基于CRISPR/Cas9技術(shù)的煙草煙堿相關(guān)基因敲除及功能研究

馮吉 程玲 蔡長春 孫光偉 孫敬國 楊錦鵬 李建平 陳振國

摘要：CRISPR/Cas9是一種重要的基因組定向編輯技術(shù)，近年來在植物基因組的定向敲除和分子育種材料創(chuàng)制中得到了廣泛應用。為了發(fā)掘可用于分子育種的低煙堿煙草，以烤煙品種K326為試驗材料，利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)對控制煙草煙堿合成和轉(zhuǎn)運的5個基因（PMT1、QPT、A0622、MNUP1和、JA47）進行定向敲除，并對T2代純合基因型煙草植株進行煙堿含量檢測。結(jié)果表明，定向敲除5個基因后獲得100株成功編輯的1T0代煙草植株，突變檢出率為299%，突變類型以單堿基插入或刪除為主。對定向敲除煙堿合成基因P72和轉(zhuǎn)運基因JAT1的T1代純合基因型煙草植株進行序列分析，發(fā)現(xiàn)存在4種突變類型，分別是插入一個T、C、A堿基的插入突變和一個缺失44個堿基的缺失突變，從而引發(fā)移碼使得翻譯的氨基酸鏈大幅縮短，其T2代植株上部葉煙堿含量顯著低于野生型植株。綜上所述，CRISPR/Cas9技術(shù)能夠高效定向敲除煙堿關(guān)鍵基因，為低煙堿煙草分子育種提供了理論和技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞：基因;編輯技術(shù);突變;煙堿

基因組編輯技術(shù)是近年在基因組水平上進行精確修飾的一種技術(shù)，該技術(shù)可對基因進行定向敲除、敲入、多位點同時突變和小片段的缺失等。與傳統(tǒng)的誘變育種相比，通過該技術(shù)獲得的遺傳修飾生物材料與自然界長期進化形成的各類天然多態(tài)性個體相比不存在本質(zhì)區(qū)別，且精確性更高、周期更短，最終達到的效果等同于天然誘變、人工誘變和傳統(tǒng)雜交導入基因片段。目前美國政府已于2012年批準了首個基因組定向修飾獲得的植物材料作為常規(guī)品種進行田間評價。

CRISPR/Caso（clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats/crispr-associated nuclease 9，Cas）基因組編輯技術(shù)是第3代基因編輯技術(shù)101]，是通過RNA介導由Cas9蛋白實現(xiàn)對目標基因的編輯。因CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)具有設計簡便、成本低、編輯效率高、特異性強等諸多優(yōu)點，已在大量物種中得到了廣泛應用171。CRISPR/Cas9技術(shù)在煙草研究領(lǐng)域上也有較多應用，2015年高軍平等2首次在普通煙草中建立了CRISPR/Cas9技術(shù)體系，并對煙草MPDS和NPDR6基因?qū)崿F(xiàn)了定點突變。

謝小東等2利用CRISPR/Cas9技術(shù)獲得MPIN4（個腋芽生長相關(guān)基因）的煙草突變體，并通過表型驗證證實了該基因功能。姚恒等2采用CRISPR/Cas9技術(shù)定向敲除煙草Ntppo1基因，并利用實時熒光定量PCR進行驗證，結(jié)果顯示T2突變體中MPO1表達水平比對照顯著下降。謝小東等針對煙草5個基因構(gòu)建了多靶點敲除系統(tǒng)，結(jié)果表明CRISPR/Cas9多基因編輯系統(tǒng)可進行有效突變煙草是一種傳統(tǒng)的模式植物和重要的經(jīng)濟作物，煙堿含量是影響其經(jīng)濟價值的重要指標之-2因此，本研究采用CRISPR/Cast9基因組編輯技術(shù)，對5個控制煙堿含量基因（PMT1、OPT1、A622、NNUP1和.AT，其中PMT、QPT1及A622酶是煙堿合成途徑中的重要酶;NNUP1和JAT1則是煙堿轉(zhuǎn)運相關(guān)的蛋白2）進行定向敲除研究，并對所獲敲除成功的材料進行基因功能研究，為發(fā)掘可用于煙草分子育種的煙草材料和煙草功能基因組學研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗材料和種植地點

