土壤與大氣雙重脅迫下莧菜幼苗對(duì)鉛的累積與生理響應(yīng)

劉楚藩,肖榮波,黃 飛,戴偉杰,高中原,徐美麗,溫小情

廣東工業(yè)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 廣州 510000

鉛(Pb)是最常見的有毒元素之一,由于其不可降解性,且在土壤、空氣和水資源中分布廣泛,嚴(yán)重威脅著生態(tài)環(huán)境與人體健康。土壤污染和根系吸收被普遍認(rèn)為是農(nóng)作物Pb的主要來源[1- 2],但是針對(duì)大氣沉降對(duì)作物脅迫效應(yīng)的研究相對(duì)較少。大氣沉降作為區(qū)域土壤重金屬積累的主要途徑,對(duì)農(nóng)作物特別是葉菜類蔬菜的影響不容忽視[3]。大氣沉積物中的Pb具有更強(qiáng)的生物活性[4],它能通過葉表皮、氣孔、水孔等途徑被作物葉片吸收并轉(zhuǎn)移到其他部位,可顯著增加作物Pb含量[5-6]。伴隨著城鎮(zhèn)化與工業(yè)化發(fā)展,汽車尾氣、燃煤燃燒以及各類工業(yè)區(qū)建設(shè)等導(dǎo)致大氣Pb含量升高[7],使得許多地區(qū)農(nóng)作物會(huì)受到大氣、土壤等多污染源重金屬的共同脅迫[8],但其重金屬累積和生長(zhǎng)生理響應(yīng)尚未受到足夠重視,不利于區(qū)域重金屬污染綜合防治和農(nóng)作物安全。

莧菜(AmaranthustricolorL.)作為典型的葉菜類蔬菜,在我國南方地區(qū)廣泛種植[9],且對(duì)重金屬有較強(qiáng)富集能力,易對(duì)人體健康產(chǎn)生潛在危害[10- 11]。莧菜生長(zhǎng)周期較短(60 d左右),耐受性較強(qiáng),是理想的試驗(yàn)作物?？紤]到重金屬大氣沉降中濕沉降部分占比大,且生物有效性更高,更易被植物吸收[12- 13],參照其它研究采用噴灑重金屬溶液的方式模擬大氣重金屬沉降[14- 15]。因此,本文選取莧菜作為供試作物,以典型南方紅壤為供試土壤,并模擬了南方酸性濕沉降(pH=5)。通過室內(nèi)盆栽試驗(yàn),研究了不同濃度土壤與大氣沉降脅迫下,莧菜幼苗體內(nèi)重金屬Pb的累積、化學(xué)形態(tài)以及幼苗生長(zhǎng)和生理響應(yīng)。以揭示大氣沉降-土壤雙重脅迫下蔬菜對(duì)重金屬Pb吸收累積和生理響應(yīng)特征,為多環(huán)境介質(zhì)重金屬污染綜合防治和農(nóng)產(chǎn)品安全生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

從韶關(guān)市曲江區(qū)樟市鎮(zhèn)(113.472199°E,24.555156°N)采集農(nóng)田表層土(0—20 cm)作為供試背景土壤,土壤性質(zhì)如表1所示。土壤去除大顆粒雜質(zhì),自然風(fēng)干,混勻,過1 cm×1 cm篩。為增加土壤養(yǎng)分,向每千克風(fēng)干土壤中添加0.26 g KH2PO4和2.9 g NH4NO3,以溶液的形式與土壤充分混勻[16- 17]。選取華南地區(qū)常見的作物-柳葉莧菜(AmaranthustricolorL.)為供試作為供試植物(購自武漢田園大豐農(nóng)業(yè)科技有效公司),供試盆栽容器為直徑15 cm、高度為11 cm的塑料盆。Pb的污染物為Pb(NO3)2分析純化學(xué)試劑(購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

表1 土壤性質(zhì)

1.2 盆栽模擬實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)考慮大氣沉降與土壤兩個(gè)因素,分別設(shè)置空白、低、高三個(gè)濃度梯度(表2)。

