雨生紅球藻對菲律賓蛤仔肥滿度和多酚氧化酶的影響

李翔宇 吳琳 竇勇 黃瑩 翟勝利 周文禮

摘??? 要：為研究飼料中添加雨生紅球藻對菲律賓蛤仔生長特性的影響，根據(jù)餌料中雨生紅球藻與螺旋藻的比例設(shè)置5個(gè)梯度處理，分別為1∶9，3∶7，5∶5，7∶3，9∶1，投喂菲律賓蛤仔兩周，監(jiān)測各處理菲律賓蛤仔的肥滿度及肝臟中多酚氧化酶（PPO）活性。結(jié)果表明，雨生紅球藻與螺旋藻為5∶5的處理菲律賓蛤仔肥滿度顯著高于其他處理（P<0.05），而9∶1的處理顯著低于其他處理（P< 0.05）;雨生紅球藻與螺旋藻為5∶5的處理菲律賓蛤仔PPO活性最高，其次是7：3的處理，二者顯著高于1∶9的處理（P<0.05）。綜合而言，菲律賓蛤仔的餌料中添加適量雨生紅球藻粉有助于其生長及免疫性能提高，餌料中其與螺旋藻的比例5∶5為宜。

關(guān)鍵詞：菲律賓蛤仔;雨生紅球藻;肥滿度;多酚氧化酶

中圖分類號：S963.22?????? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A????? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2021.12.005

Effects of Haematococcus Pluvialis on Plumpness and Polyphenol Oxidase of Philippine Clam

LI Xiangyu1， WU Lin1， DOU Yong1， HUANG Ying1， ZHAI Shengli1， ZHOU Wenli1

（1.Tianjin Key Laboratory for Aquaculture Ecdogy and Cultivation Fisheries College，Tianjin? Agricultural University， Tianjin 300384， China;2.Tianjin Modern Chenhui Technology Group，Tianjin 301802，China）

Abstract： In order to study the effects of Haematococcus pluvialis on the growth characteristics of Philippine clam， the experiment set 5 gradient treatments basing on the proportion of Haematococcus pluvialis and Spirulina in the diet， which included 1∶9， 3∶7， 5∶5， 7∶3， and 9∶1. The Philippine clam was fed with the different treatment diets for two weeks， the plumpness and polyphenol oxidase （PPO） activity in liver of Philippine clam were monitored. The results showed that the clam's plumpness was significant higher than the other treatments when the ratio of Haematococcus pluvialis to Spirulina was 5∶5（P<0.05）， and the Philippine clam's plumpness was significant lower than the other treatments when the ratio of Haematococcus pluvialis to Spirulina was 9∶1 （P<0.05）. The PPO activity of Philippine clam were highest when the ratio of Haematococcus pluvialis to Spirulina was 5∶5， followed by the treatment of 7∶3， which the two treatments were significantly higher than the other treatment（P<0.05）.? In conclusion， adding appropriate amount of Haematococcus pluvialis in the diet of Philippine clam could approve the growth and specific immunity of Philippine clam， which the optimum ratio of Haematococcus pluvialis to Spirulina in the diet should be 5∶5.

Key words： Ruditapes philippinarum;Haematococcus pluviali;Plumpness;polyphenol oxidase

收稿日期：2021-08-04

基金項(xiàng)目：天津市企業(yè)科技特派員項(xiàng)目（20YDTPJC01470）; 天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目（TJAE201805）;自然資源部海洋生態(tài)動力學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目（MED202013）;天津市寶坻區(qū)農(nóng)業(yè)科技計(jì)劃重大項(xiàng)目（201810）;天津市科技局生態(tài)環(huán)境治理重大專項(xiàng)（18ZXSZSF00080）; 天津市農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化與推廣項(xiàng)目（202001010）

