食品中雌激素的生物學檢測方法研究進展

徐詩熒，孫嘉笛，張銀志，紀劍，孫秀蘭

（江南大學食品學院，江蘇 無錫 214100）

1 食品中的雌激素

雌激素是女性的主要性激素，在調節(jié)正常生理和各種疾病狀態(tài)中起重要作用[1]，可分為內源性雌激素和外源性雌激素[2]。內源性雌激素是由體內腺體或細胞分泌的激素，最常見的有雌二醇、雌三醇和雌酮。而外源性雌激素包括合成雌激素、植物雌激素和環(huán)境雌激素。其中，植物雌激素是一種多酚類物質，是大豆、水果、蔬菜等食品中含有的天然成分，類似于內源性雌激素的結構。環(huán)境雌激素則屬于（endocrine disruptors，EDCs），是天然或合成化合物。該類雌激素通過模仿或阻斷內源性激素的作用，影響人體的內分泌功能[3-4]。生活中常見的環(huán)境雌激素有氯聯(lián)苯、雙酚A（bisphenol A，BPA）和鄰苯二甲酸鹽[5]。

研究表明，動物源食品中有較多的雌激素殘留[6]，其中牛奶和乳制品中是人體雌激素的主要膳食來源，其中含有雌二醇等內源性雌激素[7-8]。研究表明，市場上部分商品牛奶中的雌二醇含量達到5 pg/mL～20 pg/mL[9]，而兒童血清中的雌二醇含量則低于2 pg/mL[10]。因此，長期攝入含有高雌激素含量的牛奶會導致兒童性早熟或對成人的內分泌系統(tǒng)產(chǎn)生干擾[8]。

此外，外源性雌激素也廣泛存在于食品中，蜂王漿、茶、巧克力、咖啡渣[11]中均含有雌激素類化合物。由于豆制品是亞洲國家飲食中不可缺少的一部分，據(jù)統(tǒng)計，人體異黃酮的攝入量可達到15 mg/d～50 mg/d[12]，這可能會導致男性產(chǎn)生女性化的生理癥狀。玉米赤霉烯酮（zearalen-one，ZEN）和雙酚 A（BPA）是近年來受到廣泛關注的具有雌激素效應的物質。ZEN作為非甾體雌激素霉菌毒素，是一種主要的食物污染物[13-14]，具有雌激素干擾毒性。食用被ZEN污染的食物或飼料會對人類或動物產(chǎn)生有害影響，例如降低生育能力和生殖能力[15]。而BPA作為具有雌激素作用的內分泌干擾物，被廣泛用于聚碳酸酯嬰兒瓶和環(huán)氧食品罐中。食用罐裝食品會導致人體內BPA含量增加，從而增加肥胖、糖尿病和冠心病的風險[16]。

雖然雌激素有益于預防阿爾茨海默癥、冠心病以及骨質疏松，但也會對人體產(chǎn)生許多不良影響。過量攝入雌激素不僅會干擾固有的激素平衡、增加乳腺癌的發(fā)病率[17]，還會誘發(fā)免疫介導的疾病[18]。目前，國際上對食品中BPA和ZEN的含量有明確的規(guī)定。根據(jù)歐盟2002/72/EC法規(guī)，塑料食品接觸材料中BPA的遷移量為3 mg/kg，其最大理論每日攝入量為50 μg/kg·bw/d，與美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）規(guī)定相同。歐盟規(guī)定仔豬日糧中ZEN的最高限量為100 μg/L，而我國規(guī)定復合飼料和玉米中ZEN的最高限量為500 μg/L。目前，各國沒有規(guī)定食品中內源性雌激素的標準含量，但商品牛奶中雌激素的水平和人類長期飲用牛奶對人體健康的不利影響越來越受到學術界的關注。同時調查表明，從不同國家和地區(qū)采集的13種食品補充劑樣品中，在14.8%的非激素補充劑中檢測到成分列表中未標記的類固醇激素成分[19]。因此，檢測食品中的雌激素有利于保障人體健康，避免雌激素對人體的不利影響。

2 食品中雌激素的生物學檢測方法

免疫分析和儀器分析是現(xiàn)階段檢測食品中雌激素的主要手段，但由于雌激素結構的多樣性，這兩種方法只能檢測食品中已知的雌激素，有局限性，而利用雌激素對細胞和動物的生物學效應來評價不同物質的雌激素效應可以彌補這一不足。