其中土壤濃度設(shè)置參考了農(nóng)用地土壤污染風(fēng)險(xiǎn)管控值(GB15618—2018)以及采礦、冶煉等高污染區(qū)域農(nóng)田Pb含量[18- 19]。模擬大氣沉降參照現(xiàn)有大氣重金屬沉降的研究結(jié)果[20- 21],按照Pb大氣沉降通量污染程度,分別設(shè)置為空白0 mg m-2d-1、低污染0.3 mg m-2d-1、高污染3 mg m-2d-1,換算為噴灑液濃度分別為0、0.71、7.1 mg/L。為顯著區(qū)分不同脅迫濃度對(duì)植物的影響,土壤和噴灑Pb溶液濃度梯度設(shè)置了較大跨度。向預(yù)處理后的土壤中加入不同濃度的Pb(NO3)2溶液,充分?jǐn)嚢杈鶆蚝笃胶鈨蓚€(gè)月。Pb(NO3)2外源添加的N含量?jī)H為NH4NO3的5%—10%,與空白組相比由Pb(NO3)2中N對(duì)植物造成的影響可忽略不計(jì)[16]。莧菜種子在多菌靈溶液中浸泡消毒,播種于裝有不同濃度土壤的塑料盆中。每個(gè)盆栽保持適當(dāng)間距,待莧菜發(fā)芽后每3 d向?qū)?yīng)的處理組(約0.2 m2)噴灑不同濃度的Pb(NO3)2溶液(pH=5)模擬Pb大氣沉降,空白組為稀HNO3溶液(pH=5)。每次250 mL(分為3次,每4h 1次),共噴灑5次,噴灑溶液時(shí)用塑料薄膜對(duì)其它處理組進(jìn)行遮擋,防止相互影響。各處理組設(shè)置3個(gè)平行樣品,共27盆。盆栽實(shí)驗(yàn)在溫室中進(jìn)行并暴漏在自然光照下,早晚各澆水一次保持土壤濕潤(rùn),發(fā)芽后15 d采集莧菜幼苗樣品。

表2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3 植物樣品采集與分析

待莧菜發(fā)芽后15 d采集植物樣本,用去離子水洗滌以去除附著在植物表面的雜質(zhì),后自然風(fēng)干。記錄植物樣品鮮重、株高和根長(zhǎng),樣品在70 ℃下干燥至恒重后記錄干重。耐受指數(shù)由公式1計(jì)算[22],含水率由公式2計(jì)算。

耐受指數(shù) (%) = (根長(zhǎng)Pb脅迫組/根長(zhǎng)對(duì)照組) × 100

(1)

含水率 (%) = (1-干重 /鮮重) × 100

(2)

1.3.1植物Pb含量與化學(xué)形態(tài)的測(cè)定

將收獲的植株浸泡在20 mmol Na2-EDTA溶液中20 min,去除吸附在蔬菜表面的Pb,后用去離子水沖洗。Pb的化學(xué)形態(tài)采用植物鮮樣測(cè)定,Pb總量采用植物干樣測(cè)定。參照朱光旭等人的方法用五種萃取劑依次提取植物體內(nèi)Pb的化學(xué)形態(tài)[23]。采用混合酸HNO3和HClO4(4∶1)消解所有植物樣品,采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-OES, iCAP 7000, Thermo Fisher Scientific, USA)測(cè)定樣品Pb含量。

1.3.2植物生理指標(biāo)的測(cè)定

植物體內(nèi)的可溶性蛋白、過氧化氫(H2O2)、丙二醛(MDA)、抗壞血酸(AsA)、谷胱甘肽(GSH)含量和超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)活性均采用生物試劑盒測(cè)定(購自南京建成生物工程研究所有限公司)[24]。新鮮植物樣品用預(yù)冷的磷酸緩沖液(pH=7.3)研磨,勻漿液在2500 r/min離心15 min,取上清液測(cè)定上述指標(biāo),整個(gè)實(shí)驗(yàn)在4 下進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為三個(gè)平行獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和LSD多重比較(P<0.05)分析不同處理組間的差異。采用2×3的雙因素方差分析(two-way ANOVA)分析土壤與大氣Pb脅迫對(duì)植物的影響程度。采用SPSS軟件進(jìn)行主成分分析(PCA)和皮爾遜相關(guān)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 土壤與大氣脅迫下Pb在莧菜幼苗體內(nèi)的累積與化學(xué)形態(tài)