作者簡介：李翔宇（1996—），男，山西大同人，在讀碩士生，主要從事生物餌料開發(fā)與應(yīng)用方面研究。

通訊作者簡介：竇勇（1985—），男，山東淄博人，講師，博士，主要從事微藻生理生態(tài)方面研究。

菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）屬于軟體動物門雙殼綱，營養(yǎng)價(jià)值高，肉質(zhì)鮮美，含有許多人體必需的微量元素[1]。菲律賓蛤仔作為我國主要的海洋經(jīng)濟(jì)貝類之一，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，生長迅速，繁殖周期短，適應(yīng)性較強(qiáng)，適合人工高密度養(yǎng)殖[2]。

我國是世界第一漁業(yè)大國，由于水產(chǎn)養(yǎng)殖的集約化發(fā)展，水生動物疾病多發(fā)。病害發(fā)作已成為制約菲律賓蛤仔產(chǎn)業(yè)的重要因素[3]。目前主要通過在水產(chǎn)動物的飼料中直接添加可食用的添加劑，以此來改善水產(chǎn)動物發(fā)育周期，提高抗病能力。蝦青素（Astaxanthin）作為一種生物活性物質(zhì)和天然色素，近年來受到了極大的關(guān)注，其最大的市場是作為飼料添加劑，應(yīng)用到魚蝦蟹等水生動物的飼料中[4]。蝦青素著色效果良好，可以進(jìn)入生物體并貯存在生物體組織中，使得某些動物的肌肉組織和皮膚呈現(xiàn)出光鮮亮麗的顏色（如紅鱔魚、錦鯉等），因此天然蝦青素被我國農(nóng)業(yè)部指定為水產(chǎn)動物的唯一著色劑[5]。同時(shí)，蝦青素在預(yù)防和治療魚類，蝦和蟹等的疾病中也起著重要作用，一方面可以提高動物的免疫力和動物的存活率，對動物良性的生長、繁殖與存活具有重要的作用，另外，相關(guān)研究表明在飼料中添加不同劑量的蝦青素可以明顯提高動物細(xì)胞中抗氧化酶如過氧化物酶和超氧化物歧化酶的生物活性，起到較好的抗氧化作用[6]。

雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）是一種富含蝦青素的單細(xì)胞藻，是大自然中天然蝦青素含量最高的生物，被公認(rèn)為獲取天然蝦青素最佳生物來源，可作為抗氧化劑和著色劑食用，亦可作為蛋白質(zhì)替代品，對水生動物的生長發(fā)育有積極的影響。郭春雨[7]研究表明，飼料中添加蝦青素可以提高河蟹生長存活率，抗氧化能力和免疫性能，促進(jìn)卵黃蛋白積累;也有研究表明，在飼料中添加少量的雨生紅球藻可以改善虹鱒魚的生長指數(shù)和免疫系統(tǒng)[8]。張寶龍等[9]研究中發(fā)現(xiàn)，飼料中添加一定量的雨生紅球藻可以顯著促進(jìn)紅草金魚的生長和免疫;還有研究結(jié)果表明，雨生紅球藻還可以改善七彩神仙魚的生長率和增重率[10]。同時(shí)，在龍曉文等[11]研究中，飼料中添加雨生紅球藻粉可以提高中華絨螯蟹的性腺粗蛋白和肌肉總多不飽和脂肪酸以及頭胸甲中類胡蘿卜素的含量。由此可見，在飼料中添加雨生紅球藻對水生動物的生長發(fā)育和免疫中起重要作用。

本試驗(yàn)以菲律賓蛤仔為研究對象，研究餌料中添加不同量雨生紅球藻對菲律賓蛤仔的生長特性、肥滿度和肝臟中抗氧化酶PPO活性的影響，以及添加適量的雨生紅球藻對菲律賓蛤仔的肥滿度和多酚氧化酶的影響，旨在更加精確地探討添加雨生紅球藻的最適劑量，為菲律賓蛤仔的繁育和養(yǎng)殖提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)備