雌激素通過雌激素信號途徑實現(xiàn)其生理功能，其信號途徑可分為基因組信號和非基因組信號，分別由經(jīng)典核受體（estrogen receptor，ER）和G蛋白偶聯(lián)受體（gproteincoupledreceptor，GPER）介導[20]?；蚪閷У男盘柾緩酵ㄟ^經(jīng)典的核受體：ERα和ERβ發(fā)揮作用[21]。雌激素刺激細胞后，與雌激素受體結合，誘導受體構象變化，形成二聚體，并直接或間接激活受體轉錄域[22]。二聚體可以直接與雌激素反應元件（estrogen response element，ERE）結合以誘導轉錄[23]，而在沒有 ERE 序列的情況下，二聚體可以由DNA轉錄因子介導，間接結合到轉錄域[24]。非基因介導的雌激素信號途徑，通過GPER和雌激素的結合，激活表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR），介導雌激素信號轉錄，引起絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）的激活、cAMP的產(chǎn)生和細胞內鈣的動員[25]。

信號通路被雌激素激活后，可以調節(jié)細胞內基因和蛋白質的表達，并介導細胞發(fā)育、增殖、遷移和存活等一系列下游事件，從而對代謝調節(jié)組織如子宮、脂肪、骨骼肌等產(chǎn)生生理影響[26-28]。例如，雙酚A通過ERα途徑促進OVCAR-3細胞的增殖[29]；雌二醇通過激活GPR30信號通路增強LSD1的表達，介導人子宮內膜癌的增殖[30]；在ERα陽性MCF-7細胞中，雌激素激活ERα轉錄，誘導ΔNp63的表達，從而誘導整合素β4 的表達，導致蛋白激酶 B（protein kinase B，AKT）磷酸化，提高細胞活力和遷移能力[31]。為此，建立了一系列基于雌激素信號通路的生物檢測方法，以滿足特異性篩選雌激素效應物的需要。

2.1 體內實驗

雌激素原始的檢測方法為體內實驗，其中子宮營養(yǎng)試驗和魚類內分泌干擾試驗是我國環(huán)境中篩選分泌物的常規(guī)方法。子宮營養(yǎng)試驗被用于檢測雌激素活性的活性效應，被認為是檢測雌激素活性物質的“金標準”[32]。類固醇受體分布在動物子宮中，雌激素可通過受體信號途徑調節(jié)子宮功能[33]。該方法需要選擇去勢成年雌性或幼齡雌性嚙齒動物進行連續(xù)給藥和稱重，經(jīng)過一段時間后，剝離動物子宮稱重。通過計算子宮濕重和子宮與體重的比值，篩查樣品中的雌激素。小鼠子宮增重實驗可用于評價咖啡渣和食品包裝中雙酚A的雌激素效應，發(fā)現(xiàn)咖啡副產(chǎn)物及其主要成分具有雌激素樣信號轉導活性[34]。趙丕文等[35]利用子宮增重實驗研究淫羊藿等10種中藥的雌激素樣作用，發(fā)現(xiàn)淫羊藿具有一定的植物雌激素活性。

魚類內分泌干擾試驗是以肝臟產(chǎn)生的卵黃蛋白（yolk protein，VTG）作為生物標記物，檢測外源性雌激素[36-37]。卵黃蛋白原是卵黃蛋白原蛋白的主要成分，在外源性雌激素的刺激下其表達量會增加[38]。例如，BPA可通過ER受體介導途徑誘導雄性魚肝臟中VTG的表達[39]。選擇在試驗容器中飼養(yǎng)魚體，并使其暴露于含有化學物質的水體。喂養(yǎng)一定時間后，取血液或組織進行卵黃原蛋白檢測，以評價雌激素活性水平。通過研究雌二醇對瓦氏黃顙魚產(chǎn)生的的激素效應，發(fā)現(xiàn)雄性瓦氏黃顙對雌激素較為敏感，可作為外源性雌激素的檢測模型[40]。除此以外，斑馬魚也被用作雌激素的評估模型，用于比較不同物質的的雌激素效應[11]。

體內實驗雖然是一種可靠的雌激素效應篩選方法，但該方法操作復雜，試驗周期長，成本高。為了簡化試驗操作。因此，在魚類內分泌干擾試驗的基礎上，建立了以原代肝細胞為模型的體外細胞檢測方法。將細胞暴露于含有受試物的培養(yǎng)基中，用VTG水平評價受試物的雌激素活性[41]。該方法需要對細胞進行裂解，分別在基因和蛋白水平上檢測VTG的表達水平。

