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    芒根組織在不同非生物脅迫下最適內(nèi)參基因的篩選

    2021-01-18 08:27:30黃逸之唐銘余鐘旻依王芮嘉陳嘉怡葉云天張新全
    關(guān)鍵詞:分析

    黃逸之,唐銘余,鐘旻依,王芮嘉,陳嘉怡,葉云天,張新全,聶 剛*

    (1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,成都 611130;2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院,成都 611130)

    基因表達(dá)分析已廣泛運(yùn)用于新基因預(yù)測(cè)、基因功能研究等方面。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)能準(zhǔn)確定量地分析目標(biāo)基因的表達(dá),在檢測(cè)基因表達(dá)方面具有重要作用[1]。與傳統(tǒng)的基因檢測(cè)方法相比,實(shí)時(shí)熒光定量PCR靈敏度高、特異識(shí)別性強(qiáng)、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確[2-3]。然而,qRT-PCR相對(duì)定量表達(dá)結(jié)果的準(zhǔn)確性受多種因素的影響,如RNA反轉(zhuǎn)錄合成效率、RNA質(zhì)量、擴(kuò)增效率和分析方法等[4-5]。為避免此類誤差的產(chǎn)生,在進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析時(shí),需引入特異性好、表達(dá)穩(wěn)定的高質(zhì)量?jī)?nèi)參基因?qū)δ康幕虻谋磉_(dá)進(jìn)行校正[6]。通常,高質(zhì)量?jī)?nèi)參基因可以在不同試驗(yàn)條件、不同組織、細(xì)胞都穩(wěn)定表達(dá),通常為看家基因[7],如 β 微管蛋白(tubulin,TUB),肌動(dòng)蛋白(β-actin,ACTIN),蛋白磷酸酶 2A(Protein Phosphatase 2A,PP2A),多聚泛素酶基因(UBQ),轉(zhuǎn)錄延伸因子(transcription elongation factors,EF-1a)以及 18S 核糖體RNA(18S ribosomal RNA,18S rRNA)等基因[8-9]。但越來(lái)越多的研究表明,在一定試驗(yàn)條件下穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因,其穩(wěn)定性會(huì)隨試驗(yàn)條件的變化而變化[10-11],在任何試驗(yàn)條件下都穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因很少[12]。因此,針對(duì)不同的植物、組織及試驗(yàn)處理,篩選表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因很有必要。

    芒(Miscanthus sinensis)是禾本科芒屬多年生高草本植物,光合碳固定效率高,生態(tài)適應(yīng)性強(qiáng),適宜在邊際土地上種植,具有很大的發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用價(jià)值[13]。邊際土地易受干旱、重金屬等非生物脅迫的影響,而芒根系發(fā)達(dá),生物量大,抗氧化和光合能力強(qiáng),且根系具有多種有益微生物輔助芒吸收養(yǎng)分,分泌有機(jī)酸,從而有利于芒應(yīng)對(duì)重金屬等非生物脅迫[14]。目前,有關(guān)植物進(jìn)行非生物脅迫下內(nèi)參基因篩選的研究報(bào)道很多,如多年生黑麥草(Lolium perenne)[15]、擬南芥(Arabidopsis thaliana)[16]、番茄(Lycopersicon esculentum)[17]、紫花苜蓿(Medicago sativa L.)[18]等,但對(duì)于芒內(nèi)參基因篩選的研究報(bào)道相對(duì)較少。因此,有必要根據(jù)芒的不同組織和不同的試驗(yàn)處理,篩選不易受外源性或內(nèi)源性因素影響的穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因。本研究中,通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析比較12個(gè)候選內(nèi)參基因在芒根組織中不同非生物脅迫(干旱、鹽、鎘、鉻和砷)下的表達(dá)穩(wěn)定性,運(yùn)用 geNorm(ver.3.5)[19]、NormFinder(ver.0.953)[20]、BestKeeper(ver.1.0)[21]和 RefFinder[22]程序軟件以及ΔΔCt法[23]分析試驗(yàn)數(shù)據(jù),以期獲得不同脅迫條件下芒根組織中穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因。

    1 材料和方法

    1.1 供試材料

    供試材料為“M20100819”和“M20101302”兩個(gè)野生芒品種,分別采自海拔高度差異較大的兩地:四川省雅安市天全縣二郎山和眉山市洪雅縣(N 29°57′30.1″,E 102°24′36.4″,1388m;N 29°53′22.6″,E 103°21′59.2″,483.5 m)。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 材料培養(yǎng)與脅迫處理

