽 473061）；2. 河南天冠企業(yè)集團(tuán)有限公司車用生物燃料技術(shù)國家重點實驗室（南陽 473000）

微藻食品是既新穎又傳統(tǒng)的食品。與其他傳統(tǒng)藻類食品相比，微藻食品含有多肽、藻蛋白、不飽和脂肪酸和藻多糖，能夠?qū)μ悄虿』颊?、心臟病患者、高血壓患者、低免疫力人群起到良好的保健作用。微藻食品中含有的嘌呤還具有抑制膽固醇形成、促進(jìn)膽固醇分解排泄、降低血脂的功效。同時，食用微藻食品還富含膳食纖維，能夠增加飽腹感，有助于幫助肥胖人群減肥。因此，繼螺旋藻之后，小球藻、雨生紅球藻也越來越多地被用于保健品，微藻食品也越來越多地受到關(guān)注。異養(yǎng)小球藻與其他自養(yǎng)藻類相比，具有不占用耕地、不受氣候因素影響、可利用工業(yè)化生產(chǎn)裝置、生長周期短、含油量高等優(yōu)點，但由于異養(yǎng)小球藻培養(yǎng)成本高，相關(guān)產(chǎn)品一直未能推出市場[1]。使用秸稈能夠大幅降低異養(yǎng)小球藻原料成本，從而為產(chǎn)業(yè)化奠定基礎(chǔ)。

秸稈是指農(nóng)作物成熟脫粒后剩余的莖葉部分，通過農(nóng)作物的光合作用，農(nóng)作物中有一半的產(chǎn)物遺留在秸稈中[2]。在生活中秸稈是天然的綠色飼料，有機(jī)質(zhì)含量約15%，碳水化合物含量約30%，1 t秸稈的營養(yǎng)價值相當(dāng)于0.25 t糧食[3]，因此近年來秸稈越來越多地被用于替代糧食成為生物發(fā)酵的原料。秸稈的有效利用能夠解決長期以來生物發(fā)酵與民爭糧的問題和秸稈未充分利用帶來的環(huán)境污染問題。秸稈的化學(xué)組成主要包含有半纖維素、木質(zhì)素，約占固體物料總質(zhì)量的80%，還有少量果膠、淀粉和單寧。秸稈天然的抗解結(jié)構(gòu)阻礙纖維素降解為可發(fā)酵的糖類[3]，蒸汽爆破是應(yīng)用較多的秸稈預(yù)處理方法，但隨之產(chǎn)生的香草醛、阿魏酸、愈創(chuàng)木酚等物質(zhì)能夠抑制大部分微生物的正常生長，脫毒工藝成為消除抑制物的關(guān)鍵[4]。

常用的脫毒方法包括活性炭吸附、中和法、膜蒸餾法、酶處理法等，這些新興脫毒方法在降低抑制物含量的同時還存在著試劑殘留、成本高、糖損失多等各種問題，不利于規(guī)?；瘧?yīng)用，尋找成本低、易操作的脫毒工藝有助于推動秸稈作為生物質(zhì)能源原料的應(yīng)用進(jìn)程。蒸汽爆破產(chǎn)生的酸類、酚類、醛類抑制物均溶于水，且沸點普遍低于300 ℃，水洗法能夠使抑制物溶于水并隨著濾液脫離秸稈爆破料，高溫烘干法則能夠使抑制物汽化、脫離秸稈爆破料，水洗+濾液回收則是在水洗法基礎(chǔ)上優(yōu)化以提高糖利用率的工藝，這幾種工藝都有工藝簡單、設(shè)備投資小的特點。擬在3種工藝的基礎(chǔ)上研究秸稈酶解液脫毒工藝對異養(yǎng)小球藻發(fā)酵結(jié)果的影響，以降低異養(yǎng)小球藻的培養(yǎng)成本。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

異養(yǎng)小球藻（清華大學(xué)生命科學(xué)院）；玉米秸稈、黑曲霉、纖維素酶（河南天冠企業(yè)集團(tuán)有限公司）；沸石粉、葡萄糖、酵母粉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉等（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 試驗設(shè)備