本研究選用烤煙品種K326為試驗材料。K326無菌苗培養(yǎng)于湖北省煙草科學研究院的組織培養(yǎng)室;K326轉(zhuǎn)化植株種植在利川烤煙基地和海南三亞冬繁基地。

表達載體：pORE-Cas9/gRNA，由西南大學提供。主要的試劑：2xpower Tag PCR Mastermix和植物DNA提取試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司;大腸桿菌DH5q感受態(tài)細胞、農(nóng)桿菌GV3101、限制性內(nèi)切酶BsaI、DNAMarker、T4連接酶、頭孢和卡那霉素購自北京博邁德基因技術(shù)有限公司;引物由北京天一輝遠生物科技有限公司合成;PCR產(chǎn)物測序由武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司完成。主要儀器：PCR儀，akaraTP600（日本）;凝膠自動成像儀，MS-UVCI（美國）;核酸蛋白測定儀，伯樂smartspecplus（美國）。

1.2試驗方法

1.2.1SGRNA（（singleguideRNA）設計利用中國煙草基因組數(shù)據(jù)庫中PMT（AFI26810）、QP77（AJ748262）、A622（ABO71165）、NTNUP1（GU174267）和、JAT1（AM991692）基因的cDNA和genomicDNA序列，通過在線工具CRISPR Multitargeter（http：//www.multicrisprnet/index.html）501設計了15個CRISPR/Cas9敲除的SGRNA寡聚核苷酸序列（表1）。

1.2.2基因敲除靶位點的cDNA引物設計根據(jù)

15個SGRNA序列（表1），設計了15對可擴增SGRNA序列的CDNA片段引物對（表2）。設計要求：引物的合成不需要PAM區(qū)（NGG）;不是以G開始的要加G;序列的反向互補;之后分別在上游引物和下游引物的開頭添加GAT和AAAC序列（可與BsaI酶切表達載體形成的粘性末端互補）。

1.2.3載體構(gòu)建以設計好的靶位點序列作為正向引物，其反向互補序列作為反向引物，與經(jīng)Bsal酶切pORE-Cas9SGRNA表達載體形成的黏性末端互補。靶位點序列通過T4連接酶連接到表達載體上后，將DH5a感受態(tài)細胞加入連接產(chǎn)物中，使連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5q感受態(tài)細胞中。最后挑取單克隆作為模板，以載體上的引物JC-F（5TTAGGTTTACCCGCCAATA3）和靶位點的下游引物（表2）PCR擴增和驗證。PCR反應程序為：94℃10min;94C40s，53C40s，72C30s，30個循環(huán);72℃10min;4℃下保存。

1.2.4農(nóng)桿菌介導的煙草葉盤轉(zhuǎn)化和愈傷組織的篩選利用電轉(zhuǎn)法將重組編輯載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101。在超凈工作臺中將煙草無菌苗的成熟葉片切成1.0cm2左右的葉盤，然后將葉盤浸泡在攜帶質(zhì)粒的農(nóng)桿菌GV3101菌液中。農(nóng)杄菌侵染10min后，以葉盤上表面平鋪于MS固體培養(yǎng)基上，放入28℃培養(yǎng)箱中黑暗條件下共培養(yǎng)48h。然后再將葉盤上表面平鋪于愈傷分化培養(yǎng)基上，在12h光照/12h黑暗條件組培室內(nèi)培養(yǎng)，約1個月后可以看到葉盤邊緣出現(xiàn)白色或綠色膨大的愈傷組織。待愈傷組織長出綠芽后，切下綠芽（1～2cm高）并轉(zhuǎn)入MS固體培養(yǎng)基生根，1個月后可移栽到土里2121.2.5煙草陽性苗檢測和目標基因檢測煙草陽性苗的檢測：采取CTAB法提取煙草葉片總DNAP。根據(jù)載體中所包含的抗卡那霉素基因為目標開發(fā)出特異引物對NPTI（左引物5CGTTGTCACTGAAGCGGGAAGG3;右引物5GAGCGGCGATACCGTAAAGCAC3）。以煙草株系葉片的基因組DNA為模板，PCR擴增含有靶位點的片段，PCR擴增產(chǎn)物均用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測分析確定是否為陽性苗。

