煙草種子內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性分析

謝紅煉 汪漢成 史彩華 周浩 孫美麗

摘要：種子內(nèi)生菌對(duì)種子的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要作用。為深入了解煙草種子內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性，以IIS區(qū)的rDNA為靶標(biāo)序列，采用Illumina Miseq測(cè)序技術(shù)對(duì)K326、云煙85和云煙87煙草種子內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)組成和多樣性進(jìn)行測(cè)定分析。結(jié)果表明，3個(gè)品種煙草種子共獲得342264條序列，聚類到110個(gè)分類操作單元（OTU），分別屬于5個(gè)門、13個(gè)綱24個(gè)目、34個(gè)科、56個(gè)屬。品種K326和云煙85種子內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)相似，多樣性均高于云煙87。其中赤霉菌屬Gibberella小畫線殼屬M(fèi)onographella、鏈格孢菌屬Alternaria、鐮刀菌屬Fusarium、紅酵母菌屬Rhodotorula、炭疽菌屬Colletotrichum、隱球菌屬Cryptococcus和曲霉菌屬Aspergillus等在煙草種子中豐度較高。FUNGULD功能預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，煙草種子內(nèi)生真菌包括以下功能菌群：植物病原菌、動(dòng)物病原菌、內(nèi)生菌、木材腐生菌、地衣寄生菌、土壤腐生菌、木材腐生菌等。煙草種子有豐富的內(nèi)生真菌定殖，其中潛在的有益功能菌群包括鐮刀菌、炭疽菌、隱球酵母菌、赤霉菌、曲霉菌等。

關(guān)鍵詞：煙草種子;內(nèi)生真菌;高通量測(cè)序;群落結(jié)構(gòu)

植物內(nèi)生菌是存在于根、莖、葉及種子等器官組織內(nèi)部和細(xì)胞間隙，對(duì)寄主植物沒有明顯致病性的一類微生物。植物內(nèi)生菌寄生在寄主植物體內(nèi)，經(jīng)過長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化，與寄主植物形成了互利共生的關(guān)系。植物內(nèi)生菌能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高植物抗病、抗逆、抗重金屬的能力。同時(shí)，植物內(nèi)生菌能分泌抗生素或者具有蛋白質(zhì)溶解活性的次生代謝產(chǎn)物，與病原菌競(jìng)爭(zhēng)生態(tài)位和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，有利于寄主植物健康生長(zhǎng)，且具有重要的生防意義。

種子內(nèi)生菌可以提高種子萌發(fā)率，并能通過生長(zhǎng)繁殖傳播給子代植株，影響子代植株中菌群的定殖。譚仲夏等報(bào)道了云南煙草種子內(nèi)部攜帶的真菌有鏈格孢菌（Alternaria alternata）、鐮刀菌（Fusairium spp.）、腐霉（Pythium spp.）、芽枝孢菌（Cladosporium spp，）等真菌，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)區(qū)的煙草種子所帶的內(nèi)生真菌種類差異不大，鏈格孢菌占比較高。以上研究均采用分離培養(yǎng)的方法，前人研究表明，純培養(yǎng)獲得的生物種類數(shù)量只占非培養(yǎng)檢測(cè)微生物總數(shù)的0.190～109%，而內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（IIS）擴(kuò)增子測(cè)序可真實(shí)反應(yīng)真菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性，目前已用于醫(yī)藥、工業(yè)、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域的微生物相關(guān)研究1214。本研究以云煙85、云煙87和K326煙草種子為材料，采用llumina測(cè)序技術(shù)對(duì)煙草種子內(nèi)生真菌進(jìn)行IS擴(kuò)增子測(cè)序，全面研究煙草種子內(nèi)生真菌群落組成與多樣性，為今后煙草種子內(nèi)真生菌的功能研究和利用提供理論參考。

1材料與方法

1.1煙草種子

本研究所采用的煙草種子共3個(gè)品種，其中，云煙85和K326裸種于2016年采自貴州煙草科學(xué)研究院福泉實(shí)驗(yàn)基地田間，未經(jīng)洗滌;云煙87裸種于2016年采自貴州煙草科學(xué)研究院福泉實(shí)驗(yàn)基地田間，經(jīng)水洗后置于陰涼處晾干，所有種子均保藏于貴州省煙草科學(xué)研究院-80℃低溫冰箱。用流動(dòng)的自來水沖洗種子表面附屬物和泥土。每個(gè)品種的種子分別稱取10g，依次用75%酒精和2%6NACIO溶液消毒30s和2min，再用無菌水漂洗3次。將最后一次的種子漂洗液涂布于PDA平板上，平板置于28℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗培養(yǎng)，以檢測(cè)種子表面是否消毒完全，每個(gè)品種3次重復(fù)。3個(gè)品種種子樣品編號(hào)分別為K326-1、K326-2、K326-3;Y85-1、Y85-2、Y85-3：Y87-1、Y87-2、Y87-3。

