樹上干杏指紋圖譜構(gòu)建與親緣關(guān)系研究初探

叢桂芝 王瑾 陳淑英 石游 陶俊 阿布地薩拉木·艾尼外爾 許正

摘要：為進(jìn)一步探究樹上干杏親緣關(guān)系，本研究利用SSR分子標(biāo)記引物技術(shù)，通過PCR擴(kuò)增及非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，對(duì)樹上干杏等9個(gè)杏品種（類型）的18對(duì)SSR多態(tài)性引物進(jìn)行鑒定，獲得DNA指紋圖譜，從DNA水平鑒定伊犁樹上干杏品種與其他杏品種（類型）之間的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近。對(duì)各杏品種（類型）間親緣關(guān)系進(jìn)行聚類分析，結(jié)果表明：杏1（樹上干杏1號(hào)）和杏2（樹上干杏2號(hào)）2個(gè)品種差異較大，杏4（樹上干杏4號(hào)）與杏1（樹上干杏1號(hào)）為同一類。與杏1（樹上干杏1號(hào)）親緣關(guān)系由近及遠(yuǎn)依次為鞏留野杏、珍珠油杏、第四師61團(tuán)古杏，其遺傳相似性系數(shù)范圍為0.673～0.808。杏3（樹上干杏3號(hào)）與杏2（樹上干杏2號(hào)）為同一類，與李光杏親緣關(guān)系較近，其遺傳相似性系數(shù)范圍為0.654～0.846?；舫且靶优c樹上干杏親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

關(guān)鍵詞：樹上干杏；SSR分子標(biāo)記；DNA指紋圖譜；聚類分析；親緣關(guān)系

中圖分類號(hào)：S662.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A論文編號(hào)：cjas20191100269

The Fingerprint Structure and Genetic Relationship of Shushanggan Apricot： A Preliminary Study

Cong Guizhi， Wang Jin， Chen Shuying， Shi You， Tao Jun， Abudusalamu Ainiwaier， Xu Zheng

（Ili Academy of Forestry Sciences， Ili 835000， Xinjiang， China）

Abstract： To explore the genetic relationship of Shushanggan apricot， SSR molecular marker technology was used by PCR amplification and a modified polyacrylamide gel electrophoresis， 18 pairs of SSR polymorphism primers were identified in nine varieties （types） of Shushanggan apricot and other apricots， to get the DNA fingerprint. The genetic relationship between Shushanggan apricot and other apricot varieties （types） were identified from different DNA levels. The genetic relationship of apricot varieties （types） were analyzed by clustering. The results showed that Shushanggan apricot had two different varieties， namely Shushanggan apricot No.1 and Shushanggan apricot No.2. Shushanggan apricot No.4 and Shushanggan apricot No.1 were the same type. The close genetic relationship to Shushanggan apricot No.1 was Gongliu wild apricot>pearl oil apricot>Disishi 61 Tuan ancient apricot， the genetic similarity coefficient ranged from 0.673 to 0.808. Shushanggan apricot No.3 and Shushanggan apricot No.2 were the same type， and they were closely related to Liguang apricot， the genetic similarity coefficient ranged from 0.654 to 0.846. Huocheng wild apricot was far related to Shushanggan apricot.

Keywords： Shushanggan Apricot； SSR Molecular Marker； DNA Fingerprint； Cluster Analysis； Genetic Relationship

0引言

遺傳多樣性是物種適應(yīng)自然和進(jìn)化的基本特征，它源于不同的核酸序列和基因突變。天然樹木軀體的遺傳多樣性程度受遺傳漂變、遷移、突變和選擇等綜合因素的影響，其基因頻率會(huì)在一定的水平上波動(dòng)，反映在核酸水平上會(huì)呈現(xiàn)出特定DNA片段的多態(tài)性[1-2]。因此，利用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)遺傳多樣性進(jìn)行快速檢測(cè)，可以免受環(huán)境、組織特異性和發(fā)育階段的影響[3]。

