印度橄蝗線粒體基因組測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析

邱忠營(yíng)，黃 原，茹凝玉，崔媛媛

（1.西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部,陜西西安 710021；2.陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,陜西西安 710062）

昆蟲線粒體基因組是長(zhǎng)度約15 kb 的環(huán)狀雙鏈共價(jià)閉合分子，具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、基因重排少及基因進(jìn)化速率快等特點(diǎn)[1]，是分子系統(tǒng)發(fā)生學(xué)、物種鑒定、譜系地理學(xué)以及種群遺傳結(jié)構(gòu)領(lǐng)域等重要的分子標(biāo)記[2-4]。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，測(cè)序時(shí)間大大縮短，線粒體基因組數(shù)據(jù)增長(zhǎng)速度很快。截至2020年7月，NCBI數(shù)據(jù)庫公布的直翅目（Orthoptera）昆蟲線粒體基因組序列有218 個(gè)，蝗亞目（Locustodea）138 個(gè)，螽亞目（Ensifera）80 個(gè)，但關(guān)于橄蝗屬（Tagasta）昆蟲未見報(bào)道。直翅目昆蟲的線粒體基因組由37 個(gè)基因組成，包括13 個(gè)蛋白編碼基因（PCGs）、22 個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNAs）、2 個(gè)核糖體RNA（rRNAs）和非編碼區(qū)，也稱為A + T 富集區(qū)或控制區(qū)。印度橄蝗（Tagasta indica）隸屬于橄蝗屬，橄蝗亞科（Tagastinae），瘤錐蝗科（Chrotogonidae），蝗總科（Acridoidea），直翅目。在中國(guó)，印度橄蝗主要分布在福建、廣東和廣西等地，國(guó)外分布在印度和泰國(guó)等地。從形態(tài)上看，瘤錐蝗科的頭型與錐頭蝗科（Pyrgomorphidae）基本一致，均為錐型，體型也均呈紡錘形；兩者的不同之處主要在于瘤錐蝗科昆蟲的觸角為絲狀，錐頭蝗科昆蟲的觸角為劍狀。根據(jù)22個(gè)形態(tài)學(xué)性狀，無法區(qū)分瘤錐蝗科和錐頭蝗科，許升全等[5]建議將二者合為一個(gè)科；劉殿鋒等[6]應(yīng)用18S rDNA 序列構(gòu)建蝗總科系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，也認(rèn)為將瘤錐蝗科和錐頭蝗科合為一個(gè)科較合適。目前，關(guān)于直翅目昆蟲系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系的研究已有很多[2-4,7-8]，但涉及的瘤錐蝗科昆蟲較少，僅有4 條全線粒體基因組序列被測(cè)出。為更好地確定瘤錐蝗科與錐頭蝗科的分類地位及系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，本研究測(cè)定了瘤錐蝗科印度橄蝗的全線粒體基因組，并初步構(gòu)建了蝗總科的系統(tǒng)進(jìn)化樹，為瘤錐蝗科的分類地位和系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系提供數(shù)據(jù)支持和分子證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx、DNA提取及測(cè)序

印度橄蝗標(biāo)本于2009年9月17日采自廣西桂林三里店（110°32’E，25°27’N），現(xiàn)保存于陜西師范大學(xué)分子進(jìn)化生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。取單頭蟲后足股節(jié)肌肉，采用DNA 提取試劑盒（QIAGEN 公司生產(chǎn)）提取總DNA。測(cè)序策略是將整個(gè)線粒體基因組分成2個(gè)大片段，以此為模板，參考通用引物序列[9-10]，以長(zhǎng)PCR 產(chǎn)物為模板，擴(kuò)增500 ～1 000 bp 長(zhǎng)度片段，最終擴(kuò)增出覆蓋線粒體基因組全長(zhǎng)的序列；短的PCR片段直接送華大科技測(cè)序公司測(cè)序。

1.2 拼接與注釋

應(yīng)用拼接軟件Standen package對(duì)測(cè)序所得序列進(jìn)行拼接，序列注釋應(yīng)用Geneious 9.1.2 軟件[11]完成。應(yīng)用在線軟件tRNAscan-SE（http://lowelab.ucsc.edu/tRNAscan-SE/）[11]進(jìn)行tRNA 基因的預(yù)測(cè)。以短額負(fù)蝗（Atractomorpha sinensis）線粒體基因組為參考基因組進(jìn)行序列比對(duì)，確定蛋白編碼基因和核糖體rRNAs的基因位置。

