榆黃蘑不同生長發(fā)育期胞外酶活性變化研究*

雷 萍，吳亞召，張文雋，馬婧嘉，賈 靜，馬 瑩

（1.陜西省微生物研究所，陜西 西安 710043；2.陜西崇德生物技術(shù)發(fā)展有限公司，陜西 高陵 710200）

榆黃蘑（Pleurotus citrinipileatus Sing.）隸屬于擔(dān)子菌綱 （Basidiomycetes） 傘菌目 （Agaricales） 側(cè)耳科（Pleurotaceae） 側(cè)耳屬（Pleurotus），又名金頂側(cè)耳、金頂蘑等[1]。榆黃蘑味道鮮美、香味濃郁、營養(yǎng)豐富，其干品子實(shí)體含粗蛋白41.5%、粗脂肪3.8%、粗纖維 8.4%，總氨基酸 28.65%，人體必需的8種氨基酸含量豐富，也含有Fe、Zn、Se、P、K等微量元素，是高蛋白、低脂肪的綠色保健食品[2]。榆黃蘑藥用價(jià)值極高，具有抗氧化、抗腫瘤、抗疲勞、降血脂、保肝護(hù)肝等藥理功能[3-4]。

20世紀(jì)70年代我國開始進(jìn)行榆黃蘑人工栽培試驗(yàn)，近年來栽培面積不斷擴(kuò)大，在全國范圍內(nèi)已形成一定的規(guī)模。榆黃蘑栽培原料主要為闊葉樹木屑或農(nóng)作物秸稈，生長發(fā)育過程中需要將培養(yǎng)基中的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等大分子物質(zhì)分解成小分子物質(zhì)，以供菌絲吸收利用[5]。而對這些大分子物質(zhì)進(jìn)行降解轉(zhuǎn)化的是菌絲分泌的各種胞外酶，主要包括纖維素酶、半纖維素酶、淀粉酶等。研究不同生長階段胞外酶的分泌特點(diǎn)、活性大小以及動態(tài)變化趨勢，可推測出生產(chǎn)發(fā)育過程中不同階段培養(yǎng)基中木質(zhì)纖維素、淀粉等營養(yǎng)成分的降解動態(tài)，從而為選擇優(yōu)良菌株、優(yōu)化栽培培養(yǎng)基和栽培管理?xiàng)l件提供一定的試驗(yàn)依據(jù)[6]。以棉籽殼、木屑為主要栽培培養(yǎng)料，對榆黃蘑栽培過程不同生長期分泌的7種胞外酶活性進(jìn)行測定，以了解其胞外酶變化規(guī)律，推測不同發(fā)育階段的營養(yǎng)生理需求，為榆黃蘑高產(chǎn)菌種選育和人工高產(chǎn)栽培提供科學(xué)、系統(tǒng)的理論數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

榆黃蘑1號、榆黃蘑SW06、榆黃蘑29號，均為陜西省微生物研究所微生物資源中心保藏菌種。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 母種培養(yǎng)基

馬鈴薯250 g（去皮、煮汁）、葡萄糖20 g、蛋白胨5 g，KH2PO41.0 g、MgSO40.5 g，酵母膏 2.0 g，VB110.0 mg，瓊脂20 g，水1 000 mL，pH自然。

1.2.2 栽培培養(yǎng)基

棉籽殼75%、木屑13%、麩皮10%、蔗糖1%、石膏1%，含水量60%～65%。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種培養(yǎng)及栽培

按上述栽培培養(yǎng)基制備菌袋，選用17 cm×33 cm×0.005 cm聚乙烯塑料袋裝料，每袋裝干料580 g，高壓滅菌后冷卻至室溫；分別接入榆黃蘑1號、榆黃蘑SW06、榆黃蘑29號菌種，恒溫25℃遮光培養(yǎng)；菌絲長滿菌袋后進(jìn)行常規(guī)出菇管理，出兩潮菇后采收。