1.2煙草種子總DNA的提取

分別稱取上述處理過的每個(gè)品種種子樣品5g，轉(zhuǎn)移至無菌研缽進(jìn)行研磨，根據(jù)E.ZN.A.R）SoilDNAKit試劑盒操作說明書提取種子樣品總DNA，樣品總DNA純度和濃度利用Nanodrop2000檢測(cè)，其A260/A280檢測(cè)值在1.82.0之間。

1.3煙草種子IS文庫(kù)構(gòu)建及高通量測(cè)序

以上述樣品的總DNA為模板，利用真菌引物ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3）ITS2R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3）對(duì)樣品基因組DNA ITS1-IS2區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用AxyprepDNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物利用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的片段大小，采用Quantifluor-ST藍(lán)色熒光定量?jī)x進(jìn)行檢測(cè)定量。檢測(cè)合格后送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行l(wèi)umina高通量測(cè)序。

1.4測(cè)序數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)過濾掉reads尾部質(zhì)量值低于20bp的堿基，再過濾掉質(zhì)控后低于50bp的reads;根據(jù)PE序列之間的重疊關(guān)系，使用Fash4（https：//ccb.hu.edu/software/flashindex.html）對(duì)序列進(jìn)行拼接，其中，重疊的部分需大于10bp，重疊區(qū)錯(cuò)配比需小于0.2，并調(diào)整系列方向得到優(yōu)化序列。

利用Search軟件平臺(tái)（version7.0hpdrivecom/search，）在上述優(yōu)化序列中提取非重復(fù)序列并去除單序列，按照97%6的相似性對(duì)非重復(fù)序列進(jìn)行OTU聚類并去除嵌合體。利用RDPclassifier（hp：rpcme.msu.）貝葉斯算法對(duì)OU序列進(jìn)行分類學(xué)分析，并比對(duì)Unie數(shù)據(jù)庫(kù)（Release7.2hts：/unite.ut.ee/index.php），其比對(duì)值需高于70%。KAmothur（https：/mothur.org/wiki/calculators軟件計(jì)算α多樣性指數(shù)，以Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)分析煙草種子內(nèi)生真菌群落的多樣性，以Sobs指數(shù)分析煙草種子內(nèi)生真菌群落的豐富度;利用R語(yǔ)言工具統(tǒng)計(jì)并繪制各分類水平的群落結(jié)構(gòu)圖，分析樣品微生物群落結(jié)構(gòu);并利用R語(yǔ)言工具繪制群落熱圖和PCA分析圖進(jìn)行β多樣性分析;比對(duì)FUNGUILD數(shù)據(jù)庫(kù)，分析煙草種子內(nèi)生真菌功能類群。數(shù)據(jù)分析均在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司I-Sanger生信云平臺(tái)上（htp：/wwi-sanger.com/project/index.huml）完成，以上方法與分析部分均參考文獻(xiàn)[15]。

2結(jié)果

2.1測(cè)測(cè)序深度及OTU分析

隨著序列數(shù)量增加，稀釋曲線逐漸趨于平緩當(dāng)序列數(shù)達(dá)到3000時(shí)，稀釋曲線基本飽和（圖1），表明測(cè)序結(jié)果可以反映煙草種子內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)。9個(gè)樣品共得到342264條序列和90937409個(gè)堿基，其中，樣品K326得到119061條序列和29951225個(gè)堿基;云煙85得到108113條序列和27181204個(gè)堿基;云煙87得到115090條序列和33804980個(gè)堿基，所有序列的長(zhǎng)度均在202～343bp之間每個(gè)品種種子的內(nèi)生真菌在各分類水平的數(shù)量不同，其中樣品K326中的數(shù)量最多，其次是云煙85，云煙87最少（表1）。3個(gè)品種煙草種子共有的內(nèi)生真菌包括19個(gè)屬和24個(gè)OTU（圖2）。