1.3 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

選取包括印度橄蝗在內(nèi)的蝗總科的20 個(gè)物種及1 個(gè)外群物種摩門螽斯（Anabrus simplex）共21 個(gè)物種的線粒體基因組序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。所選物種的GenBank 序列號(hào)及分類信息見表1。應(yīng)用Geneious 9.1.2 軟件對(duì)21 個(gè)物種線粒體基因組序列的13 個(gè)PCGs 及2 個(gè)rRNAs 進(jìn)行提取和比對(duì)[12]。應(yīng)用軟件SequenceMatrix 1.7.8將單個(gè)基因比對(duì)結(jié)果連接成1 個(gè)聯(lián)合數(shù)據(jù)集，并利用MrBayes 3.1.2 軟件構(gòu)建貝葉斯（BI）樹[13]。

表1 系統(tǒng)發(fā)育分析中線粒體基因組的分類信息Tab.1 Taxonomic information of mitochondrial genomes for phylogenetic analysis

續(xù)表1 Continued

2 結(jié)果與分析

2.1 印度橄蝗線粒體基因組序列測(cè)序及結(jié)構(gòu)

試劑盒提取的DNA 中包括核DNA 和線粒體DNA，由于線粒體DNA所占比例較小，本研究通過2對(duì)直翅目昆蟲線粒體基因組通用引物擴(kuò)增出覆蓋線粒體基因組序列全長(zhǎng)的片段，再以此長(zhǎng)片段為模板，擴(kuò)增出500 ～1 000 bp 長(zhǎng)度的片段進(jìn)行測(cè)序，并應(yīng)用軟件Standen Package 進(jìn)行組裝，去除兩端冗余序列，獲得線粒體基因組全長(zhǎng)序列。

2.2 印度橄蝗線粒體基因組序列結(jié)構(gòu)特征

印度橄蝗線粒體基因組全長(zhǎng)序列15 531 bp（GenBank 登陸號(hào)：MK080200），共編碼37 個(gè)基因，包 括13 個(gè)PCGs（atp6, atp8,cox1-3,cytb,nad1-6,nad4l）、2個(gè)rRNAs（rrnS和rrnL）和22個(gè)tRNAs，以及1 個(gè)控制區(qū)（control region,CR）（圖1）。其中，N 鏈編碼14 個(gè)基因（4 個(gè)PCGs、8 個(gè)tRNAs 和2 個(gè)rRNAs），J鏈編碼剩余基因（9 個(gè)PCGs 和14 個(gè)tRNAs）。印度橄蝗線粒體基因組結(jié)構(gòu)緊湊，基因間隔區(qū)長(zhǎng)度為0～30 bp，沒有基因缺失；基因排列順序與蝗亞目昆蟲線粒體基因典型排列順序相同，沒有基因重排現(xiàn)象（表2）。

圖1 印度橄蝗線粒體全基因組結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of T.indica mitochondrial genome

表2 印度橄蝗線粒體全基因組Tab.2 Organization of T.indica mitochondrial genome

續(xù)表2 Continued

2.2.1 蛋白編碼基因和核苷酸組成

印度橄蝗線粒體基因組全序列堿基組成為A（42.3%）、T（31.1%）、C（16.0%）和G（10.6%），AT含量（73.4%）明顯大于CG 含量（26.6%），存在明顯的AT 偏斜，與其他直翅目昆蟲堿基組成類似（表3）?；蚪M中，rRNAs、tRNAs、PCGs 和AT 富集區(qū)的AT 含量分別為75.7%、75.4%、72.4%和81.0%，存在明顯的AT-skew。從核苷酸組成密碼子偏好性上，蛋白編碼基因密碼子第3 位點(diǎn)的AT 含量最高（82.0%），其次是蛋白編碼基因密碼子第1 位點(diǎn)（69%.0），蛋白編碼基因密碼子第2 位點(diǎn)最低（66.2%）。AT 偏向性最顯著的是蛋白編碼基因密碼子第2 位點(diǎn)，AT-skew 值為-0.39（T 含量遠(yuǎn)大于A）。

表3 印度橄蝗線粒體基因核苷酸組成Tab.3 Nucleotide composition of T.indica mitochondrial genome

印度橄蝗線粒體基因排列相對(duì)緊密，存在少量的基因重疊和間隔區(qū)。在線粒體基因組的37 個(gè)基因中，有11 處重疊，其中兩處存在于蛋白編碼基因間，分別是nad4L/nad4（7 bp）和atp8/atp6（7 bp），其余9 處存在于tRNA 與蛋白編碼基因組和tRNA 之間?；蜷g隔區(qū)有15處，長(zhǎng)度為1 ～31 bp，其中trn-SUCN（Ser）和nad1基因間隔區(qū)最長(zhǎng)（31 bp），剩余9 個(gè)基因緊密相連。