蒸汽爆破裝置、洗滌裝置（自制）；LNB2.5-10F型馬弗爐（上海皓莊儀器有限公司）；FE20-FiveEasy Plus型pH計（梅特勒-托利多集團(tuán)有限公司）；202-2型電熱恒溫干燥箱（上海博珍儀器設(shè)備）；L400型離心機(jī)（長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；YXQ-WF型滅菌鍋（上海印溪儀器儀表有限公司）；ZWY-111B型搖床（上海智誠儀器設(shè)備有限公司）；DK-600型恒溫水浴鍋（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；SC-237型展示柜（青島澳柯瑪股份有限公司）；安捷倫2100型液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 秸稈爆破預(yù)處理方法

使用蒸汽爆破預(yù)處理，將玉米秸稈烘干至恒質(zhì)量，過60目篩，室溫密封儲存。準(zhǔn)確稱取50 g 樣品，將5 g水霧化均勻噴灑在試樣上。裝入塑料袋密封，室溫條件下浸潤12 h。將試樣進(jìn)行蒸汽爆破（汽爆條件為蒸汽壓強(qiáng)2.2 MPa、壓力維持時間200 s）預(yù)處理，汽爆后收集物料備用[5]。

1.3.2 脫毒方法

1.3.2.1 水洗脫毒法

將一定量的汽爆玉米秸稈，按m（秸稈）∶m（水）=1∶7.5比例混勻攪拌，浸泡60 min后過濾，濾渣80 ℃烘干至恒重，作為酶解的原料[6]。

1.3.2.2 水洗+濾液回收脫毒法

將一定量的汽爆玉米秸稈，按m（秸稈）∶m（水）=1∶1比例攪拌混勻，以3 000 r/min離心后，將非溶性固體與60 ℃的相同體積的水混合均勻，反復(fù)5次（每次減少洗水體積20%）直至過濾后洗水液呈無色，合并洗水液，并將其放入真空干燥箱中于真空度0.03 MPa下65 ℃濃縮，直至洗水液體積減少50%～70%。向濃縮液中加入沸石粉20%，靜置6 h后取出，以3 000 r/min離心，汲取上清液與爆破物的非溶性固體混合，以此作為酶解的原料[7]。

1.3.2.3 高溫烘干脫毒法

將汽爆玉米秸稈于125 ℃烘至恒質(zhì)量，以此作為酶解的原料[8]。

1.3.3 洗滌方法[9]

單次洗滌：取適量脫毒后原料，按一定固液比與蒸餾水充分混勻，用氨水調(diào)節(jié)pH為4.8，濾去游離水以此作為酶解原料。

多次洗滌：取適量脫毒后原料，按一定固液比取蒸餾水，將蒸餾水分3份，每次用一份蒸餾水與原料這個好混勻、濾去游離水，第3次洗滌時用氨水調(diào)節(jié)pH為4.8。

1.3.4 酶解方法

在三角瓶中加入10 g酶解原料配成50 g/L溶液，加入600 IU纖維素酶液與檸檬酸緩沖液，放入50 ℃恒溫水浴搖床中，在pH 4.8、150 r/min條件下酶解60 h。反應(yīng)結(jié)束后沸水中煮沸10 min離心，上清液經(jīng)稀釋后測定還原糖濃度[10]。

1.3.5 發(fā)酵條件

發(fā)酵溫度28 ℃，pH 6.5，轉(zhuǎn)速200 r/min；發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：葡萄糖30 g/L、酵母粉3 g/L，K2HPO4·3H2O 0.075 g/L、MgSO4·7H2O 0.075 g/L、CaCl2·2H2O 0.025 g/L、KH2PO40.175 g/L，其他微量營養(yǎng)鹽若干[11]。使用汽爆料酶解液提供50%配料用水，其余部分由自來水補(bǔ)足，葡萄糖含量不足部分由葡萄糖試劑補(bǔ)足。

1.3.6 檢測方法

采用HPLC法測定葡萄糖、木糖含量；細(xì)胞數(shù)采用血球板計數(shù)；干物質(zhì)質(zhì)量濃度測定方法：取10 mL發(fā)酵液，離心后除去上清液，加蒸餾水至10 mL，再次離心，100 ℃下烘干藻泥，然后計算干質(zhì)量。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析方法