1.3.2 粗酶液的制備

在菌絲培養(yǎng)和栽培過程中，分別于菌絲生長至菌袋1/2、菌絲滿袋、現(xiàn)蕾、幼菇期、一潮菇子實(shí)體成熟、二潮菇現(xiàn)蕾、二潮菇幼菇期、二潮菇子實(shí)體成熟和二潮菇采收1周共9個階段取樣。取培養(yǎng)基上、中、下部位的培養(yǎng)料20 g，混勻后加入100 mL蒸餾水，20℃浸提4 h后過濾，4 000 r·min-1離心5 min，取上清液即為粗酶液[7]。

1.3.3 酶活性的測定

分別按參考文獻(xiàn) [8-12]測定7種胞外酶活性，濾紙纖維素酶（FP） 60 min內(nèi)催化底物生成1 mg葡萄糖所需的酶量為1個活力單位；羧甲基纖維素酶（CMC）、β-葡萄糖苷酶、淀粉酶30 min內(nèi)催化底物生成1 mg葡萄糖所需的酶量為1個活力單位；半纖維素酶（HC）30 min內(nèi)催化底物生成1 mg木糖所需的酶量為1個活力單位；漆酶（LAC）、過氧化物酶1 min使OD值改變0.01所需的酶量為1個活力單位。

2 結(jié)果與分析

以編號1～9表示菌絲生長的各個階段（1為菌絲生長至菌袋1/2；2為菌絲滿袋；3為現(xiàn)蕾；4為幼菇期；5為一潮菇子實(shí)體成熟；6為二潮菇現(xiàn)蕾；7為二潮菇幼菇期；8為二潮菇子實(shí)體成熟；9為二潮菇采收），檢測7種胞外酶各階段活性。

2.1 榆黃蘑不同生長期濾紙纖維素酶活性的變化

3株榆黃蘑不同生長階段濾紙纖維素酶活性變化情況見圖1。

從圖1可以看出，3株榆黃蘑菌種栽培過程中培養(yǎng)基中均能測出濾紙纖維素酶活性，酶活性變化趨勢基本一致；但不同菌株同一生長階段的酶活性有一定差異，榆黃29號產(chǎn)生的濾紙纖維素酶活性最大。在菌絲生長初期濾紙纖維素酶活性均較低，隨著菌絲生長、原基形成和子實(shí)體生長，在幼菇期酶活性達(dá)到了最大，分別為15.42 U、16.52 U和17.48 U；幼菇期后濾紙纖維素酶活性逐漸降低，在二潮菇現(xiàn)蕾期活性達(dá)到最低，之后酶活性又開始上升，在二潮菇幼菇期達(dá)到較大，分別為10.19 U、13.09 U和14.87 U；二潮菇幼菇期后又逐漸下降，至二潮菇采后1周時(shí)降至最低，分別為3.94 U、5.13 U和6.01 U。

2.2 榆黃蘑不同生長期羧甲基纖維素酶活性的變化

3株榆黃蘑不同生長階段羧甲基纖維素酶活性變化情況見圖2。

從圖2可以看出，3株榆黃蘑菌種在整個生長發(fā)育過程中羧甲基纖維素酶活性變化規(guī)律基本一致，在菌絲生長和原基形成階段酶活性均較低，增長緩慢；原基形成后至幼菇期酶活迅速達(dá)到最大值，榆黃蘑1號、榆黃蘑SW06、榆黃蘑29號分別達(dá)到22.04 U、25.18 U和27.32 U；隨著子實(shí)體成熟和采收，至二潮菇現(xiàn)蕾期羧甲基纖維素酶活性又迅速降至較低，分別為10.14 U、10.88 U和12.41 U；二潮菇現(xiàn)蕾期后酶活又有逐漸升高，在二潮菇幼菇期達(dá)到了1個小高峰，隨后酶活性下降，至采收后1周時(shí)降至最低，分別為7.99 U、10.16 U和11.45 U。其中以榆黃蘑29號在栽培過程中產(chǎn)生的羧甲基纖維素酶酶活性最大。