    在濾紙上發(fā)芽芒種子后,移栽到塑料杯(直徑9 cm)中進(jìn)行沙培,用1X的Hoagland’s營(yíng)養(yǎng)液在植物生長(zhǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為白天28℃進(jìn)行12 h,夜間25℃進(jìn)行12 h。待植株長(zhǎng)到5到6葉時(shí)對(duì)材料分別進(jìn)行干旱脅迫、鹽脅迫、砷脅迫、鉻脅迫和鎘脅迫處理。干旱脅迫采用20%PEG 6000模擬,鹽脅迫用300 mmol/L NaCl處理,砷、鉻、鎘3個(gè)重金屬脅迫分別用含200 mg/L As5+(Na2HASO4·7H2O)、200 mg/L Cr6+(K2Cr2O7)、200 mg/L Cd2+(CdCl2·2.5H2O)的霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行處理。所有處理均持續(xù)6 d,并在處理的第0、1、3、6天對(duì)不同脅迫處理分別取樣,將植株洗凈取其根組織,液氮冷凍,于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2 RNA提取與cDNA合成

    采用Direct-zolTMRNA MiniPrep試劑盒并按照其說(shuō)明書提取芒根組織的總RNA。使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性,檢測(cè)合格的RNA采用iScript cDNA SynthesisKit試劑盒(Bio-Rad Laboratories Inc.)按說(shuō)明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈,反轉(zhuǎn)錄程序?yàn)?25℃啟動(dòng)5 min,46℃開(kāi)始反轉(zhuǎn)錄20 min,95℃反轉(zhuǎn)錄失活1 min,最后于4℃保存。cDNA產(chǎn)物在-20℃儲(chǔ)藏備用。

    1.2.3 候選內(nèi)參基因的選擇和引物設(shè)計(jì)

    本試驗(yàn)選擇以下12個(gè)內(nèi)參基因作為芒的候選內(nèi)參基因:18S rRNA、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、ACTIN、蛋白磷酸酶 2A(Protein Phosphatase 2A,PP2A)、真核起始因子 4a(Eukaryotic initiation factor 4 alpha,eIF4a)、S-腺苷甲硫氨酸合成酶(S-adenosylmethionine synthase,SAMS)、S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶(S-adenosylmethionine decarboxylase,SAMDC)、Sb09g019750、Sb02g041180及從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出的 3個(gè) unigene:Unigene33312、Unigene33024和Unigene26576(NCBI SRA 數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào):SRP102136)。通過(guò)同源基因序列比對(duì)后,使用在線軟件primer 3.0(http://primer3.ut.ee/)對(duì)候選內(nèi)參基因的引物進(jìn)行設(shè)計(jì)。其中Sb09g019750和Sb02g041180的引物參考于前人對(duì)芒屬植物的研究[24](表1)。

    表1 12個(gè)候選內(nèi)參基因引物序列及相關(guān)信息Table 1 Primer sequences and related information for 12 candidate reference genes

    1.2.4 qRT-PCR反應(yīng)

    將cDNA產(chǎn)物稀釋3倍,作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR的模板,對(duì)12個(gè)內(nèi)參基因的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。配制的熒光定量PCR總反應(yīng)體系共10 μL:SsoAdvanced Universal SYBR? Green Supermix(2X)5 μL,上游下游引物各 0.5 μL,cDNA 模板1.5 μL及2.5 μL的Nuclease H2O。qRT-PCR擴(kuò)增過(guò)程:95℃預(yù)變性 30 s,95℃變性 10 s,60℃延伸 30 s,35個(gè)循環(huán)。為驗(yàn)證每種引物的特異性,進(jìn)行了Tm分析。所有qRT-PCR反應(yīng)均做了3個(gè)技術(shù)重復(fù)和生物學(xué)重復(fù)。數(shù)據(jù)由實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Bio-Rad,USA)讀取,并為每對(duì)引物構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線,以確定每對(duì)引物的擴(kuò)增效率和回歸系數(shù)(R2)。

    1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

    本研究使用4種軟件工具geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder來(lái)分析12個(gè)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。geNorm軟件對(duì)候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定值(average expression stability value,M)進(jìn)行分析并排序,M值越低的基因越穩(wěn)定。一般認(rèn)為M值低于1.5的內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定,可作為理想內(nèi)參[25]。該軟件還可通過(guò)對(duì)內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定值進(jìn)行排序,并依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化因子配對(duì)差異分析Vn/Vn+1判定最適內(nèi)參基因的數(shù)量。NormFinder軟件根據(jù)12個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性篩選出最優(yōu)內(nèi)參基因[20]。此外,可以通過(guò)BestKeeper軟件計(jì)算變異系數(shù)(coefficient of variation,CV)和標(biāo)準(zhǔn)偏差(standard deviation,SD)來(lái)確定內(nèi)參基因的穩(wěn)定性,CV值越小,內(nèi)參基因越穩(wěn)定[21]。由于這3種方法的分析結(jié)果存在一定的差異性,故使用在線網(wǎng)絡(luò)工具RefFinder進(jìn)行綜合分析,并將其作為整體的最終排名,從而篩選出在不同脅迫下最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 引物特異性驗(yàn)證

