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    引起生姜塊莖腐爛病原菌的分離與鑒定

    2021-01-18 05:23:42張莞苓薛雅蓉郭雨左廣勝劉常宏
    山東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020年12期
    關(guān)鍵詞:塊莖生姜無菌

    張莞苓,薛雅蓉,郭雨,左廣勝,劉常宏

    (1.南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江蘇南京 210023;2.北京中龍創(chuàng)科技有限公司,北京 100071)

    生姜(Zingiber officinale Roscoe)是姜科姜屬多年生草本植物,也是重要的藥食兩用經(jīng)濟(jì)類蔬菜作物,在亞洲、非洲、南美洲等地區(qū)都有栽培。我國是生姜主產(chǎn)國之一[1],主產(chǎn)區(qū)在山東、河南、四川等省[2],是種植區(qū)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的支柱作物,且具有很高的出口創(chuàng)匯價值。生姜塊莖腐爛等病害的連年發(fā)生嚴(yán)重影響了生姜的產(chǎn)量和品質(zhì),造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2-4]。分離并鑒定引起生姜塊莖腐爛的病原菌并有針對性的防治,是控制該病發(fā)生的根本方法。

    已報道的引起生姜塊莖腐爛的病原菌主要有青枯雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)[5]、歐文氏菌(Erwinia spp.)[6]、短 小芽 孢桿 菌 (Bacillus pumilus)[7]、群 結(jié) 腐 霉 菌 (Pythium myriotylum)[8,9]和 尖 孢 鐮 刀 菌 (Fusarium oxysporum)[10,11]。由于地理環(huán)境及氣候差異,這些病原菌在各地的分布不盡相同,并且還可能存在尚未發(fā)現(xiàn)的新病原菌。

    山東為我國生姜種植面積最大的省份,2019年種植面積10.15萬公頃,占北方生姜種植總面積(11.39萬公頃)近90%,超過全國生姜種植總面積(28.43萬公頃)的 1/3[12],在我國生姜種植產(chǎn)業(yè)和生姜產(chǎn)品供應(yīng)體系中有著舉足輕重的地位和作用。為了解引起山東省濰坊市生姜種植區(qū)生姜塊莖腐爛的原因,本試驗從濰坊市多地生姜種植田采集腐爛塊莖,進(jìn)行病原菌的分離與鑒定。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    腐爛生姜塊莖:于2017年8月(生姜大培土期)采自山東省濰坊市青州朱家埠村(QZ)、安丘凌河鎮(zhèn)馬家河崖頭村(AQ)、昌邑北孟鎮(zhèn)上坡村(CY)、昌樂紅河鎮(zhèn)王家埠村(CL)生姜栽培區(qū)發(fā)病地塊(發(fā)病率超過60%),生姜莖葉嚴(yán)重失綠黃化、根莖腐爛。

    細(xì)菌分離培養(yǎng)基:LB瓊脂培養(yǎng)基。

    真菌分離培養(yǎng)基:含0.5 mg/mL的硫酸鏈霉素和氯霉素的PDA培養(yǎng)基。

    1.2 病原菌的分離

    清洗發(fā)病生姜;75%乙醇消毒30 s,無菌水沖洗3次;3%的次氯酸鈉消毒15 min,無菌水沖洗3次;滅菌濾紙吸干表面水分。用無菌刀片將病健交界處組織切成0.5 cm ×0.5 cm ×0.1 cm大小,分別放于固體 LB(37℃,24 h)和 PDA(28℃,5 d)培養(yǎng)基上培養(yǎng),待菌落長出后進(jìn)行純化,并對純培養(yǎng)物進(jìn)行常規(guī)保種。

    1.3 病原菌的鑒定

    根據(jù)菌落及菌絲形態(tài)觀察,結(jié)合基于細(xì)菌16SrDNA(引物:27F/1492R)和真菌 ITS(引物:ITS1/ITS4)的特異性 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測序結(jié)果[8],確定引起生姜塊莖腐爛的病原菌分類地位。

    1.4 接種體的制備

    細(xì)菌菌懸液的制備:挑取純化細(xì)菌單菌落,接種至LB液體培養(yǎng)基,37℃、150 r/min培養(yǎng)24 h;4 000 r/min離心5 min收集細(xì)菌,用PBS緩沖液重懸并調(diào)菌懸液濃度至3×108cfu/mL,用于致病性接種試驗。