在種質(zhì)資源研究領(lǐng)域中分子標(biāo)記主要應(yīng)用在2個(gè)方面。首先是指紋圖譜的構(gòu)建，用于種質(zhì)資源的鑒定；其次是對(duì)種質(zhì)資源間的遺傳多樣性進(jìn)行研究，區(qū)分品質(zhì)間的親緣關(guān)系[4-5]。由于樣本基因組微衛(wèi)星座位的復(fù)等位性，使該技術(shù)易于鑒別同一物種的不同基因型，從而反映出樣本間的差異性[6]。SSR技術(shù)在果樹種質(zhì)資源的研究領(lǐng)域中應(yīng)用很廣泛。何天明等[7]從核果類果樹種質(zhì)資源的遺傳分析角度出發(fā)，主要從品種鑒定和親緣關(guān)系分析、一些重要農(nóng)藝性狀的標(biāo)記以及遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建等方面對(duì)SSR分子標(biāo)記技術(shù)在這一領(lǐng)域的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。俞明亮等[8]應(yīng)用SSR標(biāo)記技術(shù)分析桃種間的演化模式，同時(shí)采用集群分離分析法對(duì)白肉/黃肉、毛桃/油桃、花粉可育/花粉敗育3個(gè)性狀進(jìn)行了標(biāo)記研究，開創(chuàng)了分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)在桃種質(zhì)遺傳育種研究領(lǐng)域應(yīng)用的先河。何天明等[9]用SSR標(biāo)記技術(shù)鑒定了中國(guó)西部伊犁山谷野山杏的群體遺傳結(jié)構(gòu)。Graharm等[10]通過10個(gè)隨機(jī)引物擴(kuò)增的指紋圖譜區(qū)分了10個(gè)樹梅品種。Thomas等[11]利用5對(duì)引物對(duì)葡萄進(jìn)行PCR擴(kuò)增，成功區(qū)分了33個(gè)不同的葡萄品種。Galli等[12]利用SSR分子標(biāo)記區(qū)分了蘋果的66個(gè)栽培品種。

對(duì)于相同物種的不同品種來說，含有大量的多態(tài)性標(biāo)記，任何品種都有不同于另外品種的特有標(biāo)記，也就是一些特異性DNA片段的組合，稱為該物種的“指紋”，DNA指紋圖譜技術(shù)是對(duì)遺傳物質(zhì)的多態(tài)性直接分析與檢測(cè)，以此診斷物種基因的分布和表現(xiàn)規(guī)律，已經(jīng)在果樹種質(zhì)資源研究中廣泛地應(yīng)用[13-15]。由于是以DNA的形式直接表現(xiàn)，其反映出來的差異也就是基因型差異，所以更為可觀精準(zhǔn)，是目前應(yīng)用最為廣泛的指紋圖譜技術(shù)[16-18]。

樹上干杏屬新疆杏的地方品種，為中亞品種群[19]，為小果杏類品種，是新疆伊犁河谷特有鮮食、制干兼仁用的鄉(xiāng)土杏良種，果實(shí)個(gè)小質(zhì)輕，單果質(zhì)量10～30 g，鮮杏成熟后，色澤黃中帶紅，非常鮮艷，果肉香甜美味，干杏果肉純美甘甜，杏核極薄，輕嗑即食，果仁香甜，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量豐富，口感好，風(fēng)味獨(dú)特，品質(zhì)極佳，可在樹枝上自身脫水風(fēng)干不落，俗稱“吊死干”，當(dāng)?shù)毓Z為“梅孜吳爾克”，維語為“古麗卡克”，商品名樹上干杏[20]。

伊犁地區(qū)天山野杏林是國(guó)內(nèi)野杏的重要集中地，天山野杏是栽培杏的直接祖先，主要分布在海拔950～ 1400 m的低山帶，是落葉闊葉林的重要組成樹種，有些新疆野杏及野生類型杏因品質(zhì)優(yōu)良，完全可與栽培杏的優(yōu)良品種相媲美[21]。

為進(jìn)一步探究樹上干杏親緣關(guān)系，本研究采用SSR（simple sequence repeat）分子標(biāo)記技術(shù)[22]，利用不同地域9個(gè)杏品種（類型）的18對(duì)SSR引物進(jìn)行遺傳多樣性研究，獲得DNA指紋圖譜，旨在為確定樹上干杏品種親緣關(guān)系提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

本研究選擇新疆伊犁河谷樹上干杏3個(gè)選育品種（樹上干杏1號(hào)、樹上干杏2號(hào)、樹上干杏3號(hào)）及優(yōu)良類型樹上干杏4號(hào)，與分布在河谷不同地域內(nèi)、同樹上干杏性狀相近的2個(gè)栽培品種（李光杏、珍珠油杏）、1棵古杏、2個(gè)野杏類型，合計(jì)9個(gè)杏品種（類型）為試驗(yàn)材料（表1）。