    以芒根組織材料RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板,對(duì)12個(gè)內(nèi)參基因進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增,利用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(圖1),結(jié)果顯示,所有基因擴(kuò)增引物目標(biāo)片段均為單一清晰可辨條帶,且條帶大小與預(yù)期大小一致。表明引物能特異性擴(kuò)增且不存在引物二聚體,適用于qRT-PCR研究。

    2.2 不同非生物脅迫條件下內(nèi)參基因的Ct值分析

    利用Ct法測(cè)定12個(gè)內(nèi)參基因在不同非生物脅迫下的相對(duì)表達(dá)量,從而分析內(nèi)參基因間轉(zhuǎn)錄水平的高低。Ct值(cycle threshold)與基因表達(dá)豐富度密切相關(guān),Ct值越小,表達(dá)豐度越高[26]。Ct值比較結(jié)果顯示,各個(gè)內(nèi)參基因的表達(dá)水平存在一定的差異(圖2)。12個(gè)候選內(nèi)參基因的Ct值處于7.27到34.59之間,其中18S rRNA的表達(dá)豐度最高,Unigene33312表達(dá)量最低,其他候選內(nèi)參基因的表達(dá)豐度介于中間水平。

    圖1 12個(gè)候選內(nèi)參基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Figure 1 PCR results for twelve candidate reference genes

    圖2 候選內(nèi)參基因在不同非生物脅迫環(huán)境下的平均Ct值Figure 2 All candidate reference genes in the different abiotic stress environments mean Ct values

    2.3 geNorm分析

    geNorm軟件分析結(jié)果顯示:在鉻脅迫處理下,所有候選內(nèi)參基因的M值都小于1.5,表明12個(gè)候選內(nèi)參基因均能穩(wěn)定表達(dá),穩(wěn)定性排名前兩位的內(nèi)參基因?yàn)镻P2A和Sb09g019750;在干旱脅迫和鹽脅迫下,表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因分別為Unigene33024和 Unigene26576 、Unigene26576和 Sb09g019750;在重金屬鎘脅迫和重金屬砷脅迫處理下,表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因分別是PP2A和Unigene26576、PP2A和Sb09g019750;而在考慮所有樣本的情況下,表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因?yàn)閁nigene26576和Unigene33024(圖 3)。

    圖3 12個(gè)候選內(nèi)參基因在geNorm分析下的表達(dá)穩(wěn)定性值(M)Figure 3 Expression stability values(M)of 12 candidate reference genes by geNorm

    此外,geNorm程序還能基于成對(duì)變異分析確定所需的最佳內(nèi)參基因數(shù)量。geNorm軟件可用于分析內(nèi)參基因的配對(duì)差異值(Vn/Vn+1),軟件分析默認(rèn)值為0.15。當(dāng)Vn/Vn+1大于0.15時(shí),需要引入第n+1基因;當(dāng)Vn/Vn+1小于0.15時(shí),無(wú)須引入新的內(nèi)參基因[19]。本次試驗(yàn)中,所有樣品的V2/3小于0.15,則該試驗(yàn)條件下的最適內(nèi)參基因數(shù)目是2個(gè)。鉻脅迫下的成對(duì)變異(V2/3)小于0.15,表明使用兩個(gè)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因(PP2A和Sb09g019750)可以足夠。干旱脅迫、鎘脅迫、砷脅迫、鹽脅迫的成對(duì)變異(V3/4)均大于0.15,這表明可能需要4個(gè)內(nèi)參基因來(lái)進(jìn)行精確的歸一化(圖4)。