2.2 細胞增殖實驗（E-screen）

為了提高檢測效率，建立了一種基于雌激素樣物質對靶細胞增殖影響的E-screen方法。許多研究表明，雌激素與雌激素受體結合后可介導乳腺癌細胞的增殖，如果受試物中含有雌激素作用的物質，其對乳腺癌細胞的刺激將促進細胞增殖。通過計算受試物作用前后的細胞相對增殖效應值或增值速度來評價受試物的雌激素活性[42]。

為更好的模擬細胞在體內的生理環(huán)境，提高檢測的可靠性，可在乳腺癌培養(yǎng)體系中加入大鼠肝S9體系。肝S9起到代謝化學物的作用，使得檢測結果與體內實驗結果高度吻合[43]。E-screen方法可用于檢測環(huán)境水中的污染物[44]，評價中藥提取物和蔬菜提取物[45]。與VTG法相比，E-screen法更敏感，通常結合體內試驗確保試驗的可靠性[46]。

2.3 生物傳感器

2.3.1 表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）生物傳感器

表面等離子體共振（SPR）是電子在金屬/介質界面上產(chǎn)生的強電磁振蕩的現(xiàn)象，由于其對金屬膜旁材料的敏感折射率而被廣泛應用于各種生物傳感器中，SPR反射金屬在倏逝場中的反射指數(shù)（reflection index，RI）的變化與金屬膜另一側生物分子的密度成正比。因此，SPR無需進行任何標記，就可以實時檢測金膜表面生物分子的結合和解離[47]。

基于此技術，研制了一種無標記SPR生物傳感器芯片。以ERα和ERE作為生物特征元件，將其固定在生物芯片的金屬膜上。當受試物中含有雌激素時，雌激素會迅速形成不穩(wěn)定的ER/ERE復合物，改變ER與ERE之間的相互作用，通過檢測結合效率和絡合物穩(wěn)定性的差異來評估雌激素效應[48]。同時，ERα和構象敏感肽可直接用于識別雌激素受體結合區(qū)的活性構象，以檢測低劑量水平的雌激素[49]。目前，該生物傳感器已應用于食品包裝和玉米籽禪中雙酚A的檢測，檢測限分別為5.2 pg/mL和7.07 ng/mL[50-51]。

2.3.2 細胞電化學生物傳感器

電化學生物傳感器以生物活性物質為生物功能性敏感基元，加入檢測目標物后，通過信號轉換器將生物學變化轉化為電學信號，借此達到檢測目的。而細胞電化學是基于生物電化學的原理，結合細胞和分子生物學技術，對細胞進行分析和表征的技術，揭示外源分子與細胞結構或功能的關系[52]。

雌激素的電化學檢測方法是通過檢測乳腺癌細胞中嘌呤引起的電信號變化來評估雌激素活性。乳腺癌細胞在雌激素的刺激下會產(chǎn)生增殖效應，從而導致細胞中嘌呤的增加[53]。細胞的電化學信號與鳥嘌呤的氧化有關。鳥嘌呤能迅速通過細胞膜到達電極表面，引起電化學信號的變化[54]。利用這一原理，可以評價不同物質的雌激素效應，但這種方法并沒有很高的特異性，逐漸被電化學免疫傳感器取代。

2.3.3 熒光細胞生物傳感器

以雌激素受體控制的報告基因為基礎的重組酵母篩選技術（pecombinant yeast estrogen system，RYES）是近年來被廣泛應用于雌激素效應的篩選。其原理是將雌激素受體基因、雌激素效應元件和編碼β-半乳糖苷酶（lac-z）的基因重組于酵母細胞[55]。當受試物具有雌激素樣作用時，受試物與雌激素受體結合，介導雌激素效應元件的轉錄，從而激活lac-z報告基因，產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，使底物β-d-半乳吡喃糖苷變黃。通過測量β-半乳糖苷酶的活性，定量檢測受試物的雌激素效應[56]。YES技術的基礎上，以熒光素酶作為報告基因，構建穩(wěn)定表達ERE的重組HeLa細胞株，用于檢測草魚等魚肉中雌激素樣物質的含量，E2的加標回收率均在75%以上，相對標準偏差為7.3%～11.6%，具有較高的精密度[57]。