植物Pb含量隨土壤和大氣濃度的增加而上升,與對(duì)照組相比高濃度土壤和大氣單組脅迫組植物Pb含量分布增加了64.91 mg/kg和45.74 mg/kg(圖1)。土壤和大氣共同脅迫對(duì)植物Pb含量均有明顯提升作用,并在HSHA處理組達(dá)到最大值141.27mg/kg。雙因素方差分析結(jié)果表明(表3),土壤和大氣脅迫濃度對(duì)植物Pb含量均存在顯著影響(P<0.05),其中土壤脅迫濃度對(duì)植物Pb含量的影響較大占62.64%,大氣脅迫濃度影響較小占32.89%,且兩者之間存在交互作用(P<0.05)。由此可推斷土壤與大氣雙重污染源脅迫下植物中的Pb主要來源于根系對(duì)土壤中Pb的吸收,大氣沉降對(duì)植物Pb含量的貢獻(xiàn)較小,但不容忽視。同一土壤濃度下,高、低濃度大氣沉降都能有效增加植物Pb含量。大氣沉降中的Pb可以直接或間接地進(jìn)入植物體內(nèi),沉積在葉片上的Pb通過葉片表皮、角質(zhì)層和氣孔直接進(jìn)入植物葉片組織,而沉積在土壤中的Pb則通過根系吸收間接進(jìn)入植物[25]。雙因素方差分析在重金屬源分析方面存在一定局限性,后續(xù)研究會(huì)采用同位素技術(shù)更精確的分析不同污染源對(duì)植物中Pb的貢獻(xiàn)率。

圖1 不同濃度土壤和大氣脅迫下莧菜幼苗體內(nèi)鉛的含量和化學(xué)形態(tài)Fig.1 Chemical forms and content of Pb in Amaranthus tricolor L. seedlings under different concentrations of soil and atmospheric stresses數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3),不同小寫字母分別表示各處理之間有顯著差異(P<0.05); CK：對(duì)照組;LS：低濃度土壤脅迫;HS：高濃度土壤脅迫;LA：低濃度大氣脅迫;HA：高濃度大氣脅迫;LSHA：低濃度土壤高濃度大氣共同脅迫;HSLA：高濃度土壤低濃度大氣共同脅迫;LSLA：低濃度土壤低濃度大氣共同脅迫;HSHA：高濃度土壤高濃度大氣共同脅迫

表3 莧菜幼苗Pb含量雙因素方差分析結(jié)果

植物中的重金屬以不同的化學(xué)形態(tài)存在,具有不同的遷移能力和生物毒性。萃取劑的極性越強(qiáng),其對(duì)應(yīng)的重金屬形態(tài)遷移能力越弱,對(duì)植物的毒性越小[26]。在本研究中(圖1),不同濃度土壤和大氣脅迫下植物體內(nèi)Pb的化學(xué)形態(tài)以鹽酸提取態(tài)(37%—64%)為主,其次為醋酸提取態(tài)(10%—25%)、氯化鈉提取態(tài)(6%—17%)和水提取態(tài)(8%—16%),其他形態(tài)較少。一些研究者在宿根花卉和菊科植物中也發(fā)現(xiàn)類似分布規(guī)律[23,27]。這一現(xiàn)象說植物中的Pb主要與不溶性磷酸鹽和不溶性草酸鹽結(jié)合,這有利于減小Pb的生物有效性,減輕其對(duì)植物的毒害作用[28]。與對(duì)照組相比,植物Pb乙醇提取態(tài)比例在土壤與大氣單獨(dú)脅迫下均下降了10%,土壤和大氣的共同脅迫作用更加明顯,LSHA、HALA、LSLA、HSHA四個(gè)處理組Pb乙醇提取態(tài)比例都下降到只剩1%。同時(shí)植物Pb鹽酸提取態(tài)比例隨土壤和大氣脅迫濃度增加而提高,在HSLA和HSHA處理組達(dá)到最大,為對(duì)照組的3.25倍。土壤和大氣脅迫使得植物中的Pb從無機(jī)態(tài)和水溶態(tài)等高活性化學(xué)形態(tài)向不溶性草酸鹽等低毒性化學(xué)形態(tài)轉(zhuǎn)變,這可能是因?yàn)橹参矬w內(nèi)含量大量的蛋白質(zhì)和多糖等物質(zhì),其表面豐富的羥基、羧基、氨基、醛基、巰基等官能團(tuán)和磷酸鹽能為Pb離子提供配體,從而減弱Pb在植物體內(nèi)的遷移能力和毒性[29- 30]。