    2.4 NormFinder分析

    本研究利用NormFinder軟件分析12個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性,內(nèi)參基因具有較低的穩(wěn)定值表明該基因更穩(wěn)定(表2)。根據(jù)NormFinder軟件分析結(jié)果可知:在所有樣品中,Unigene26576的穩(wěn)定值最低,為最佳內(nèi)參基因。而不同脅迫處理的水平不同,在鎘和鉻脅迫下最穩(wěn)定的內(nèi)參基因均為Unigene33312;干旱脅迫下GAPDH最穩(wěn)定,其值為0.470;鹽脅迫和砷脅迫下最穩(wěn)定的內(nèi)參基因分別為Sb02g041180和 Sb09g019750。比較NormFinder和geNorm,ΔΔCt法的結(jié)果,雖然排名各有一些不同,但最穩(wěn)定的前5名內(nèi)參基因幾乎相同,總體趨勢(shì)一致。

    圖4 geNorm通過(guò)成對(duì)變異(V)分析計(jì)算最佳內(nèi)參基因數(shù)Figure 4 geNorm calculated the optimal number of reference genes by pairwise variation (V)analyses.

    2.5 BestKeeper分析

    BestKeeper通過(guò)計(jì)算候選內(nèi)參基因的CV±SD值,結(jié)果以升序排序,值越小的候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性越好。通過(guò)結(jié)果分析(表3),在所有樣品中Sb02g041180(4.07±0.40)最穩(wěn)定,當(dāng)考慮不同處理時(shí),最穩(wěn)定的內(nèi)參基因各不相同:干旱脅迫下為ACTIN(2.17±0.65);鹽脅迫下是 Sb09g019750(4.02±0.40);砷脅迫和鎘脅迫下均為Unigene26576;鉻脅迫下最穩(wěn)定的內(nèi)參基因是Unigene33312(12.56±0.45)。整體來(lái)看,BestKeeper分析候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性結(jié)果排名同以上3種算法結(jié)果基本一致。

    2.6 RefFinder分析

    使用在線網(wǎng)絡(luò)工具RefFinder綜合評(píng)估和篩選內(nèi)參基因。結(jié)果顯示(表4),干旱脅迫處理下,最穩(wěn)定的內(nèi)參基因?yàn)镾b02g041180和ACTIN;鹽脅迫處理下,最穩(wěn)定的內(nèi)參基因?yàn)镾b09g019750和Unigene26576;3種重金屬(砷、鎘、鉻)脅迫處理下,最穩(wěn)定的內(nèi)參基因分別為Sb09g019750和PP2A、Uni-gene26576和 PP2A、Sb09g019750和 Unigene33312。而在所有樣本中,Unigene26576和Unigene33024是最理想的內(nèi)參基因,18S rRNA和SAMS是最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

    表2 12個(gè)候選內(nèi)參基因在NormFinder分析下的表達(dá)穩(wěn)定值Table 2 Expression stability values of 12 candidate reference genes calculated by the NormFinder

    表3 12個(gè)候選內(nèi)參基因在BestKeeper分析下的表達(dá)穩(wěn)定值Table 3 Expression stability values of 12 candidate reference genes determined via BestKeeper.

    表4 12個(gè)候選內(nèi)參基因的綜合排名Table 4 The comprehensive ranking of 12 candidate reference genes

    3 討論與結(jié)論

    在不同的植物、組織和試驗(yàn)條件下,最優(yōu)內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性不同[27]。Huang L.等[28]發(fā)現(xiàn),在澇脅迫下,鴨茅(Dactylis glomerata L.)葉組織中 CYP2是最穩(wěn)定的內(nèi)參基因,而蔣曉梅等[29]證實(shí),在相同條件下,鴨茅根組織中表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因是TCTP。冷脅迫下,柳枝稷(Panicum virgatum)葉組織中UBC表達(dá)穩(wěn)定性最好[30],而根組織中ACTIN表達(dá)穩(wěn)定性最強(qiáng)[31]。研究表明,內(nèi)參基因除了在不同組織中表達(dá)穩(wěn)定性不同,在不同植物中也具有表達(dá)差異。ACTIN在油菜[32](Brassica napus)中表達(dá)穩(wěn)定性較差,而相同條件下在檸條錦雞兒[33](Caragana Korshinskii)中表達(dá)穩(wěn)定性較好。此外,葉新如等[34]研究了冬瓜(Benincasa hispida)的7個(gè)候選內(nèi)參基因在不同非生物脅迫處理葉片中的表達(dá)穩(wěn)定性。結(jié)果表明,不同脅迫處理下,表達(dá)最穩(wěn)定內(nèi)參基因也不同,高溫脅迫下表達(dá)最穩(wěn)定的是UBQ基因,而干旱脅迫下表達(dá)最穩(wěn)定的則是TUA基因。