但對熒光素酶的檢測需要預先對細胞壁進行破壞，操作步驟較為復雜。為此，BOVEE等[58]利用增強型綠色熒光蛋白（yEGF）改進了YES技術。以增強型熒光蛋白作為報告基因法，可以直接測定熒光蛋白的熒光值，簡化了操作步驟。該方法檢測雌二醇的半最大效應濃度（EC50）約為0.6 nmol/L，與傳統(tǒng)YES方法的0.2 nmol/L相比更為靈敏[59]。除了酵母細胞模型，哺乳動物細胞系也可以作為載體來轉移重組基因，其敏感性更高，但與子宮增重試驗相關性較差[60]。曹旭等[61]以雌激素反應元件（ERE）及綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）為報告基因轉染了乳腺癌細胞，雌二醇以劑量依賴的方式誘導穩(wěn)定轉染細胞系表達GFP，最大效應濃度為 1×10-10mol/L，EC50為 1.5×10-11mol/L。

熒光細胞生物傳感器可作為動物源性食品中雌激素活性水平的快速篩選方法。采用該方法對4個城市采集的豬肉、雞肉、牛肉、魚類和雞蛋樣品進行了檢測，結果顯示，所有樣本均具有雌激素活性[62]。除了動物源性食品外，食品添加劑、牛奶和啤酒也可以使用該方法評估雌激素活性[63-64]。

3 生物學檢測方法的優(yōu)勢及不足

目前，檢測食品中的雌激素含量多采用儀器分析和免疫分析方法，但雌激素的結構多樣，這兩種方法只能檢測出已知結構的雌激素。同時，儀器分析前需要對樣品進行預處理[65]，目標分析物需要預富集，操作復雜困難。更重要的是，液相、質譜等儀器價格昂貴，受場地限制。而免疫分析法雖然有更高的檢測效率，但其對抗體的制備要求較高，不同雌激素的免疫檢測需要對應的抗原支持，目前還難以完全覆蓋，無法同時檢測多種雌激素化合物，限制了雌激素效應物質的篩選。

基于雌激素效應途徑的生物檢測方法可以檢測復雜基質的雌激素活性，彌補了儀器分析和免疫分析的不足。具有較高的特異性，可評價已知和未知物質的雌激素效應，不僅可以預測單一組分的雌激素效應，還能夠評估混合物的聯(lián)合雌激素活性[66]。但該方法不能實現(xiàn)單組分的準確定量，檢測精度也不如儀器分析和免疫分析。

4 展望

基于對雌激素的高度特異性，生物檢測將成為食品中雌激素檢測的首選。在未來的發(fā)展中，需要提高生物檢測的準確性。同時，由于受試物中的化學物質未知，其中可能存在毒素因子，導致假陰性情況。因此，在后續(xù)檢測中，有必要結合毒性試驗，研究物質間相互作用對雌激素效應的影響，提高檢測結果的準確性。同時，雌激素分子檢測與毒性效應檢測結合，有利于更好的了解食品中雌激素對人體的影響。以細胞毒性為基礎建立的雌激素毒性效應檢測，能夠做到對食品基質以及水體中雌激素的定性檢測。通過檢測受雌激素特異性調控的基因或蛋白的表達量變化，對樣品中的雌激素含量進行檢測，能夠更全面的評估雌激素對人體的生物學效應。

檢測手段和設備的便攜化、數(shù)字化也是食品檢測未來的發(fā)展趨勢。在生物檢測分析方法的基礎上，研制雌激素檢測試劑盒。并在此基礎上，開發(fā)便攜式檢測設備，并與移動應用連接，實現(xiàn)實時檢測。這不僅有利于提高檢測效率，也能滿足現(xiàn)場檢測的需要。此外，雌激素預測模型的建立將是雌激素檢測的關鍵工作。MANSOURI等[67]建立了協(xié)同雌激素受體活性預測項目（collaborative estrogen receptor activity prediction project，CERAPP），以預測數(shù)千種化學品的雌激素受體相關活性。在沒有試驗數(shù)據(jù)的情況下，該模型可以為試驗人員提供缺少的信息，并進行有針對性的試驗。因此，雌激素檢測的數(shù)字化發(fā)展對食品檢測具有重要意義。

總的來說，食物中的雌激素會通過食物鏈進入人體，通過雌激素信號途徑干擾人體內分泌系統(tǒng)，產(chǎn)生不良的生理效應。雌激素的生物學檢測方法不僅滿足了廣泛篩選食品中雌激素效應物質的需要，而且具有較好的特異性，彌補了儀器檢測和免疫檢測的不足。但其定量分析余儀器分析相比不夠準確，需要在今后的發(fā)展中加以解決。同時，生物方法與數(shù)字化相結合，也有利于推動食品檢測向高效化方向發(fā)展。