1.1.1 試驗(yàn)試劑 多酚氧化酶（PPO）試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.1.2 試驗(yàn)蛤仔及養(yǎng)殖條件 菲律賓蛤仔（R. philippinarum）選自天津市大神堂南部淺海區(qū)域，挑選無破損的個(gè)體，平均殼長（3.7±0.15） cm。用海水沖洗干凈，在實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖槽（490 mm×320 mm×145 mm）中暫養(yǎng)24 h。飼養(yǎng)期間，鹽度2.5%，溫度（20±0.5） ℃，養(yǎng)殖期間連續(xù)曝氣，光照周期為12 h/12 h，期間換水1次，適應(yīng)后進(jìn)行分組試驗(yàn)。

1.1.3 試驗(yàn)餌料 雨生紅球藻粉蝦青素含量為5%。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 餌料的制備 按照雨生紅球藻：螺旋藻=1∶9，3∶7，5∶5，7∶3，9∶1的比例進(jìn)行分組混合，對照組只投喂螺旋藻粉，每次投喂總量為0.03 g。

1.2.2 分組養(yǎng)殖 選出780粒蛤仔進(jìn)行分組，每個(gè)養(yǎng)殖水槽中放養(yǎng)130粒。每天換水兩次（9：00和21：00），投喂餌料2次（8：00和20：00）。每隔3 d測定一次菲律賓蛤仔的殼長、殼寬、殼高、軟體濕質(zhì)量和組織中的PPO活力值。

1.3 測定指標(biāo)

1.3.1 生長指標(biāo)的測定 用游標(biāo)卡尺（精確到0.01 mm）測量菲律賓蛤仔的殼長、殼寬、殼高等生態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)，然后用電子天平（精確到0.1 g）稱質(zhì)量。

1.3.2 肥滿度的測定 取其中25個(gè)進(jìn)行生長指標(biāo)的測量，將表面游離的水分用吸水紙吸干，用剪刀剪開貝殼，用鑷子將軟體部取出，然后用吸水紙吸干表面游離水分并稱質(zhì)量，置于80 ℃的恒溫干燥箱中烘干12 h以上至恒質(zhì)量，稱質(zhì)量。

肥滿度[12]=[WFM/（L×W×H）]×105

1.3.3 PPO活性的測定 取3粒蛤仔的肝臟，稱量，按照質(zhì)量（g）與體積（mL）比為1∶5加入提取液，冰浴勻漿，轉(zhuǎn)速8 000 r·min-1，離心10 min，依照試劑盒說明測定PPO活性。

PPO活力（U·g-1鮮質(zhì)量）=×××÷反應(yīng)時(shí)間（min）

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS 25.0進(jìn)行單因素方差分析，Duncan法進(jìn)行多重比較，顯著性水平設(shè)為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 肥滿度

由圖1可知，隨著養(yǎng)殖天數(shù)增加，雨生紅球藻與螺旋藻比5∶5處理菲律賓哈仔肥滿度呈先增加后降低的趨勢且4～13 d肥滿度均高于1 d，1∶9處理肥滿度呈升-降-升的趨勢，其中4，13 d肥滿度高于1 d，3∶7處理肥滿度呈先略有下降后持續(xù)增加的趨勢，其中7～13 d肥滿度均高于1 d，7∶3處理肥滿度呈降-升-降的趨勢，其中7 d肥滿度高于1 d，9∶1處理肥滿度呈持續(xù)下降的趨勢，對照組肥滿度呈先下降后上升的趨勢，其中13 d肥滿度高于1 d。將圖1中5次取樣肥滿度作為重復(fù)，對各處理數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果（表1）表明，雨生紅球藻與螺旋藻比例為9∶1的菲律賓蛤仔的肥滿度顯著小于其它組別，而雨生紅球藻與螺旋藻比例為5∶5的肥滿度顯著高于其他組。由此可見，適宜雨生紅球藻與螺旋藻配比的餌料有助于菲律賓哈仔肥滿度的增加，以5∶5效果最佳。2.2 PPO活力