1.2方法

1.2.1 DNA提取采用改良CTAB法提取杏基因組DNA[23]，并進(jìn)行DNA樣品濃度和純度的測(cè)定。具體操作步驟如下：（1）取幼嫩真葉材料一小片，用蒸餾水沖洗干凈，置1.5 mL的離心管中，加液氮，快速冷卻。（2）將材料快速研磨成粉末，然后加入65℃預(yù)熱的CTAB提取緩沖液700μL。（3）放入65℃水浴30～40 min，每10 min輕輕地振蕩一次。（4）加入等體積的氯仿/異戊醇（24：1） 700μL，混勻5 min，12000 r/min離心5 min。（5）取上清液轉(zhuǎn)入另一1.5 mL新離心管中，加入經(jīng)冰箱冷藏處理的無水乙醇800μL，放置于4℃10 min左右，讓DNA充分沉淀。（6）小心清除無水乙醇、加入經(jīng)冰箱冷藏處理70%乙醇漂洗2次。（7）室溫晾干，輕輕彈離心管，至沒有水滴即可。（8）將DNA溶于50μL或100μL的0.1倍TE中，加入RNase （10 mg/mL） 1μL于37℃消化15～30 min。（9）于-20℃或4℃保存。

1.2.2 SSR標(biāo)記引物序列的獲得及合成通過引物篩選，將多態(tài)性豐富且穩(wěn)定性好的SSR引物用于杏品種（類型）的鑒定及遺傳多樣性分析[24]。

1.2.3 SSR反應(yīng)體系擴(kuò)增SSR標(biāo)記技術(shù)反應(yīng)物混勻后于PCR儀（PTC-200TMPeltiter thermal cycler）上擴(kuò)增。見表2。

1.3非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)SSR擴(kuò)增產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。電泳儀和電泳槽分別使用北京君意東方電泳設(shè)備有限公司的JY600C電泳儀和北京市六一儀器廠的DYCZ-30電泳槽。聚丙烯酰胺凝膠溶液的配制見表3。

1.4銀染程序[25]

1.4.1固定將玻璃板從電泳槽取下，拔出梳子，并輕輕將長(zhǎng)板取下，膠面朝上放入盛有2000 mL固定液（1800 mL蒸餾水+200 mL無水乙醇+10 mL乙酸）的塑料盒中，在搖床上輕搖7 min。

1.4.2染色倒入2000 mL染色液（2000 mL蒸餾水+3 g AgNO3），在搖床上染色7 min，倒去染色液，用蒸餾水漂洗約30 s。

1.4.3顯色倒入2000 mL顯色液（2000 mL蒸餾水+30 g NaOH+4 mL CH2O），在搖床上輕搖至條帶清晰地顯出，倒去顯色液。

1.4.4定影用步驟1.4.1中回收的固定液定影約30 s。

1.4.5漂洗倒入2000 mL蒸餾水漂洗約30 s。

取出后自然晾干，掃描或照相保存。以上銀染中所用的各溶液需要現(xiàn)配現(xiàn)用，不可久存。

1.5譜帶記錄及數(shù)據(jù)分析

1.5.1反應(yīng)條帶觀察及統(tǒng)計(jì)凝膠干燥后，形成DNA多態(tài)性圖譜，對(duì)膠片上的SSR條帶進(jìn)行量化處理，并以0、1方式記錄。將圖譜上清晰的條帶記為“1”，同一位置沒有條帶記為“0”，生成“1”和“0”組成的原始矩陣。

1.5.2數(shù)據(jù)分析SSR轉(zhuǎn)化成1、0數(shù)據(jù)后，利用NTSYS-2.10e軟件中的SIMQUAL程序求Dice相似系數(shù)矩陣：用SHAN程序中的UPGMA方法進(jìn)行聚類分析。

2結(jié)果與分析

2.1 SSR引物篩選

通過引物篩選，將多態(tài)性豐富且穩(wěn)定性好的SSR引物用于杏品種（類型）的鑒定及遺傳多樣性分析，篩選引物組合見表4。

2.2引物篩選鑒定

從18對(duì)引物中篩選出6對(duì)能將9份材料鑒別出來的具有良好多態(tài)性的SSR引物，將9個(gè)杏材料歸納鑒定為9個(gè)獨(dú)立的個(gè)體。具體鑒定結(jié)果見圖1。