目標基因檢測：利用Primer5.0軟件在目標基因的目標區(qū)域設計引物。以煙草葉片的基因組DNA為模板，PCR擴增目標區(qū)域的序列片段，PCR擴增產(chǎn)物送測序，分析目標基因是否被基因編輯成功。

煙草煙堿檢測和數(shù)據(jù)分析：將烤后煙樣取3份，每份15～20片，送湖北省煙草科學研究院進行煙堿含量檢測。煙堿含量檢測采用氣相色譜法進行檢測。

1.3數(shù)據(jù)分析

所有試驗數(shù)據(jù)均通過Microsoft Ofiice Excel2010和SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析，多重比較采用Duncan法。

2結(jié)果

2.1陽性克隆檢測

通過載體構(gòu)建，總共獲得15個載體。對經(jīng)過卡那霉素篩選的15個單菌落進行菌落PCR檢測驗證，所用引物為JC-F和15個SGRNA的反向序列（表2）。如圖1所示，得到預期450bp左右大小的整齊清晰的目標帶型，結(jié)果表明重組CRISPR/Cas9載體質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101菌株內(nèi)，可用于下一步遺傳轉(zhuǎn)化試驗。

2.2煙草T0代陽性苗的種植和檢測

在組織培養(yǎng)實驗室，待幼苗長至3-5片葉時，進行取樣提取煙草基因組DNA，以特異引物對NPTⅡ（目標基因為抗卡那霉素基因）進行PCR擴增，檢測部分結(jié)果如圖2。結(jié)果顯示，1205株煙草再生植株中（包含所有15個轉(zhuǎn)化載體）有751株是T0代陽性苗，每個載體獲得轉(zhuǎn)化陽性苗有30-70株不等，陽性率達到62%，說明轉(zhuǎn)化試驗成功率較高。2016年5月中上旬將751株中的460株T0代陽性轉(zhuǎn)化苗（包含所有15個轉(zhuǎn)化載體）從組織培養(yǎng)實驗室移栽到利川烤煙基地。最終在烤煙基地只有334株1T0代煙草陽性植株存活（PMT基因：116株;OP7l基因：44株;A62基因：67株;MNUP1基因：59株;JAT基因：48株），存活率為72.6%（表3）。

對存活的34株煙草陽性植株（包含所有1個轉(zhuǎn)化載體）進行取樣，然后通過PCR和測序技術(shù)對目標基因進行檢測（表4），獲得100株成功編輯（即目標基因發(fā)生突變）的T0代煙草植株，突變檢出率為299%（100334）。對于PMT1、A622和JA基因，3個靶位點中只有1個靶位點檢測到成功編輯的植株（PMT基因：51.7%，0，0;A622基因：0，0，609%;JAT1基因：96%，0，0），這可能發(fā)生了脫靶現(xiàn)象或是檢測的樣本數(shù)量不夠多。對于QPT2和MNUP1基因，3個靶位點都檢測到成功編輯的植株，但同一個基因不同靶位點間的突變檢出率卻有巨大的差異（QPT71基因：5%，667%，583%;MNUP基因：92%，43.5%，27.3%）。同時測序結(jié)果分析還顯示（表5），5個基因在靶位點處發(fā)生了多種形式的突變，包括在不同位點處的單堿基插入或刪除、多堿基替換和大片段缺失（10堿基以上）。PMT和QPT兩個基因的堿基突變類型主要以單堿基插入或刪除為主（占總突變類型的50%以上），其次是多堿基替換。A62和NTNUPI兩個基因的堿基突變類型主要以多堿基替換為主（占總突變類型的50%以上），其次是単堿基插入或刪除。T基因的堿基突變類型主要以單堿基插入或刪除為主（占總突變類型的70%以上），其次是大片段缺失（10堿基以上），最少的是多堿基替換。