    近年來(lái),越來(lái)越多的研究選擇從本物種的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選內(nèi)參基因。Yang C.L.等[35]通過(guò)分析圓齒野鴉椿(Euscaphis konishii)3個(gè)不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選出3個(gè)穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因:EkUBC23、EkCYP38和EkGAPDH2。Liu Q.等[36]在多花黑麥草(Lolium multiflorum L.)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選得到在鹽堿脅迫下表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因?yàn)閁nigene14912。本研究候選的unigene中Unigene26576在鎘脅迫下和所有樣本中表達(dá)最穩(wěn)定,表明了其作為芒新內(nèi)參基因的應(yīng)用潛力,同時(shí)證明了基于本物種轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選內(nèi)參基因的可行性。此外,通過(guò)RefFinder軟件分析發(fā)現(xiàn)在鹽、砷和鉻3種脅迫下,芒根組織最穩(wěn)定的內(nèi)參基因?yàn)镾b09g019750。然而Zhong M.等[37]證實(shí),RefFinder鑒定下芒葉組織中Sb09g019750基因在鹽和鉻脅迫處理下沒(méi)有表現(xiàn)出較強(qiáng)的穩(wěn)定性,這表明在同一植物的不同組織中,內(nèi)參基因也具有表達(dá)差異。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析中,常選擇功能較穩(wěn)定的管家基因用于試驗(yàn)分析。侯維海等[38]對(duì)地黃(Rehmannia glutinosa)實(shí)時(shí)定量PCR內(nèi)參基因進(jìn)行篩選,結(jié)果顯示18S rRNA表達(dá)豐度最高。而一些研究發(fā)現(xiàn)管家基因在某些植物中存在表達(dá)不穩(wěn)定的情況。比如,在本研究中,18S rRNA在所有非生物脅迫下表達(dá)均不穩(wěn)定,在鹽、砷、鎘脅迫下穩(wěn)定性最差。因此,驗(yàn)證候選內(nèi)參基因在不同植物、組織及試驗(yàn)條件下的表達(dá)穩(wěn)定性,選擇最適內(nèi)參基因是保證試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的前提保障。

    本研究使用 geNorm、NormFinder、BestKeeper軟件分析試驗(yàn)數(shù)據(jù),結(jié)果顯示3種分析方法在鑒定最穩(wěn)定內(nèi)參基因時(shí)存在排序差異,這可能與不同程序使用不同算法而產(chǎn)生的差異有關(guān)。如王寧航等[39]對(duì)望春玉蘭內(nèi)參基因篩選時(shí)發(fā)現(xiàn),使用geNorm和NormFinder兩種軟件分析結(jié)果具有較高相似性,分析得到的最佳內(nèi)參基因?yàn)镸bTEF,最差的內(nèi)參基因?yàn)镸bUBC,而BestKeeper軟件分析結(jié)果與二者差異較大,該軟件篩選得到的最佳內(nèi)參基因?yàn)镸bCYP。在本研究中,分析結(jié)果與其大致相似。geNorm和NormFinder鑒定下最穩(wěn)定的內(nèi)參基因均為Unigene26576,而BestKeeper分析發(fā)現(xiàn)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因?yàn)镾b02g041180,最不穩(wěn)定的基因和geNorm和NormFinder篩選結(jié)果相同,均為18S rRNA。目前對(duì)于使用哪個(gè)軟件能夠更加科學(xué)準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)內(nèi)參基因的穩(wěn)定性并沒(méi)有公認(rèn)的經(jīng)驗(yàn),為此我們利用線上網(wǎng)絡(luò)工具RefFinder對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析。結(jié)果顯示,在所有樣本中,表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因?yàn)閁nigene26576和Unigene33024,此結(jié)果與 geNorm分析結(jié)果一致。同時(shí),使用以上4種分析軟件檢測(cè)18S rRNA的穩(wěn)定性均較差。因此,利用不同的軟件分析試驗(yàn)數(shù)據(jù),并比較不同的算法差異能更加準(zhǔn)確地篩選出穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

    本研究對(duì)芒根組織在不同非生物脅迫下12個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,在鹽、砷、鉻脅迫下,最穩(wěn)定的內(nèi)參基因?yàn)镾b09g019750;在干旱脅迫下,Sb02g041180基因穩(wěn)定性最高,其次為ACTIN;在鎘脅迫下,Unigene26576基因穩(wěn)定性最高,PP2A其次。綜合數(shù)據(jù)顯示,Unigene26576和Unigene33024為芒根組織在不同非生物逆境下的最適內(nèi)參基因。此為芒在不同脅迫下的進(jìn)一步研究提供了合適的候選內(nèi)參基因,為開(kāi)展芒功能基因表達(dá)奠定了一定的基礎(chǔ)。

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