13個(gè)蛋白編碼基因中，起始密碼子有3個(gè)蛋白編碼基因?yàn)榉菢?biāo)準(zhǔn)起始密碼子，分別是nad2為GTG、cox1為ACT及nad6為TTG；其余10個(gè)蛋白編碼基因均為標(biāo)準(zhǔn)的ATN。終止密碼子中，除nad4和cox3分別為TAG和TA外，其余均為TAA。不完整的終止密碼子普遍存在于直翅目昆蟲的mtDNA 中，研究表明終止密碼子受選擇壓力小，縮短的終止密碼子可通過轉(zhuǎn)錄后多腺苷酸化補(bǔ)充[31]。印度橄蝗的13個(gè)蛋白編碼基因密碼子有3 716個(gè)，使用頻率最高的密碼子為UUA，n（RSCU）值為312（3.54），使用頻率最低的是UGC和CGG，僅3次（圖2）。在編碼的3 716個(gè)氨基酸中，使用頻率最高的為L(zhǎng)eu，占所有氨基酸的14.24%。

圖2 印度橄蝗全線粒體基因組蛋白編碼基因密碼子使用情況Fig.2 Codon usage of all PCGs in T.indica mitochondrial genome

2.2.2 RNA和控制區(qū)

通過tRNAScan-SE軟件預(yù)測(cè)印度橄蝗粒體基因組tRNAs的位置和二級(jí)結(jié)構(gòu)，未預(yù)測(cè)出的tRNAs通過與近緣物種序列比對(duì)確定位置。印度橄蝗線粒體基因包括22個(gè)tRNAs，長(zhǎng)度為64 ～72 bp；trnSAGN二氫尿嘧啶臂缺失，二級(jí)結(jié)構(gòu)不是典型的三葉草結(jié)構(gòu)；其余21個(gè)tRNAs的二級(jí)結(jié)構(gòu)均形成典型的三葉草結(jié)構(gòu)[32]。三葉草結(jié)構(gòu)包含4個(gè)臂，上方為氨基酸接受臂，下方為反密碼子臂，左邊為雙氫尿嘧啶臂（DHU），右方為T&C環(huán)（圖3）。22個(gè)tRNAs在折疊過程中，共存在23處錯(cuò)配，其中G-U 錯(cuò)配20 處；A-G 錯(cuò)配1 處，位于trnW的氨基酸接受臂上；U-U 錯(cuò)配2 處，分別位于trnC的DHU臂和trnH的反密碼子臂上。印度橄蝗線粒體基因組含有rrnL和rrnS，分別位于trnLCUN和trnV之間以及trnV和控制區(qū)之間。rrnS長(zhǎng)度為793 bp，rrnL長(zhǎng)度為1 308 bp。線粒體基因組的控制區(qū)介于rrnS與trnI基因之間，長(zhǎng)度731 bp，A + T 含量高達(dá)81%，高于PCGs、rRNAs和tRNAs區(qū)域的A+T含量。

3 結(jié)論與討論

直翅目昆蟲線粒體基因組為環(huán)狀雙鏈閉合結(jié)構(gòu)，一般在15 kb左右，包含37個(gè)基因。印度橄蝗線粒體基因組全長(zhǎng)15 531 bp，介于已報(bào)道的直翅目昆蟲線粒體基因組長(zhǎng)度范圍內(nèi)（13 ～18 kb）[33]。

直翅目昆蟲的線粒體蛋白編碼基因中，幾乎都以ATN為標(biāo)準(zhǔn)起始密碼子，但有個(gè)別基因起始密碼子會(huì)出現(xiàn)非標(biāo)準(zhǔn)情況，尤以cox1起始密碼子變化較多（CCG、AAA、CAA、TTA、ACG、ATT和CTA等）[34]，還有四聯(lián)密碼子ATGA、ATAA 和GTGA 等都是可能的cox1起始密碼子[35]。這些非正常起始密碼子可轉(zhuǎn)錄后經(jīng)過RNA 編輯轉(zhuǎn)換成正常的密碼子，從而完成翻譯。印度橄蝗的線粒體蛋白編碼基因中nad2、cox1和nad6基因均為非標(biāo)準(zhǔn)起始密碼子，分別為GTG、ACT和TTG；其余均為標(biāo)準(zhǔn)起始密碼子ATN。

圖3 印度橄蝗線粒體基因組tRNAs的二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.3 Secondary structure of tRNAs in T.indica mitochondrial genome

直翅目昆蟲線粒體蛋白編碼基因的終止密碼子較為一致，大多數(shù)蛋白編碼基因以TAA 或TAG 為完整終止密碼子，少數(shù)基因以T或TA 為不完整終止密碼子。印度橄蝗的線粒體蛋白編碼基因中，除cox3的終止密碼子為TA終止密碼子外，其他蛋白編碼基因的終止密碼子均為TAA 或TAG。RNA 加工過程中添加polyA尾巴可將不完整T或TA轉(zhuǎn)變?yōu)橥暾慕K止密碼子。