對成功編輯的100株T0代煙草植株目標基因序列進行分析，發(fā)現(xiàn)基因靶位點SGRNA-PAM之后的序列出現(xiàn)雙峰，說明Cas9蛋白在切斷靶位點序列后，每條DNA修復的情況不一樣，導致成功編輯的100株T0代煙草植株中突變型和野生型基因序列同時存在，即為嵌合體或雜合型植株。因此將這成功編輯的100株T0代煙草植株經(jīng)自交后產(chǎn)生T1代煙草種子，用于下一步的純合型突變體篩選。

2.3煙草T1代植株種植和檢測

2016年10月中上旬從100份T1代種子中選取6份在海南三亞基地冬繁（只包含OP7基因靶位點2的突變植株和AT基因靶位點1的突變植株，每個基因3份材料），每個T1代株系種植20個單株，總共120株。最終在海南三亞基地只有99株T1代煙草植株存活（QPTl基因，40株;JA77基因：59株），存活率為82.5%。通過PCR擴增和測序，對99株T1代煙草植株的目標基因進行檢測分析，其中55株成功編輯（OPT基因13株;JAT7基因42株），突變檢出率為55.6%。55株T1代煙草植株中，純合基因型有15株（QP7基因5株;T基因10株）;雜合基因型有40株（OPT基因8株;JHAT基因32株）。

對15株純合基因型T1代煙草植株的測序結(jié)果進行分析（圖3），結(jié)果顯示，QPT基因在靶位點處發(fā)生了2種類型的突變（圖3A，基因檢測引物對：左引物5I'GCAATTACAGCTTCCAAGGT.3';右引物5GCGCGAATCTGGATAGTTG3），一種是單堿基的插入（突變體Q1;插入一個T堿基），一種是單堿基的插入以及單堿基替換（突變體Q2;插入一個C堿基，T堿基替換為G堿基）。JAT1基因在靶位點處發(fā)生了2種類型的突變（圖3C，基因檢測引物對：左引物5GACAAGACAAGCCAACAAG3';右引物5AACACTGTGACCGCTACCAT3”），一種是單堿基的插入（突變體J1;插入一個A堿基），一種是44個堿基的缺失（突變體J2）。對這4種突變株系的編碼蛋白氨基酸序列進行預測比對分析（圖3B和D），由于插入單個堿基或44個堿基的缺失，引發(fā)移碼致使提前遇到終止密碼子，使得翻譯的氨基酸鏈大幅縮短。因此，將這4種純合基因型T1代煙草植株自交收種，獲得T2代煙草種子用于功能驗證試驗。

2.4煙草T2代植株基因功能驗證

2017年5月中上句將這4種純合基因型T2代煙草植株（Q1，Q2，J1和J2）種植在利川烤煙基地，每個株系種植120個單株，以進行功能驗證。結(jié)果顯示（圖4），正常生長條件下，這4種純合基因型T2代煙草植株與野生型植株表型上無顯著性差異。但通過檢測上部烤后煙葉煙堿發(fā)現(xiàn)，突變體Q1與Q2，或J1與J2上部煙葉煙堿含量相比較未達到顯著性差異;而突變體Q1和Q2與J1和J2相比較，Q1和Q2上部煙葉煙堿含量顯著低于J和J2;同時突變體Q1，Q2，J和J2上部煙葉煙堿含量顯著低于野生型植株上部煙葉煙堿含量。該結(jié)果表明利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)創(chuàng)制的OPT突變體和JA7突變體是成功的，煙堿合成基因OP77和煙堿轉(zhuǎn)運基因AT能夠顯著影響煙葉中煙堿的積累。