2.3 榆黃蘑不同生長期β-葡萄糖苷酶活性的變化

3株榆黃蘑不同生長階段β-葡萄糖苷酶活性變化情況見圖3。

從圖3可以看出，3株榆黃蘑菌種在栽培過程中β-葡萄糖苷酶活性變化規(guī)律基本一致，但不同菌株同一生長階段的酶活性存在一定差異，其中榆黃蘑29號產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶活性相對較高。在菌絲生長期間3株菌的酶活性均較低，隨著菌絲生長、原基形成和幼菇生長酶活性緩慢上升，幼菇期后酶活性又緩慢降低，一潮菇子實(shí)體成熟期達(dá)到1個較低值；之后，緩慢上升至二潮菇現(xiàn)蕾時(shí)酶活又達(dá)到相對較高，分別為7.13 U、10.42 U和11.97 U；隨后酶活逐漸下降，直至采收結(jié)束酶活性降至最低。β-葡萄糖苷酶在整個栽培過程中沒有出現(xiàn)明顯的活性高峰和階段性變化。

2.4 榆黃蘑不同生長期淀粉酶活性的變化

3株榆黃蘑不同生長階段淀粉酶活性變化情況見圖4。

從圖4可以看出，3株榆黃蘑菌種在栽培過程中淀粉酶活性變化趨勢基本一致，但不同菌株同一生長階段的酶活性存在一定差異，其中榆黃蘑SW06產(chǎn)生的淀粉酶活性相對較高。在菌絲生長初期3株菌的淀粉酶活性均較低，隨著菌絲生長和原基形成對淀粉類物質(zhì)的分解利用，淀粉酶活性逐漸升高，在幼菇期淀粉類酶活力達(dá)到最大，分別為32.26 U、36.91 U和35.12 U；之后，酶活性隨著栽培時(shí)間的延長逐漸下降，在采收結(jié)束1周時(shí)測定的酶活性降至最低，分別為1.68 U、2.93 U和2.02 U。

2.5 榆黃蘑不同生長期半纖維素酶活性的變化

3株榆黃蘑不同生長階段半纖維素酶活性變化情況見圖5。

從圖5可以看出，3株榆黃蘑菌種在栽培過程中半纖維素酶活性變化規(guī)律基本一致，在菌絲生長階段半纖維素酶活性均較低，且增長緩慢；隨著菌絲滿袋和原基形成，培養(yǎng)基中半纖維素酶大量產(chǎn)生，其酶活性快速上升，至一潮菇幼菇期酶活力達(dá)到高峰，分別為39.65 U、43.42 U和46.33 U；在幼菇期后酶活性迅速降低，二潮菇原基形成時(shí)降至較低，之后又緩慢升高，在二潮菇幼菇期又達(dá)到1個小高峰，以后逐漸下降，在采收后1周時(shí)酶活性均將至最低，分別為6.34 U、9.17 U和10.54 U。3株菌整個栽培過程中以榆黃蘑29號產(chǎn)生的半纖維素酶活性最高。

2.6 榆黃蘑不同生長期漆酶活性變化

3株榆黃蘑不同生長階段漆酶活性變化情況見圖6。

從圖6可以看出，3株榆黃蘑菌種在整個栽培過程中漆酶活性變化規(guī)律基本一致，隨著栽培時(shí)間的延長漆酶活性總體趨勢呈逐漸下降。3株菌在菌絲生長至菌袋1/2時(shí)測得的酶活性均較高，分別為30.92 U、34.65 U和33.34 U，隨著菌絲和子實(shí)體生長發(fā)育，培養(yǎng)基中的漆酶活力逐漸下降，至二潮菇成熟采收后1周酶活性均降至最低，分別為2.34 U、4.19U和3.54U。其中以榆黃蘑SW06產(chǎn)生的漆酶活性相對最高，其次是榆黃蘑29號。