干物質(zhì)質(zhì)量濃度計算如式（1）[11]。

使用Origin 75進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 脫毒工藝優(yōu)化

汽爆預(yù)處理后的原料中會產(chǎn)生乙酸、糠醛等毒性物質(zhì)。在酶解發(fā)酵前應(yīng)對汽爆處理后的物料進(jìn)行脫毒處理，但脫毒的過程會導(dǎo)致酶解料成分變化、糖分損耗及設(shè)備投資增加及工藝的復(fù)雜性。因此，在酶解發(fā)酵前脫毒工藝的選擇至關(guān)重要[12]。

2.1.1 不同脫毒方法對發(fā)酵液干物質(zhì)質(zhì)量濃度的影響

發(fā)酵液干物質(zhì)質(zhì)量濃度是發(fā)酵液及發(fā)酵液中細(xì)胞失去自由水以后的質(zhì)量濃度，能夠表示發(fā)酵液的生物量高低，代表發(fā)酵水平好壞。發(fā)酵液干物質(zhì)質(zhì)量濃度不僅能表明細(xì)胞數(shù)量、代謝產(chǎn)物的水平，還能表明細(xì)胞個體重量，從而更全面的表示發(fā)酵水平好壞。同樣條件下發(fā)酵液干物質(zhì)質(zhì)量濃度越大則發(fā)酵液中細(xì)胞數(shù)量越多、單個細(xì)胞質(zhì)量越大。

不同脫毒方法對發(fā)酵液干物質(zhì)質(zhì)量濃度的影響如圖1所示，隨著發(fā)酵時間的推移，各試驗組的干物質(zhì)質(zhì)量濃度均不斷增加，未添加汽爆料酶解液的對照組，發(fā)酵速度較快，干物質(zhì)質(zhì)量濃度增長迅速，在發(fā)酵第5天即達(dá)到最大干物質(zhì)質(zhì)量濃度（9.76 g/L）。未處理組發(fā)酵速度最慢，且在發(fā)酵第4天干物質(zhì)質(zhì)量濃度達(dá)到最大值（2.33 g/L），隨后不斷回落，可能是汽爆料酶解液中的糠醛、乙酸等有害物質(zhì)含量過高抑制了異養(yǎng)小球藻的正常生長，且發(fā)酵后期藻細(xì)胞死亡、自溶，導(dǎo)致干物質(zhì)質(zhì)量濃度減少。其他3個試驗組在發(fā)酵過程中干物質(zhì)質(zhì)量濃度也正常增長，但增長速度略低于對照組，水洗+濾液回收組發(fā)酵終了干物質(zhì)質(zhì)量濃度達(dá)到9.29 g/L，接近對照組，而水洗組和高溫烘干組的發(fā)酵終了干物質(zhì)質(zhì)量濃度分別為8.71和7.25 g/L，說明水洗+濾液回收組脫毒處理最理想，高溫烘干組則殘留較多的有害物質(zhì)。從發(fā)酵液干物質(zhì)質(zhì)量濃度評判，水洗+濾液回收組最佳，其次是水洗組，高溫烘干組最差。

圖1 不同脫毒方法對干物質(zhì)質(zhì)量濃度的影響

秸稈蒸汽爆破在破壞秸稈內(nèi)部結(jié)構(gòu)的同時，也導(dǎo)致秸稈中的木質(zhì)素等物質(zhì)在高溫條件下產(chǎn)生了酸類、醛類、酚類等眾多對微生物發(fā)酵有抑制作用的物質(zhì)，因此沒有進(jìn)行脫毒的未處理組異養(yǎng)小球藻生長受到嚴(yán)重抑制。酸類、醛類等抑制物的沸點均介于60～138℃之間，能夠在高溫烘干條件下去除，但酚類抑制物的沸點普遍高于200 ℃難以被去除，因此高溫烘干組雖然能夠生長但生長情況低于其他處理組。酸類、酚類、醛類等抑制物均溶于水，水洗能夠有效降低抑制物含量，從而有利于發(fā)酵的正常進(jìn)行，因此水洗處理的發(fā)酵干物質(zhì)質(zhì)量濃度高于高溫烘干組。水洗的同時會導(dǎo)致部分糖損失，而水洗+濾液回收則能夠?qū)p失在水洗液中的糖再利用起來的同時進(jìn)一步降低酸類、醛類、酚類物質(zhì)的抑制作用，從而使發(fā)酵結(jié)果更佳[3]。