3討論

自從2013年CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)首次應用于真核生物以后，已在各植物研究中進行了廣泛的應用。2015年高軍平等2首次在普通煙草中建立了CRISPR/Cas9技術(shù)體系，隨后該技術(shù)在煙草各種性狀研究中進行了探索和應用。本研究直接將該技術(shù)應用于煙草煙堿研究中并最終獲得4種低煙堿純合基因型2代煙草植株，該研究結(jié)果有助于煙草煙堿硏究和低煙堿分子育種的深入開展。

利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)，對控制煙草煙堿合成和轉(zhuǎn)運的5個基因進行基因編輯，獲得100株成功編輯的煙草T0代植株，其中突變類型為單堿基插入或刪除所占比例最大（50%以上），與之前研究結(jié)果基本一致29-30。對于PMT1、A622和J基因，發(fā)現(xiàn)有2個靶位點未檢測到成功編輯的植株，可能發(fā)生了脫靶現(xiàn)象。造成脫靶現(xiàn)象的主要因素可能是SGRNA引起的錯配或PAM序列引起的錯配導致了脫靶，因此通過提高SORNA的特異性、改造Cas9蛋白或者降低Cas9和SGRNA在植物中的表達水平可以有效降低脫靶現(xiàn)象的發(fā)生51-3。然而在植物研究中脫靶并不是一個特別關(guān)注的問題，因為脫靶造成的其他基因序列的突變微不足道，其突變純合或雜合后代也沒發(fā)現(xiàn)進一步突變產(chǎn)生。而且即使發(fā)生了非特異性的定點突變，也可通過回交的方法將非特異性的定點突變進行回復2。對于OPT2和MNUP1基因，發(fā)現(xiàn)同一個基因不同靶位點間的突變檢出率有巨大的差異，可能是SGRNA序列中靠近PAM區(qū)的第8至12個堿基之間的差異性對Cas9蛋白剪切精確性的影響造成的。還可能是一個靶位點在正向鏈上而另一個是在互補鏈上造成的2，比如QP7基因靶位點1在正向鏈上，靶位點3在互補鏈上，它們之間的突變檢出率相差有10倍多。

通過檢測野生型和4種純合基因型T2代煙草植株烘烤后上部煙葉煙堿含量，發(fā)現(xiàn)突變體J和J2與Q1和Q2相比較，J和J2上部煙葉煙堿含量顯著高于Q1和Q2?？赡苁且驗闊焿A轉(zhuǎn)運蛋白JAT1與NTMATE1/2之間有部分功能相似度2，當突變體J1和J2中.MATl基因功能喪失后NTMATE1/2基因可替代其部分功能;也可能是煙堿合成基因OP7的功能對煙葉煙堿的影響大于煙堿轉(zhuǎn)運基因JAT12。同時突變體Q1，Q2，J1和J2上部煙葉煙堿顯著低于野生型植株相應部位煙葉煙堿，說明單個煙堿合成基因和煙堿轉(zhuǎn)運基因功能喪失后能夠顯著影響煙葉煙堿的積累。由于本研究中普通栽培煙草是異源四倍體，在進化史上經(jīng)歷過多倍化的過程，絕大部分基因都有多個拷貝9733，因此單獨敲除一個煙堿合成基因或煙堿轉(zhuǎn)運基因后，可能會由其他拷貝基因在功能上互補，造成突變體煙草植株煙堿含量顯著降低但不會降低到趨近為零;所以在后續(xù)煙草煙堿研究中，還需要利用CRISPR/Cast9介導煙草多基因編輯技術(shù)，創(chuàng)制出多基因突變體，才能更全面地研究煙草煙堿相關(guān)基因功能。