2.2 土壤與大氣脅迫下Pb對(duì)莧菜幼苗生長(zhǎng)的影響

生長(zhǎng)參數(shù)是評(píng)價(jià)植物對(duì)環(huán)境污染響應(yīng)的最佳指標(biāo)之一。植物的株高、鮮重、干重在Pb脅迫下表現(xiàn)出相似的規(guī)律,大氣單獨(dú)脅迫(LA、HA處理組)對(duì)植物的生長(zhǎng)表現(xiàn)為促進(jìn)作用,其他土壤脅迫和土壤大氣共同脅迫處理組均為抑制作用(表4)。植物的鮮重和干重在HSHA處理組達(dá)到最小值,與對(duì)照組相比分別減少了53.8 mg和4.37 mg。植物根長(zhǎng)和耐性指數(shù)在高濃度土壤脅迫下(HS、HSLA、HSHA處理組)減小(11%—22%),大氣單獨(dú)脅迫下(LA、HA處理組)增加(22%—33%),其他處理組變化不明顯。植物含水率在各實(shí)驗(yàn)組間無顯著變化。植物對(duì)重金屬的耐受程度可以通過耐受指數(shù)來反映,當(dāng)其大于50%時(shí)說明植物對(duì)該重金屬有較強(qiáng)的耐受性[31],本實(shí)驗(yàn)中耐受指數(shù)最小值為77.78%,說明莧菜幼苗在此Pb脅迫環(huán)境下生長(zhǎng)良好。雙因素方差分析結(jié)果表明多源脅迫下植物的生長(zhǎng)參數(shù)(除含水率外)主要受到土壤Pb濃度的影響,大氣沉降影響不顯著(表5)。大氣單獨(dú)脅迫下(LA、HA處理組)植物生長(zhǎng)參數(shù)都高于對(duì)照組,這可能是因?yàn)槌两翟谕寥乐械腜b含量較低,對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育有促進(jìn)作用。在他人的研究中Pb對(duì)類蘆、中華常春藤和紫茉莉的生長(zhǎng)也表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)高濃度抑制作用[32- 34]。HS與HA處理組植物Pb含量沒有顯著性差異,但HS組鮮重遠(yuǎn)低于HA組。這可能是因?yàn)镠S組植物中的Pb全部來源于根部從土壤吸收,并在根部大量累積,而HA組大氣沉降中的Pb可通過植物葉片吸收更多的儲(chǔ)存于地上部分。HS組高濃度Pb對(duì)根細(xì)胞造成氧化損傷,影響植物吸收水分和營養(yǎng)元素,從而抑制植物的生長(zhǎng)發(fā)育[35]。

表4 土壤和大氣沉降Pb脅迫對(duì)莧菜幼苗生長(zhǎng)的影響

2.3 土壤與大氣脅迫下莧菜幼苗對(duì)Pb的生理響應(yīng)

表5 莧菜生長(zhǎng)參數(shù)雙因素方差分析結(jié)果

圖2 土壤和大氣中Pb對(duì)莧菜幼苗生理指標(biāo)的影響Fig.2 Influence of Pb in soil and atmosphere on physiological indexes of Amaranthus tricolor L.數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3),不同小寫字母分別表示各處理之間有顯著差異(P<0.05);MDA：丙二醛 Malondialdehyde；SOD：超氧化物歧化酶 Superoxide Dismutase；POD：過氧化物酶 Peroxidase；CAT：過氧化氫酶 Catalase；AsA：抗壞血酸 Ascorbic Acid；GSH：谷胱甘肽 Glutathione

SOD能將超氧陰離子轉(zhuǎn)化為H2O2和O2,是植物抗氧化系統(tǒng)的第一道防線,此外POD和CAT在植物細(xì)胞清除H2O2中也起重要作用[41]。在本研究中(圖2),SOD活性隨土壤和大氣濃度先增加(29%—34%)后下降(10%—13%),但都高于對(duì)照組。POD活性隨土壤和大氣濃度上升而增加(16%—50%),在高濃度土壤脅迫(HS、HSLA、HSHA處理組)下達(dá)到最大活性。CAT活性在Pb脅迫下也都有所增加(35%—49%)。其他研究發(fā)現(xiàn)Pb脅迫對(duì)蕎麥、印度莧菜和魚腥草體內(nèi)抗氧化酶的活性同樣具有提高作用[35,42- 43]。Pb脅迫下植物通過提高三種抗氧化酶活性清除過量的超氧自由基和H2O2保護(hù)細(xì)胞免受活性氧侵害,SOD活性降低的原因可能是H2O2與酶的相互作用或Pb離子與其活性位點(diǎn)的結(jié)合導(dǎo)致失活[35]。POD和CAT在Pb脅迫下表現(xiàn)出相似的響應(yīng)模式,說明它們?cè)谇宄鼿2O2方面可能具有協(xié)同效應(yīng),從而降低植物的氧化損傷。AsA含量隨土壤和大氣濃度增加而上升(25%—69%),相比于大氣沉降,土壤脅迫下植物AsA含量增加更為顯著(圖2)。植物GSH含量在土壤與大氣單獨(dú)脅迫下均無明顯變化,但土壤與大氣共同脅迫對(duì)GSH含量提升作用顯著(40%—71%)(圖2)。AsA和GSH是植物細(xì)胞中重要的氧化還原因子,通過清除活性氧調(diào)節(jié)植物的氧化應(yīng)激反應(yīng),維持氧化還原平衡。AsA和GSH含量的增加可以促進(jìn)植物細(xì)胞AsA-GSH循環(huán),加速H2O2的清除[42]。同時(shí),GSH中的巰基(-SH)作為高效電子供體/受體能與重金屬結(jié)合形成螯合物。GSH在植物螯合素(PCs)的合成中也起著重要的作用,植物螯合素可以與重金屬結(jié)合并以絡(luò)合物的形式轉(zhuǎn)移到液泡中,降低Pb的毒性[44]。