    真菌菌餅的制備:挑取少量菌絲于PDA平板上,置于28℃恒溫箱黑暗培養(yǎng)5 d,沿菌落邊緣用直徑為5 mm的滅菌打孔器打取菌餅。

    真菌孢子懸液的制備:參照黃福新等[13]的方法。將真菌接種在PDA培養(yǎng)基上,25℃黑暗培養(yǎng)10 d;在超凈工作臺內(nèi)將菌絲刮入無菌水中,攪拌后用無菌紗布過濾除去菌絲;濾液用無菌水調(diào)孢子懸液濃度為1×105個/mL。

    1.5 致病性試驗

    按照1.2的方法消毒健康生姜塊莖表面,然后將其橫切成厚度約1 cm的姜片;向其表面涂布細(xì)菌菌懸液(以涂布無菌水為對照)或接種真菌菌餅(以接種PDA固體培養(yǎng)基為對照);將涂布有細(xì)菌和無菌水的姜片置37℃黑暗培養(yǎng)48 h,將接種真菌菌餅和PDA固體培養(yǎng)基的姜塊置30℃封閉保濕培養(yǎng)5 d。肉眼觀察生姜塊莖的腐爛情況,檢測所接種細(xì)菌或真菌對生姜塊莖組織的致病性。進(jìn)一步分離鑒定腐爛塊莖組織中的病原菌,檢查其與原接種菌的一致性。

    1.6 盆栽試驗

    按照1∶10(V/W)的比例,將病原細(xì)菌菌懸液或病原真菌孢子懸液混入滅菌營養(yǎng)土中,同時設(shè)置接種等體積的無菌水為對照,攪拌均勻后裝入花盆中,播種1塊健康生姜塊莖,每處理共5盆,于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),觀察生姜生長及發(fā)病情況。56 d后刨出生姜塊莖,用無菌水沖洗干凈,觀察生姜塊莖腐爛情況,并統(tǒng)計生姜植株葉片數(shù)、株高、莖圍、莖葉鮮重與塊莖鮮重。

    1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

    采用Graphpad Prsism 6軟件進(jìn)行Duncan’s檢驗(P<0.05);采用Mega 10構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 引起生姜塊莖腐爛病原菌的分離與鑒定

    根據(jù)菌落形態(tài)和基因序列分析,從20個腐爛塊莖中共分離獲得10株細(xì)菌和3株真菌(表1)。

    利用生姜塊莖切片接種技術(shù),評估了分離獲得的細(xì)菌和真菌菌株引起健康生姜塊莖腐爛的能力,發(fā)現(xiàn)只有2株細(xì)菌(E4,E17)和1株真菌(F01)能夠引起健康生姜塊莖組織病變(表1,圖1),分別占總細(xì)菌種類的20.0%和總真菌種類的33.3%。從發(fā)病組織中能夠重新分離獲得相同的病原菌,因此,E4、E17和F01鑒定為引起生姜塊莖腐爛的病原菌,并且在山東濰坊市的青州(QZ)、安丘(AQ)、昌邑(CY)和昌樂(CL)等地來源的腐爛生姜塊莖中普遍存在(表1)。

    E4菌株在LB培養(yǎng)基上的菌落呈圓形,乳白色,表面光滑,不透明,邊緣整齊,有黏性(圖2A)。顯微鏡觀察顯示,E4菌株呈短桿狀,大?。?.3~1.5)μm ×(0.7~0.9)μm,兩端鈍圓,中生芽孢,無鞭毛和莢膜、革蘭氏陽性(圖2B)。16SrRNA基因序列相似性分析(表1)及系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)顯示,E4菌株與短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)親緣關(guān)系最近。綜合形態(tài)學(xué)和基因序列分析,鑒定E4菌株為短小芽孢桿菌。

    表1 病姜塊中分離到的病原菌、分布及侵染性

    圖1 病原菌(E4、E17、F01)引起生姜塊莖腐爛癥狀

    圖2 E4菌株的菌落和菌體形態(tài)