2.2內(nèi)生真菌群落Alpha多樣性分析

根據(jù)生真菌群落alpha多樣性指數(shù)（表2）可知，3個(gè)樣品的覆蓋率（coverage）均大于99.8%，表明測(cè)序數(shù)據(jù)基本覆蓋了3個(gè)煙草樣品中所有真菌的生物信息。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)結(jié)果顯示，云煙87的內(nèi)生真菌群落多樣性顯著低于其他兩個(gè)品種（Simpson指數(shù)越大，微生物群落多樣性越低）。3個(gè)煙草種子的內(nèi)生真菌群落豐富度指數(shù)（Sobs、Ace、Chao指數(shù)）大小依次為：K326》云煙85》云煙87。但Ace和Chao指數(shù)表明不存在顯著性差異。

2.3內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)與組成

對(duì)所有OU序列進(jìn)行分類，結(jié)果表明煙草種子內(nèi)生真菌主要分布于子囊菌門Ascomycota和擔(dān)子菌門Basidiomycota。K326、云煙85、云煙87子囊菌門的內(nèi)生真菌分別占95.16%6、8897%6和98.13%，擔(dān)子菌門的內(nèi)生真菌分別占3.07%、1.83%和0049%（圖3）。

從屬的水平進(jìn)行分析，K326與云煙85種子內(nèi)生真菌群落間的差異較小，而這兩個(gè)品種與云煙87相比存在顯著差異。圖4所顯示為豐度大于001%的菌屬，其中，K326種子赤霉菌屬Gibberella占44.83%，鏈格孢菌屬Alternaria占39.44%，鐮刀菌屬Fusariun占465%，隱球菌屬Cryptococcus占2.32%，炭菌屬Colletotrichum占1.19%，小畫線殼屬M(fèi)onographellaI占0.53%，紅酵母屬Rhodotorula占0.55%;云煙85種子中赤霉菌屬占43.66%，小畫線売屬占26.17%，鏈格孢菌屬占10.41%，鐮刀菌屬占6.739%，紅酵母屬占1.07%，炭疽菌屬占0.46%，隱球菌屬占0.36%6;云煙87種子中曲霉菌屬Aspergllus占95.69%，赤霉菌屬占0.18%，鏈格孢菌屬占091%，鐮刀菌屬占0.11%，隱球菌屬占0.03%，小畫線売屬占0.441%，紅酵母屬占0.019%6。

同時(shí)，在3個(gè)煙草（K326、云煙85、云煙87）種子中核盤菌科的真菌分別占3.139%、0.06%和0.71%種水平Circs圖（圖5）表明，3個(gè)品種種子在種水平豐度較高的菌種包含帚狀曲霉菌Aspergillus penicillioides、錯(cuò)綜赤霉菌Gibberella africans、Monographella cucumerina、玉米赤霉菌

Gibbberella zeae、淺藍(lán)灰曲霉菌Aspergillus caesiellus、大隱球酵母菌Cryptococcus magnus、亮白曲霉菌Aspergillus candidius、桑帕約氏酵母菌Rhodotorula vanillic。其中，Aspergillus cibarius僅存在于云煙85和云煙87種子中。

2.4內(nèi)生真菌群落Beta多樣性分析

圖6顯示，PC1和PC2對(duì)樣品群落的貢獻(xiàn)率分別為87.88%和9.81%，是煙草種子內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)的主要影響因素，且PC1的影響明顯大于PC2。3個(gè)品種的樣品斑點(diǎn)彼此分開，內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)存在一定的差異性。在PC1的作用下，云煙87種子樣品斑點(diǎn)與其他品種斑點(diǎn)拉開距離，PC1是云煙87種子內(nèi)生真菌群落的主要影響因素，在PC2的作用下，K326和云煙85種子樣品斑點(diǎn)間拉開距離，PC2是形成K326和云煙85種子內(nèi)生真菌群落差異性的主要因素。

從屬水平對(duì)3個(gè)品種的煙草種子內(nèi)生真菌豐度進(jìn)行排序，分別選取前30個(gè)屬繪制群落熱圖（圖7），熱圖上方的樣本聚類樹顯示，每個(gè)品種的3個(gè)樣品單獨(dú)聚為一個(gè)分支，表明測(cè)序結(jié)果具有代表性，能夠真實(shí)地反應(yīng)各樣品的群落結(jié)構(gòu)與多樣性。品種K326和云煙85種子樣品聚為一個(gè)大分支，品種云煙87種子樣品再與之類聚，表明K326和云煙85煙草種子內(nèi)生真菌群落較為相似。