2.7 榆黃蘑不同生長期過氧化物酶活性的變化

3株榆黃蘑不同生長階過氧化物酶活性變化情況見圖7。

從圖7可以看出，3株榆黃蘑菌種在整個栽培過程中，榆黃蘑SW06和榆黃蘑29號的過氧化物酶活性變化規(guī)律基本一致，在菌絲生長至菌袋1/2至滿袋期間，酶活性緩慢上升至一個小高峰，分別為26.96 U和28.16 U；之后一直呈下降趨勢，在幼菇期酶活降至較低，幼菇期至二潮菇現(xiàn)蕾期雖然有緩慢上升，但升高趨勢不大，二潮菇現(xiàn)蕾期后酶活性迅速下降，至子實(shí)體采收后1周后培養(yǎng)基中的酶活性降至最低，分別為3.62 U和4.85 U；榆黃蘑1號的過氧化物酶活性在菌絲生長期、一潮菇現(xiàn)蕾期和幼菇期一直呈緩慢下降，在幼菇期降至較低峰后又緩慢升高，但升高不明顯，之后一直緩慢下降至最低2.01 U。3株榆黃蘑菌種栽培過程中以榆黃蘑29號分泌的過氧化物酶活性相對最高。

3 討論

測定了3株榆黃蘑菌種不同生長發(fā)育階段培養(yǎng)基濾紙纖維素酶、羧甲基纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、淀粉酶、半纖維素酶、漆酶、過氧化物酶的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這7種胞外酶活性在整個栽培過程中處于動態(tài)變化，且不同菌株的酶活性變化有一定的差別。

3株榆黃蘑菌種的濾紙纖維素酶、羧甲基纖維素酶、β-葡萄糖苷酶和半纖維素酶活性在菌絲生長和子實(shí)體形成期都呈上升趨勢，至一潮菇幼菇期酶活性都維持在較高水平，主要是用來分解利用基質(zhì)中的纖維素類、半纖維素類大分子物質(zhì)，滿足子實(shí)體生長發(fā)育的營養(yǎng)需求；子實(shí)體生長發(fā)育期碳源營養(yǎng)積累充足，酶活性開始下降，至二潮菇生長發(fā)育時(shí)積累的營養(yǎng)物質(zhì)被消耗，為繼續(xù)分解利用培養(yǎng)基質(zhì)中纖維素和木質(zhì)素以滿足子實(shí)體生長需求，此時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生纖維素類物質(zhì)水解酶，酶活性又開始呈上升趨勢，隨著子實(shí)體成熟采收，酶活性迅速下降。

淀粉酶是分解利用淀粉類物質(zhì)的酶類，為轉(zhuǎn)化吸收淀粉類物質(zhì)，3株榆黃蘑菌種誘導(dǎo)產(chǎn)生了大量的淀粉酶，且栽培過程中淀粉酶活性的變化規(guī)律基本一致。栽培前期酶活持續(xù)上升，在幼菇期時(shí)達(dá)到最大，此后培養(yǎng)基中的淀粉類物質(zhì)被消耗，直至采收結(jié)束1周后酶活性降至最低。因此，在栽培培養(yǎng)基內(nèi)添加適量淀粉類物質(zhì)有助于提高菌絲活力，可為菌絲生長和子實(shí)體發(fā)育提供充足的營養(yǎng)，促進(jìn)子實(shí)體產(chǎn)量的提高。

漆酶和過氧化物酶是參與水解木質(zhì)素的酶類，培養(yǎng)基中的木質(zhì)素被分解作為主要碳源供榆黃蘑生長發(fā)育。本研究表明，3株榆黃蘑栽培過程中漆酶、多酚氧化酶活性變化規(guī)律基本一致，菌絲生長初期木質(zhì)素降解酶活性均較高，此時(shí)對基質(zhì)內(nèi)的木質(zhì)素降解利用較快，隨著栽培時(shí)間的延長基質(zhì)內(nèi)的木質(zhì)素逐漸減少，之后酶活性一直緩慢下降，直至栽培結(jié)束酶活性達(dá)到最低。