4結(jié)論

本研究利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)對控制煙草煙堿合成和轉(zhuǎn)運的5個基因進行了定向敲除，最終成功獲得4種低煙堿純合基因型T2代煙草植株并進行了功能研究。結(jié)果表明利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)創(chuàng)制的OP7突變體和T突變體的上部煙葉煙堿含量顯著降低，且煙堿合成基因QPT對煙堿的影響大于煙堿轉(zhuǎn)運基因JT，該結(jié)果為后續(xù)低煙堿煙草分子育種奠定了材料基礎(chǔ)。雖然本研究中CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)展示出簡單、高效的優(yōu)勢，但該技術(shù)的脫靶問題和多拷貝基因靶位點設計問題目前尚未得到徹底解決。因此在未來的研究中應對CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)進行相應改進，使該技術(shù)具有更為廣闊的應用前景。

參考文獻

[1]王維佳，李萌鑫.基因編輯技術(shù)在農(nóng)業(yè)育種中的應用.安徽農(nóng)業(yè)科學，2020，48（3）：18-25

[2]王艷芳，蘇婉玉，曹紹玉，等，新型基因編輯技術(shù)發(fā)展及在植物育種中的應用[J].西北農(nóng)業(yè)學報，2018，27（5）：617-625

[3]時歡，林玉玲，賴鐘雄，等.CRISPR/Cas9介導的植物基因編輯技術(shù)研究進展[J].應用與環(huán)境生物學報，2018，24（3）：640-650

[4]楊炳忻.香山科學會議第491-495次學術(shù)討論會簡述中國基礎(chǔ)科學，2014

[5]王福軍，趙開軍.基因組編輯技術(shù)應用于作物遺傳改良的進展與

挑戰(zhàn)[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2018，51（1）：1-16

[6]沈平，章秋艷，楊立桃，等.基因組編輯技術(shù)及其安全管理[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2017，50（8）：1361-1369

[7]景潤春，盧洪CRISPR/Case9基因組定向編輯技術(shù)的發(fā)展與在作

物遺傳育種中的應用.中國農(nóng)業(yè)科學，2016，49（7）：1219-129

[8]解莉楠，宋鳳艷，張旸.CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物基因組定點編輯中的研究進展.中國農(nóng)業(yè)科學，2015，48（9）：169-1677

[9]韓紅兵，謝卡斌，曹罡，等，基因編輯技術(shù)在農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源上的應用.中國工程科學，2018，20（6）：82-86

[10] CONG L， RAN F A， COX D， et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems [J]. Science， 2013， 339： 819-823

[11]JIANG W Y， BIKARD D， COX D， et al. Rna-guided editing bacterial genomes using CRISPR-CAS system]. Nature Biotechnology， 2013， 31： 233-239

[12] PICKAR-OLIVER A， GERSBACH C A. The next generation CRISPR-CAS technologies and applications [J]. Nature Reviews Molecular Cell Biology， 2019， 20（8）： 490-507

[13] BHAYA D， DAVISON M， BARRANGOU R CRISPR-CAS systems bacteria and archaea： versatile small RNAS for adaptive defenseand regulation [J]. Annual Review of Genetics， 2011： 45： 273-297

[14] WIEDENHEFT B， STERNBERG SH， DOUDNA J A. Rna-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea [J]. Nature， 2012482：331-338

[15] SHEN B， ZHANG J， WU H Y， et al. Generation of gene-modified mice via Caso/Rna-mediated gene targeting [J]. Cell Research， 201323（5）：720-723

[16] HSU P D， SCOTT D A， WEINSTEIN J A， et al. DNA targeting specificity of Rna-guided as9 nucleases J]. Nature Biotechnology，2013，31（9）：827-832

[17] SHI JW， WANG E， MILAZZO J P， et al. Discovery of cancer drug targets by CRISPR-CAS screening of protein domains [J]. Nature Biotechnology， 2015， 33（6）： 661-667

[18] LI J F， NORVILLE J E， AACH J， et al. Multiplex and homologous recombination -mediated genome editing in Arabidopsis and Nicotiana benthamiana using guide RNA and Cas9 [J]. Nature Biotechnology， 2013， 31： 688-691