2.3數(shù)據(jù)聚類分析

采用6對(duì)SSR引物對(duì)9種杏材料進(jìn)行鑒定，通過聚類分析將9份材料分為3類（見圖2）。其中杏8（霍城野杏）材料分別為獨(dú)立的一類。杏2（樹上干杏2號(hào)）、杏3（樹上干杏3號(hào)）和杏5（李光杏）聚為一類，而其他5份材料[杏1（樹上干杏1號(hào)）、杏4（樹上干杏4號(hào)）、杏6（第四師61團(tuán)古杏）、杏7（鞏留野杏）、杏9（珍珠油杏）]聚為一類，說明這5份材料親緣關(guān)系較近，具有較相似的遺傳背景。

SSR標(biāo)記所構(gòu)建杏研究材料的指紋圖譜，不受表型特征限制，也不受外部環(huán)境影響，本次杏研究材料品種（類型）的鑒定結(jié)果為：（1）杏1（樹上干杏1號(hào)）、杏2（樹上干杏2號(hào)）差異比較大。（2）杏1（樹上干杏1號(hào)）、杏4（樹上干杏4號(hào)）為一類，其遺傳相似性系數(shù)為0.808。（3）與杏1（樹上干杏1號(hào)）親緣關(guān)系由近到遠(yuǎn)依次為鞏留野杏、珍珠油杏、第四師61團(tuán)古杏，其遺傳相似性系數(shù)依次為0.711、0.692、0.673。（4）杏2（樹上干杏2號(hào)）、杏3（樹上干杏3號(hào)）為一類，其遺傳相似性系數(shù)為0.846。（5）杏2（樹上干杏2號(hào)）與杏5（李光杏）親緣關(guān)系較近，其遺傳相似性系數(shù)為0.654。（6）杏8（霍城野杏）為獨(dú)立的一類，與杏1（樹上干杏1號(hào)）、杏2（樹上干杏2號(hào)）親緣關(guān)系均較遠(yuǎn)。

3討論

中亞地區(qū)原始農(nóng)業(yè)的最初階段，天山野果林的各種野生果樹中野杏應(yīng)該是古人馴化栽培的首選樹種，其栽培品質(zhì)好，含糖量高，易曬制杏干，杏干是便于貯藏的最佳果品。由此可以推論，在原始農(nóng)業(yè)初期，由于自然條件適宜，人類生活需要，天山野杏曾在古代中國(guó)新疆南部烏茲別克斯坦費(fèi)爾干納及土庫曼斯坦等地首先得到大量種植，然后向東擴(kuò)展到中國(guó)內(nèi)地，向西拓展到歐洲，但在杏的起源和栽培史中，文獻(xiàn)和史料無此記載。從世界范圍來看，杏的起源、發(fā)展、栽培和制干，除廣大中亞地區(qū)，包括伊犁河谷及其西南天山的野杏，均具備曬制優(yōu)質(zhì)杏干的野杏資源和自然條件外，中國(guó)甘肅以東地區(qū)和哈薩克斯坦以西的歐洲，由于空氣濕度大，均不具備曬制杏干的自然條件，因此，古代的東方人和西方人應(yīng)該是首先見到能夠經(jīng)過長(zhǎng)途販運(yùn)又具有優(yōu)良品質(zhì)的杏干，然后才是引種栽培[21]。鑒于樹上干杏1號(hào)與鞏留野杏具有較相似的遺傳性判斷其具有相近的親緣關(guān)系，再次印證了樹上干杏為伊犁天山野杏中選育而來的說法。至于樹上干杏從伊犁河谷到烏茲別克斯坦迂回傳播的過程還需進(jìn)一步考證。

SSR標(biāo)記所構(gòu)建的杏指紋圖譜，不受表型特征限制，也不受外部環(huán)境影響，不僅可用于杏品種（類型）的鑒定，還可為杏品種（類型）的雜合性鑒定提供可靠的方法。樹上干杏2號(hào)與李光杏親緣關(guān)系近，兩者具有較相似的遺傳背景，不排除芽變或雜交的可能性。

樹上干杏3號(hào)與樹上干杏2號(hào)品種歸為同一類，樹上干杏4號(hào)類型與樹上干杏1號(hào)品種歸為同一類，SSR標(biāo)記反映出的親緣關(guān)系與根據(jù)生態(tài)類型表現(xiàn)對(duì)杏種質(zhì)的分類結(jié)果基本一致，其表型差異來源于栽培區(qū)域生態(tài)差異、土壤差別、管理或遺傳等因素。

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