由圖2可知，隨著養(yǎng)殖天數(shù)的增加，雨生紅球藻與螺旋藻比為5∶5，7∶3，9∶1處理的菲律賓蛤仔PPO活力均呈增加趨勢，對照和3：7處理PPO活力呈先升高后降低的趨勢且4～13 d PPO活力均高于1 d，1∶9處理PPO活力呈先降低后升高的趨勢。將圖2中5次取樣PPO活性作為重復(fù)，對各處理數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果（圖3）表明，雨生紅球藻與螺旋藻比為1∶9的菲律賓蛤仔PPO活力值最低，顯著低于雨生紅球藻與螺旋藻比為5∶5和7∶3的處理，后二者之間差異不顯著。由此可見，適宜雨生紅球藻與螺旋藻配比的餌料有助于提高于菲律賓蛤仔PPO活力，其中以5∶5和7∶3效果較好。

3 結(jié)論與討論

貝類常用肥滿度（肥滿指數(shù)）來衡量肉質(zhì)的肥瘦程度，肥滿度也成為條件指數(shù)（Index of condition）[12]。相關(guān)研究[13-15]表明，肥滿度與養(yǎng)殖密度、繁殖期、水溫有著極為密切的關(guān)系。本研究中，在菲律賓蛤仔餌料中添加雨生紅球藻藻粉，對于菲律賓蛤仔肥滿度具有顯著影響，其添加量過高或過低均不利于菲律賓哈仔肥滿度的增加，其中以二者配比5∶5最佳。雨生紅球藻對菲律賓哈仔肥滿度的影響可能與其含有蝦青素有關(guān)。蝦青素作為飼料添加劑，對許多水生動物的生長有重要影響[16-18]。黃璞儀等[10]研究表明，蝦青素對彩色神仙魚的增重率和生長率有顯著影響。

在一些哺乳動物上的結(jié)果也表明，蝦青素在機(jī)體營養(yǎng)和健康方面具有積極的調(diào)控作用[19-20]。蝦青素除了本身就具有抗氧化作用外，也對機(jī)體的抗氧化酶系統(tǒng)有重要的調(diào)節(jié)作用[21-23]，以提高水生動物對環(huán)境脅迫的適應(yīng)性。龍曉文等[11]研究中發(fā)現(xiàn)飼料中添加蝦青素可顯著提高中華絨螯蟹的CAT活性。韓星星等[24]研究發(fā)現(xiàn)，大黃魚肝臟T-SOD活性隨著蝦青素添加水平的加大而顯著上升。多酚氧化酶（Polyphenol oxidaes）是大多數(shù)貝類先天免疫防御系統(tǒng)中的重要酶[25]。有研究表明，無脊椎動物中黑色素的含量與免疫能力有關(guān)[26-27]。雙殼軟體動物中PPO可以被誘導(dǎo)，這種激活過程通常是由病原體模式識別受體（PRR）觸發(fā)的[28]。近年來，有報(bào)道顯示南美白對蝦的PPO活性[29-31]已被研究用于抑制南美白對蝦的變黑。也有研究表明，用弧菌刺激菲律賓蛤后，其血淋巴多酚氧化酶活性也顯著提高[32-33]。本研究中，在菲律賓蛤仔的餌料中適當(dāng)添加雨生紅球藻藻粉對菲律賓蛤仔的PPO活性有一定影響，其添加量過高或過低均不利于菲律賓蛤仔PPO活性的增加，其中當(dāng)雨生紅球藻與螺旋藻比為5∶5的菲律賓蛤仔PPO活力值最高，其次是7∶3處理。

綜合雨生紅球藻添加比例對菲律賓蛤仔肥滿度和PPO活性的影響，以餌料中雨生紅球藻與螺旋藻的比例為5∶5為宜，菲律賓蛤仔的肥滿度與PPO活性均可達(dá)到最高值。但考慮到本試驗(yàn)飼喂周期（2周）相對較短，未來可以進(jìn)一步加長投喂時(shí)間，在現(xiàn)有的投喂基礎(chǔ)上，進(jìn)一步設(shè)計(jì)投喂梯度，以便更加精確地探討添加雨生紅球藻的最適劑量。

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