2.5內(nèi)生真菌FUNGUILD功能預(yù)測(cè)

為了解煙草種子內(nèi)生真菌群落功能，通過比對(duì)FUNGUID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)3個(gè)品種煙草種子內(nèi)生真菌進(jìn)行功能預(yù)測(cè)（圖8）。結(jié)果表明，3個(gè)品種的煙草種子內(nèi)生真菌的OTU分屬于腐生營(yíng)養(yǎng)型（Saprotroph）病理營(yíng)養(yǎng)型（Pathotroph）、病理-腐生營(yíng)養(yǎng)型（Pathotroph-Saprotroph）、病理-共生營(yíng)養(yǎng)型（Pathotroph-Symbiotroph）、腐生-共生營(yíng)養(yǎng)型（Saprotroph-Symbiotroph）、病理-腐生-共生營(yíng)養(yǎng)型（Pathotroph-Saprotroph-Symbiotroph）。其中，云煙87種子內(nèi)生真菌的功能群與其他兩個(gè)品種存在顯著差異，K326和云煙85種子內(nèi)生真菌的功能群較為相似。云煙87種子內(nèi)生真菌主要是未經(jīng)定義的腐生菌群（93.819%～96.98%）;K326種子內(nèi)生真菌主要為植物病原菌（44899%～52.03%）、動(dòng)物病原菌-內(nèi)生菌植物病原菌-木材腐生菌（36.91%～42.45%）、動(dòng)物病原菌-內(nèi)生菌-地衣寄生菌-植物病原菌-土壤腐生菌-木材腐生菌（3.82%5.26%）、寄生真菌-未經(jīng)定義的腐生菌（1.449%～3.87%6）、內(nèi)生菌-植物病原菌1.15%～1.86%6）等類群;云煙85種子內(nèi)生真菌主要為植物病原菌（5900%079.37%6）、動(dòng)物病原菌-內(nèi)生菌植物病原菌-木材浮生菌（5.97%6～14.00%）、動(dòng)物病原菌-內(nèi)生菌地衣寄生菌-植物病原菌-土壤腐生菌-木材腐生菌（5.64%～9.71%）、動(dòng)物內(nèi)生共生菌-動(dòng)物病原菌-內(nèi)生菌-植物病原菌-未經(jīng)定義的腐生菌（0.3102.12）等類群。

3討論

高通量測(cè)序硏究煙草種子內(nèi)生真菌的可行性近年來，人們對(duì)種子攜帶微生物種類及其功能越來越重視。利用高通量測(cè)序技術(shù)研究種子內(nèi)生真菌可以克服分離培養(yǎng)的生物信息量低的局限性，保證了內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)的完整性。本研究利用Ilumina高通量測(cè)序技術(shù)研究3個(gè)品種煙草種子內(nèi)生真菌，共獲得了S1-IS2區(qū)342264條有效序列和110個(gè)OTU，分布于56個(gè)真菌屬，表明了煙草種子有豐富的內(nèi)生真菌定殖，也證實(shí)了Illumina高通量測(cè)序技術(shù)研究煙草種子內(nèi)生真菌的可行性。

3.2不同煙草品種種子內(nèi)生真菌群落差異

3個(gè)品種煙草種子內(nèi)生真菌主要分布于赤霉菌屬、曲霉菌屬、鏈格孢屬、隱球菌屬、紅酵母屬、炭疽菌屬、鐮刀菌屬、小畫線売菌屬以及未經(jīng)分類的核盤菌科，前人研究結(jié)果表明，這些真菌存在于各類種子中61，表明煙草種子與其他種子定殖的內(nèi)生真菌種類具有相似性。已有研究表明，土壤生存環(huán)境、寄主植物基因型以及種子質(zhì)量均會(huì)對(duì)寄主植物種子微生物群落造成影響啊。Alpha多樣性及群落結(jié)構(gòu)結(jié)果顯示，K326和云煙85種子內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性相似，與云煙87存在差異性。云煙85和云煙87均以K326為父本、以貴煙2號(hào)為母本雜交而來，K326、云煙85和云煙87均抗黑脛病、根結(jié)線蟲病等，但對(duì)赤星病的抗病能力有差異，K326為赤星病高感品種，云煙85和云煙87為赤星病中感和低感品種192。由屬水平群落組成豐度圖所示，K326種子中的鏈格孢菌明顯高于云煙85和云煙87，這可能與其對(duì)赤星病的抗病性相關(guān)。