    圖3 E4菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

    E17菌株LB培養(yǎng)基上的菌落呈圓形,表面光滑,濕潤有黏性,邊緣整齊,產(chǎn)生可擴(kuò)散的水溶性綠色色素(圖4A)。菌體革蘭氏染色呈陰性,桿狀,兩端鈍圓(圖4B)。16S rRNA基因序列相似性(表1)和系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5)分析表明,E17菌株與銅綠假單胞桿菌(Pseudomonas aeruginosa)親緣關(guān)系最近。綜合形態(tài)學(xué)和基因序列分析,鑒定E17菌株為銅綠假單胞桿菌。

    圖4 E17菌株的菌落和菌體形態(tài)

    圖5 E17菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

    F01菌株在PDA培養(yǎng)基上生長良好,氣生菌絲為白色絮狀或絨毛狀;培養(yǎng)初期,菌落為白色,中間以輻射狀出現(xiàn)淡紫紅色,背面產(chǎn)生深紫紅色色素;菌株氣生菌絲茂盛,菌絲濃密,質(zhì)地厚實(圖6A);大型分生孢子呈鐮刀形,兩端漸尖,基細(xì)胞足狀,多數(shù)3個分隔,少數(shù)4~7個分隔,大小為(20.5~56.7)μm ×(3.0~6.3)μm(圖6B);分生孢子梗呈瓶頸狀,小型分生孢子較多,呈卵形或橢圓形,0~1個分隔,大小為(5.2~16.8)μm ×(2.1~5.0)μm;厚垣孢子間生或頂生,球形或橢圓形,壁光滑(圖6C)。ITS序列相似性分析(表1)和系統(tǒng)發(fā)育樹(圖7)表明,F(xiàn)01菌株與尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)的親緣關(guān)系最近。

    圖6 F01菌株的菌落特征及孢子形態(tài)

    2.2 盆栽試驗結(jié)果

    盆栽試驗結(jié)果表明,接種病原菌E4、E17和F01菌株56 d后,生姜長勢極差(圖8A)。刨出生姜塊莖后發(fā)現(xiàn),3種病原菌均可致生姜塊莖100%發(fā)生褐變,以接種E17菌株引起的褐變最為嚴(yán)重(圖8B)。該結(jié)果進(jìn)一步表明E4、E17和F01菌株均為引起生姜塊莖腐爛的病原菌。

    由表2可知,E4、E17和F01菌株侵染后,生姜的葉片數(shù)、株高、莖圍、莖葉鮮重和塊莖鮮重均顯著低于對照,但不同病原菌對生姜生長的危害程度差異不顯著(P >0.05)。

    表2 不同病原菌對生姜生長的影響

    圖7 F01菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

    圖8 不同病原菌對生姜塊莖及植株生長的影響

    3 討論與結(jié)論

    通過對山東省濰坊市多地生姜腐爛塊莖中病原菌的分離、鑒定及致病性評價,共獲得10株細(xì)菌3株真菌,其中,2株細(xì)菌(短小芽孢桿菌E4和銅綠假單胞桿菌E17)和1株真菌(尖孢鐮刀菌F01)為引起生姜塊莖腐爛的病原菌。

    已有報道顯示,短小芽孢桿菌和尖孢鐮刀菌為引起萊蕪區(qū)生姜塊莖腐爛的病原菌[7,10]。本研究發(fā)現(xiàn),該兩種病原菌在濰坊生姜種植區(qū)也普遍存在,表明短小芽孢桿菌和尖孢鐮刀菌可能是導(dǎo)致生姜塊莖腐爛的重要病原菌。

    銅綠假單胞桿菌在自然界分布廣泛,是土壤常見細(xì)菌之一,可引起黃瓜細(xì)菌性白枯病[14]和煙草細(xì)菌性葉斑?。?5]等病害。迄今未見其作為引起生姜塊莖腐爛病原菌的報道。本次從生姜腐爛塊莖內(nèi)分離到該菌,姜塊組織及盆栽試驗均顯示其能夠引起生姜塊莖腐爛,植株生長受阻,是一種新的生姜塊莖腐爛致病菌。該研究結(jié)果對于研發(fā)針對銅綠假單胞桿菌的新型殺菌劑或優(yōu)化原有登記農(nóng)藥配方和使用技術(shù)[16,17],確保生姜健康栽培有重要的參考價值。

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