2.1.2 不同脫毒方法對葡萄糖含量的影響

葡萄糖是異養(yǎng)小球藻能夠直接利用的碳源，且利用效率最高。葡萄糖含量的變化能夠反映異養(yǎng)小球藻生長和代謝情況。

不同脫毒方法對葡萄糖含量的影響如圖2所示，隨著發(fā)酵時間推移，葡萄糖含量不斷降低，特別是對照組，葡萄糖含量降速最快，在發(fā)酵第5天，葡萄糖含量即降到0，說明對照組提供的發(fā)酵液環(huán)境最適合異養(yǎng)小球藻發(fā)酵，異養(yǎng)小球藻的生長、代謝均比較旺盛。水洗+濾液回收組次之，在發(fā)酵第6天，葡萄糖含量降到0。水洗組、高溫烘干組則在發(fā)酵第5天后葡萄糖含量較低時消耗速度迅速放緩。而未處理組的葡萄糖含量一直處于緩慢下降過程中，在發(fā)酵進(jìn)行到第4天以后，葡萄糖含量不再變化。

發(fā)酵初期除了未處理組外，其他試驗組葡萄糖含量比較接近，說明未處理組中成分更為復(fù)雜，培養(yǎng)基在高溫滅菌時受到美拉德反應(yīng)更為明顯。對照組沒有受到任何抑制作用，因此在發(fā)酵第5天葡萄糖即消耗完畢，未脫毒處理組葡萄糖消耗非常緩慢，說明未處理組提供的發(fā)酵液環(huán)境中殘留的抑制物質(zhì)過多，影響異養(yǎng)小球藻的正常生長和代謝，在發(fā)酵后期由于異養(yǎng)小球藻細(xì)胞酶活性衰竭、生長代謝停滯，導(dǎo)致葡萄糖不再消耗，葡萄糖含量不再變化。所有脫毒處理組與對照組相比，葡萄糖消耗均有一定的延后，說明使用脫毒處理并沒有完全消除抑制物的影響，不同的脫毒工藝酸類、酚類、醛類等抑制物質(zhì)殘留程度不同導(dǎo)致葡萄糖消耗速度不同，在發(fā)酵結(jié)束時高溫烘干組在所有脫毒處理組中葡萄糖殘留最多，其次是水洗組，水洗+濾液回收組葡萄糖消耗完畢，試驗結(jié)果與發(fā)酵干物質(zhì)質(zhì)量濃度結(jié)果互相印證，說明水洗+濾液回收組更有利于發(fā)酵進(jìn)行[13]。

圖2 不同脫毒方法對葡萄糖含量的影響

2.1.3 不同脫毒方法對pH的影響

pH反映發(fā)酵液中微生物細(xì)胞的生長環(huán)境，以及微生物細(xì)胞的代謝水平。異養(yǎng)小球藻發(fā)酵過程產(chǎn)酸，正常發(fā)酵過程pH不斷降低，而到發(fā)酵末期，由于細(xì)胞營養(yǎng)物質(zhì)跟不上，藻細(xì)胞衰老、自溶，從而導(dǎo)致pH上升。另外，發(fā)酵過程中如果溶氧過低、滲透壓過大等影響藻細(xì)胞正常生長、代謝的因素均會導(dǎo)致藻細(xì)胞死亡、pH上升。