3.3煙草種子潛在有益生真菌

據(jù)內(nèi)生菌相關(guān)研究表明，在植物內(nèi)生菌中，鐮刀屬菌株對(duì)植株有明顯的促生作用，使寄主體內(nèi)的重金屬Cd+、As+、Pb+含量顯著下降2，對(duì)種子萌發(fā)具有促進(jìn)作用2;炭疽屬菌株對(duì)青病菌、黃瓜角斑病菌、番茄瘡痂病菌等多種病原菌具有抑制作用，且具有良好的抗氧化作用2;內(nèi)生膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides代謝產(chǎn)物具有顯著的磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）抑制活性2;曲霉屬和赤霉屬內(nèi)生菌株也存在一定抑菌活性2。本研究3個(gè)品種的煙草種子也存在上述真菌屬真菌，表明煙草種子內(nèi)生真菌存在潛在的生防菌資源。本研究中的帚狀曲霉菌可產(chǎn)生專性嗜鹽青霉a淀粉酶2;大隱球酵母菌的代謝產(chǎn)物甘草酸苷可用于提取單葡萄糖醛酸甘草次酸（GAMG）P2;亮白曲霉菌可產(chǎn)生乳糖酶，乳糖酶可用于生產(chǎn)低乳糖乳制品2，還可用于黃酮類化合物的生物合成2;淺藍(lán)灰曲霉菌可產(chǎn)生纖維素酶、木聚糖酶、錳過氧化物酶（MnP）和酯酶。帚狀曲霉菌、大隱球酵母菌、亮白曲霉菌和淺藍(lán)灰曲霉菌在煙草種子中的功能還有待進(jìn)一步的研究證明。

3.4煙草種子內(nèi)生真菌群落功能

FUNGUILD功能預(yù)測(cè)結(jié)果表明，3個(gè)品種煙草種子內(nèi)生菌大部分都被定義為植物病原菌、動(dòng)物病原菌-內(nèi)生菌-植物病原菌-木材腐生菌和未分類的腐生菌等類群，病原菌與腐生菌類群豐度較高表明了較多病原菌和腐生菌寄生于煙草種子內(nèi)，當(dāng)種子離開植株后可能在適當(dāng)?shù)臈l件下使種子產(chǎn)生腐敗或霉變。這也證實(shí)了許多植物病原菌能夠以內(nèi)生菌的營(yíng)養(yǎng)方式在植物體內(nèi)生長(zhǎng)，但不會(huì)引起寄主出現(xiàn)病害癥狀，在一定條件下可以轉(zhuǎn)變?yōu)椤安≡?，由此產(chǎn)生病害或腐敗l-。鏈格孢屬中的Literaria alternata會(huì)引起煙草赤星病，在本研究中，鏈格孢菌的豐度較高，內(nèi)生的鏈格孢菌在煙草種子中是否在種子萌芽期轉(zhuǎn)變?yōu)椴≡鷤鞑ソo子代還有待深入研究。但是在使用FUNGUILD來解析煙草種子內(nèi)生真菌功能群時(shí)，觀察到一些真菌功能解析不完全。例如Monog hella cucumerina僅被界定為病原菌，Aspergillus candidus僅被界定為腐生菌，但Monographella cucumerina和Aspergillus candidus也被報(bào)道為植物內(nèi)生菌53，這表明FUNGUID數(shù)據(jù)庫(kù)有待補(bǔ)充完善。

4結(jié)論

本研究通過高通量測(cè)序明確了3個(gè)品種煙草種子內(nèi)生真菌的種類，主要分布于赤霉菌屬、曲霉菌屬、鏈格孢屬、隱球菌屬、紅酵母屬、炭疽菌屬、鐮刀菌屬、小畫線殼菌屬。煙草種子內(nèi)生真菌豐度可能與品種抗性相關(guān)。煙草種子中還存在著許多功能菌群，潛在的益生菌包括：鐮刀菌、炭菌、隱球酵母菌、赤霉菌、曲霉菌等，可為今后在煙草種子內(nèi)生真菌中篩選生防菌提供參考。對(duì)于種子內(nèi)生真菌中的益生菌資源挖掘有待在今后的研究中陸續(xù)開展。

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