[19] GIFFORD C A， RANADE S S， SAMARAKOON R， et al Oligogenic inheritance of a human heart disease involving a genetimodifier[J]. Science，2019，364（6443）：865-870

[20] GAO J P， WANG G H， MA S Y， et al. CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Nicotiana tabacu[M]. Plant Molecular Biology，2015，87：99-110

[21] XIE X， QIN G， SI P， et al. Analysis of Nicotiana tabacum PIN genes identifies NIP/N4 as a key regulator of axillary bud growth Physiologia Plantarum， 2017， 160（2）： 222-239

[22]姚恒，白戈，謝賀，等，利用CRISPR-Cas9技術(shù)創(chuàng)制煙草Vtabmxc2基因的定點突變.分子植物育種，2017，15（6）：2328-2334.

[23]謝小東，高軍平，李澤鋒，等.CRISPR（Cas9介導煙草多基因編輯體系的應用.中國煙草學報，2019，25（4）：72-80

[24]王威威，席飛虎，楊少峰，等.煙草煙堿合成代謝調(diào)控研究進展.亞熱帯農(nóng)業(yè)研究，2016，12（1）：62-67

[25]張洪博.煙草重要基因篇：3.煙草煙堿合成代謝相關(guān)基因[J].中國煙草科學，2014，35（3）：117-120

[26]金云峰，李軍營，張建波，等.煙草煙堿代謝的生化和分子機制及其調(diào)控.基因組學與應用生物學，2015，34（4）：882-891

[27]張曉穎煙草側(cè)分生組織形成相關(guān)基因（lasb，rev）的基因編輯及功能研究[D]重慶：西南大學，2018.

[28]李宗平，覃光炯，陳茂勝，等.不同栽培方式對白肋煙煙堿轉(zhuǎn)化率及TSNA含量的影響[J].中國煙草科學，2015，36（60）：62-67

[29] JINEK M， CHYLINSKI K， FONFARA I， et al. A programmable dual-rna-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial Immunity{[J]. Science，2012，337（60960）：816-821

[30] MA X L， ZHANG Q Y， ZHU Q L， et al. A robust CRISPR/Cas9 system for convenient， high-efficiency multiplex genome editing inmonocot and dicot plants [J]. Molecular Plant， 2015， 8（8）： 1274-1284

[31]BI TSAI S Q， ZHENG Z， NGUYEN N T， et al. GUIDE-SEQ enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-CASnucleases J]. Nature Biotechnology， 2015， 33（2）： 187-197

[32] LABUHN M， ADAMS FF， NG M， et al. Refined SGRNA efficac prediction improves large- and small-scale CRISPR-CAS9applications [J]. Nucleic Acids Research， 2018， 46（3）： 1375-1385

[33] SHEN B， ZHANG W S， ZHANG J， et al. Efficient genome modification by CRISPR-CAS9 nickase with minimal off-targeteffects[J]. Nature Methods， 2014， 11（4）： 399-402

[34] PATTANAYAK V， LIN S， GUILINGER J P， et al. High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals Rna-programmee Cas9 nuclease specificity J）. Nature Biotechnology， 2013， 31（9）839-843

[35] FENG Z Y， MAO Y F， XU N F， et al. Multigeneration analysis reveals the inheritance， specificity， and patterns of Crisprcas-induced gene modifications in Arabidopsis [J]. Proc Nat.Acad.Scl.USA，2014，111（12）：4632-4637

[36] CONG L， RAN F A， COX D， et al. Multiplex genome engineerin using CRISPR/Cas systems J]. Science， 2013， 339（6121）： 819-823

[37]仁剛，蔡劉體，任學良.煙屬起源與分子系統(tǒng)進化的研究進展

貴州農(nóng)業(yè)科學，2011，39（1）：1-8

[38]楊垚，張艷，黨江波，等.以子房為材料制備煙草染色體標本的方法.中國煙草科學，2019，40（4）：56-61