不同脫毒方法對發(fā)酵液pH的影響如圖3所示，隨著發(fā)酵時間的推移，未處理組的pH不斷上升，說明未處理組的發(fā)酵液環(huán)境不適宜異養(yǎng)小球藻生長，在發(fā)酵過程中不斷有藻細(xì)胞死亡從而導(dǎo)致pH不斷上升，而其他試驗組的pH開始不斷下降，說明藻細(xì)胞在代謝過程中不斷產(chǎn)酸，藻細(xì)胞生長代謝正常，而在發(fā)酵末期，由于細(xì)胞老化，藻細(xì)胞死亡數(shù)量過多，導(dǎo)致pH上升。在發(fā)酵初期，對照組的pH最高，未處理組的pH最低，這可能是汽爆料中乙酸等物質(zhì)影響了發(fā)酵液的pH。

結(jié)合圖1～圖3，水洗+濾液回收組的發(fā)酵過程和結(jié)果最接近對照組，其次是水洗組，未處理組則不能提供適合異養(yǎng)小球藻生長、代謝的環(huán)境。但水洗+濾液回收組處理濾液需要使用沸石粉，沸石粉雖然能夠吸附糠醛等醛類抑制物，但不能有效吸附乙酸等有機(jī)酸類抑制物，而且在使用過程中又有部分吸附的抑制物返回到汽爆料漿中，而從發(fā)酵液干物質(zhì)質(zhì)量濃度來看，水洗+濾液回收組僅比比水洗組高0.58 g/L，增加幅度不大，卻需要消耗新的原料，因此，選擇使用水洗處理汽爆料。

圖3 不同脫毒方法對pH的影響

2.2 洗滌工藝優(yōu)化

水洗能夠降低酸類、酚類、醛類等發(fā)酵抑制物，但同時水洗還需要消耗大量的水資源，水洗之后產(chǎn)生的廢液也會造成明顯的環(huán)保壓力和成本壓力，因此優(yōu)化洗滌工藝有助于提高產(chǎn)量、減少成本。在相同用水量（m（秸稈）∶m（水）=1∶7.5）條件下，開展單次洗滌和多次洗滌對異養(yǎng)小球藻發(fā)酵結(jié)果影響的研究，結(jié)果見圖4。

圖4和圖5分別是不同洗滌方法和不同用水量對干物質(zhì)質(zhì)量濃度的影響。隨著用水量增加，發(fā)酵終了干物質(zhì)質(zhì)量濃度也不斷增加，用水量（m（秸稈）∶m（水）=1∶7.5）1∶7.5試驗組比1∶5試驗組提高5.44%，而用水量（m（秸稈）∶m（水）=1∶7.5）1∶9試驗組比1∶7.5試驗組提高2.36%，干物質(zhì)質(zhì)量濃度增加比率下降明顯。用水量（m（秸稈）∶m（水）=1∶7.5）1∶9試驗組發(fā)酵終了干物質(zhì)質(zhì)量濃度達(dá)到9.53 g/L接近于對照組的9.76 g/L，說明多次洗滌、用水量（m（秸稈）∶m（水）=1∶9）能夠滿足需要。

圖4是不同洗滌方法對干物質(zhì)質(zhì)量濃度的影響，單次洗滌試驗組和多次洗滌試驗組發(fā)酵終了干物質(zhì)質(zhì)量濃度分別為8.7和9.31 g/L，多次洗滌試驗組比單次洗滌提高6.89%。多次洗滌可提高水資源利用效率。

圖4 不同洗滌方法對干物質(zhì)質(zhì)量濃度的影響

圖5 不同用水量對干物質(zhì)質(zhì)量濃度的影響

3 小結(jié)

使用不同脫毒方法處理汽爆料，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用水洗脫毒法處理汽爆料發(fā)酵終了干物質(zhì)質(zhì)量濃度比對照組低10.76%，使用水洗脫毒法處理汽爆料對異養(yǎng)小球藻正常生長、代謝沒有太大影響，進(jìn)一步優(yōu)化洗滌工藝，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用多次洗滌、用水量（m（秸稈）∶m（水）=1∶9），發(fā)酵終了干物質(zhì)質(zhì)量濃度達(dá)到9.53 g/L，僅比對照組低2.41%，能夠滿足需要。水洗脫毒法處理汽爆料工藝簡單、操作步驟少，適宜于規(guī)模化生產(chǎn)使用。