目前已測(cè)出的直翅目昆蟲線粒體基因組編碼的22 個(gè)tRNAs 中，大部分的trnSAGN為不完整的三葉草結(jié)構(gòu)，缺少DHU 臂；其余21 個(gè)tRNAs 可折疊形成典型的三葉草結(jié)構(gòu)。tRNA形成三葉草結(jié)構(gòu)時(shí)，會(huì)發(fā)生錯(cuò)配，大部分錯(cuò)配為G-U 錯(cuò)配，也有少量的A-A、A-G、C-A 或U-U 錯(cuò)配等，這些錯(cuò)配通過編輯可以校正過來，不會(huì)影響轉(zhuǎn)運(yùn)功能[36]。印度橄蝗的線粒體中，22個(gè)tRNAs的二級(jí)結(jié)構(gòu)都較保守，除trnSAGN缺少DHU 臂外，其余均為典型的三葉草結(jié)構(gòu)；錯(cuò)配方式主要為G-U錯(cuò)配。

核糖體RNA 有rrnL和rrnS，其二級(jí)結(jié)構(gòu)較為保守，分為莖區(qū)和環(huán)區(qū)。核糖體rrnL二級(jí)結(jié)構(gòu)包含6個(gè)結(jié)構(gòu)（I，II，III，IV，V 和VI）。結(jié)構(gòu)區(qū)III 缺失，結(jié)構(gòu)區(qū)IV 和V 高度保守，其他結(jié)構(gòu)部分變化較大。核糖體rrnS二級(jí)結(jié)構(gòu)有4 個(gè)結(jié)構(gòu)，變化較大的是結(jié)構(gòu)一和結(jié)構(gòu)二，相對(duì)保守的是結(jié)構(gòu)三和結(jié)構(gòu)四。

有中國(guó)學(xué)者將蝗總科分成9個(gè)科，其中8個(gè)科在中國(guó)分布，分別為斑腿蝗科（Catantopidae）、斑翅蝗科（Oedipodidae）、網(wǎng)翅蝗科（Arcypteridae）、劍角蝗科（Acrididae）、癩蝗科（Pamphagidae）、槌角蝗科（Gomphoceridea）、瘤錐蝗科和錐頭蝗科。在直翅目昆蟲分類地位上，中國(guó)與國(guó)外的分類系統(tǒng)區(qū)別較大。Otte分類系統(tǒng)中將蝗總科分為11科，確立了瘤蝗科（Dericorythidae）和Lithidiidae。本研究選取摩門螽斯作為外群，與測(cè)得的印度橄蝗和Genbank已公布的蝗總科19 個(gè)物種的全線粒體基因組中的13 個(gè)蛋白編碼基因和2個(gè)核糖體RNA基因構(gòu)建貝葉斯樹（圖4），結(jié)果顯示蝗總科內(nèi)部分支進(jìn)化關(guān)系中，四川鄉(xiāng)城湄公蝗（Mekongiana xiangchengensis）和印度橄蝗聚為一支形成姐妹群，金瀾滄蝗（Mekongiell akingdoni）和西藏瀾滄蝗（M.xizangensis）聚為一支形成姐妹群，之后這4個(gè)物種再聚為一支共同構(gòu)成了瘤錐蝗科，支持瘤錐蝗科的單系性；錐頭蝗科只有1 個(gè)物種短額負(fù)蝗（Atractomorpha sinensis），與瘤錐蝗科的4個(gè)物種最先聚在一起，提示瘤錐蝗科和錐頭蝗科親緣關(guān)系較近。本研究中，瘤錐蝗科與錐頭蝗科的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系與常會(huì)會(huì)等[37]用線粒體基因組蛋白編碼基因構(gòu)建的系統(tǒng)樹一致；白潔等[38]應(yīng)用80 種直翅目昆蟲的線粒體nad2基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，認(rèn)為瘤錐蝗科和錐頭蝗科親緣關(guān)系較近；印紅等[39]應(yīng)用18S rDNA 構(gòu)建蝗總科系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，也支持瘤錐蝗科和錐頭蝗科親緣關(guān)系較近的結(jié)論，其位于蝗總科的基部，是蝗總科最原始的類群。由于錐頭蝗科物種只有短額負(fù)蝗1種，錐頭蝗科物種是否具有單系性還需增加物種進(jìn)行確認(rèn)。本研究測(cè)定的印度橄蝗共有4種瘤錐蝗科物種線粒體基因組序列，數(shù)據(jù)稍顯單薄，瘤錐蝗科和錐頭蝗科分類地位的進(jìn)一步確認(rèn)還需增加物種。

圖4 基于PCGs+rRNAs數(shù)據(jù)集的蝗總科貝葉斯系統(tǒng)樹Fig.4 BI phylogenetic tree of Acridoidea based on mitochondrial PCGs and rRNAs concatenated data set