2.4 土壤和大氣Pb脅迫與莧菜幼苗響應(yīng)參數(shù)相關(guān)性

為進(jìn)一步研究不同濃度土壤和大氣脅迫下植物對(duì)Pb的累積和響應(yīng),對(duì)植物Pb含量、生長(zhǎng)參數(shù)和生理指標(biāo)進(jìn)行了主成分和Pearson相關(guān)性分析。如圖3和表5所示,前兩個(gè)主成分共解釋了80.92%的總方差,其中PC1占58.58%,PC2占22.35%。土壤濃度與植物Pb、MDA、AsA、GSH含量和POD活性呈顯著正相關(guān)(P<0.05),說明植物體內(nèi)Pb含量隨土壤濃度增加,同時(shí)植物受到氧化脅迫程度增加,細(xì)胞膜受損。植物鮮重、干重、株高與可溶性蛋白含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05),說明植物蛋白對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育有重要作用。高、低濃度的大氣脅迫對(duì)植物的生長(zhǎng)都表現(xiàn)為促進(jìn)作用,這可能是因?yàn)榇髿鈬姙b溶液濃度較低,而低濃度的重金屬脅迫能促進(jìn)植物生長(zhǎng)。大氣濃度與植物Pb含量、生長(zhǎng)參數(shù)和生理指標(biāo)相關(guān)性較低,說明大氣沉降對(duì)植物的影響較小。主成分分析還區(qū)分了不同Pb脅迫對(duì)植物的影響,其中LA、HA處理組影響相似,LS、LSLA、LSHA處理組影響相似,HS、HSLA、HSHA處理組影響相似,所有處理組均與對(duì)照組顯著不同。說明土壤和大氣Pb脅迫對(duì)莧菜幼苗的Pb含量和生長(zhǎng)發(fā)育都有顯著影響,其中土壤脅迫的影響較大,而大氣脅迫的影響有限。

圖3 土壤和大氣Pb脅迫與莧菜幼苗響應(yīng)參數(shù)的主成分和相關(guān)性分析Fig.3 Principal components and correlation analysis of response parameters of Amaranthus tricolor L. seedlings to Pb stress in soil and atmosphere*表示在0.05水平上顯著相關(guān)

3 結(jié)論

在模擬的土壤-大氣Pb脅迫環(huán)境下,莧菜幼苗Pb含量不僅受到土壤重金屬的影響(62.64%),也受到大氣脅迫的重要影響(32.89%)。莧菜幼苗體內(nèi)的Pb通過與不溶性草酸鹽結(jié)合,降低值Pb的遷移能力和毒性,從而提高植物對(duì)Pb的耐受程度。莧菜幼苗體內(nèi)抗氧化酶活性增加和AsA-GSH循環(huán)同樣在植物Pb解毒的過程中起到了重要作用。Pb大氣沉降促進(jìn)了莧菜幼苗的生長(zhǎng)和可溶性蛋白的合成,而土壤Pb脅迫都起到了抑制作用,植物對(duì)Pb的生理生化響應(yīng)與土壤濃度有關(guān)。由此可見,在礦山、冶煉廠、燃煤電廠等周邊區(qū)域,農(nóng)作物環(huán)境安全不僅受到土壤Pb污染的影響,大氣沉降污染也不容忽視。對(duì)于這些大氣和土壤重金屬共同脅迫的地區(qū),農(nóng)作物環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)以及污染防治應(yīng)考慮多介質(zhì)污染源的影響。

表6 主成分分析結(jié)果