多源化巨細胞病毒DNA定量檢測在異基因造血干細胞移植后巨細胞病毒肺炎診斷中的應(yīng)用

程昊鈺 楊帆 楊怡欣 張書芹 張永平 張維婕 費新紅 殷宇明 顧江英 王靜波

巨細胞病毒（cytomegalovirus，CMV）感染是造血干細胞移植后常見并發(fā)癥之一，嚴重影響受者預(yù)后，其中CMV肺炎是造血干細胞移植失敗和受者死亡的重要原因[1-2]。CMV肺炎占移植后CMV病的40%～60%，病死率高達30%～50%[3]。CMV肺炎診斷的金標準為肺活組織檢查（活檢）中檢測到典型病毒包涵體，或通過免疫組織化學(xué)染色、原位雜交檢測到細胞內(nèi)病毒。然而，肺活檢風(fēng)險較高，目前CMV肺炎的確診主要依賴于氣道分泌物中找到病毒包涵體、特異性抗原或DNA片段，其首選檢查方法為纖維支氣管鏡鏡檢+肺泡灌洗，由于纖維支氣管鏡鏡檢受到受者血象、凝血功能等的限制，CMV肺炎的診斷很大程度上依靠痰液、血漿CMV DNA檢測及影像學(xué)檢查。

本研究回顧性分析接受異基因造血干細胞移植的受者中CMV肺炎的發(fā)生情況，分析CMV肺炎受者不同來源標本的CMV DNA載量，總結(jié)其對診斷CMV肺炎的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料與分組

回顧性分析2017年1月至2019年10月在航天中心醫(yī)院接受異基因造血干細胞移植的405例受者的臨床資料，移植前所有受者CMV IgM檢測結(jié)果陰性。所有受者的移植術(shù)后隨訪時間6個月以上。405例受者中，診斷為CMV肺炎的19例受者設(shè)為CMV肺炎組，其中男16例，女3例，年齡36（16，52）歲，包括3例非血緣全相合造血干細胞移植和16例單倍體移植。原發(fā)病包括急性髓細胞白血病14例，急性淋巴細胞白血病4例，慢性髓系白血病1例。

選取同期僅發(fā)生CMV血癥（血漿CMV DNA載量>500 copies/mL）的229例受者設(shè)為對照A組，接受纖維支氣管鏡鏡檢的11例非CMV肺炎受者設(shè)為對照B組，根據(jù)病原學(xué)證據(jù)確診細菌或真菌性肺炎進行痰培養(yǎng)的16例受者設(shè)為對照C組。3個對照組的基線資料分別為：對照A組，男148例，女81例，年齡32（20，43）歲，急性髓細胞白血病153例，急性淋巴細胞白血病62例，骨髓增生異常綜合征6例，急性混合細胞白血病5例，再生障礙性貧血3例；對照B組，男7例，女4例，年齡32（23，42）歲，急性髓細胞白血病8例，急性淋巴細胞白血病3例；對照C組，男12例，女4例，年齡34（25，49）歲，急性髓細胞白血病11例，急性淋巴細胞白血病4例，再生障礙性貧血1例。CMV肺炎組與3個對照組受者之間的基線資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均為P>0.05）。

1.2 預(yù)處理方案

19例CMV肺炎受者中有9例采用白消安（busulfan，Bu）+環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）基礎(chǔ)上聯(lián)合去甲氧柔紅霉素（idarubicin，IDA），加或不加FLAG [氟達拉濱（ fludarabin，F(xiàn)Lu）+阿糖胞苷（cytosine arabinoside，Ara-C）+粒細胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）]或CLAG [克拉屈濱（cladribin，CLA）+Ara-C+G-CSF]的預(yù)處理方案，9例采用全身照射（total-body irradiation，TBI）+Ara-C+CTX或TBI+FLAG或TBI+CLAG加或不加IDA的預(yù)處理方案，1例采用TBI+塞替派+奈拉濱+巰嘌呤的預(yù)處理方案。

1.3 造血干細胞移植及隨訪情況

19例CMV肺炎受者白細胞均成功植入，植入時間為15（9，28）d；12例CMV肺炎受者血小板成功植入，植入時間為16（9，75）d。白細胞植入標準為外周血中性粒細胞連續(xù)3 d超過0.5×109/L；血小板植入標準為血小板脫離輸注后連續(xù)7 d超過20×109/L。通過聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)檢測DNA指紋圖，供、受者性別不同時可通過熒光原位雜交技術(shù)檢測性染色體。移植術(shù)后根據(jù)原發(fā)病情況，每3～4周行骨髓穿刺檢查，半年后每2～3個月行骨髓穿刺檢查。

1.4 移植物抗宿主病的預(yù)防

單倍體及非血緣移植受者在-5～-2 d加用抗人T細胞免疫球蛋白（anti-human T lymphocyte immunoglobulin，ALG）（德國萌蒂公司，25 mg/kg）或抗胸腺細胞球蛋白（antithymocyte globulin，ATG）（法國賽諾菲公司，8 mg/kg）。所有受者給予環(huán)孢素（ciclosporin，CsA）+嗎替麥考酚酯（mycophenolate mofetil，MMF）+短程小劑量甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）預(yù)防移植物抗宿主疾病（graft-versus-host disease，GVHD）。GVHD按照美國西雅圖標準進行診斷和分級[4]。

1.5 CMV感染的預(yù)防及監(jiān)測

所有受者于預(yù)處理的-5～-2 d給予更昔洛韋，術(shù)后1 d給予阿昔洛韋。移植術(shù)中所有血制品未做CMV抗體檢測，輸注的血制品常規(guī)采用2 500 cGy照射。全部患者于白細胞植入開始采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）法檢測血漿的CMV DNA，每周2次直至移植術(shù)后3～6個月，此后根據(jù)受者情況每周或隔周檢測1次，直至停用全部免疫抑制劑。出現(xiàn)呼吸道癥狀的受者，同時檢測痰液的CMV DNA。行纖維支氣管鏡檢查的受者檢測支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）的CMV DNA。RT-PCR測定血漿、痰液和BALF標本，CMV DNA載量>500 copies/mL即為陽性。

1.6 CMV肺炎的診斷與治療

移植后CMV肺炎診斷標準：（1）移植后受者出現(xiàn)發(fā)熱、咳嗽、咳痰、呼吸困難等癥狀，伴或不伴有低氧血癥；（2）胸部CT檢查示肺部彌漫性磨玻璃影或斑片狀陰影或間質(zhì)性改變，伴或不伴有胸腔積液；（3）RT-PCR法檢測纖維支氣管鏡鏡檢BALF的CMV DNA載量>1 000 copies/mL。（4）血漿CMV DNA陽性，CMV DNA載量>1 000 copies/mL，不能單純用其他肺部感染或肺部GVHD解釋的肺部病灶。（5）抗病毒治療有效。具備上述標準的第1～2條，同時符合第3～5條中的任意1條即可診斷。

CMV肺炎治療方案包括：（1）CMV肺炎受者首選給予更昔洛韋治療，1周后效果不佳、白細胞或血小板較前下降的受者則改用膦甲酸鈉。（2）對于單藥（更昔洛韋或膦甲酸鈉）治療效果不佳的受者，可給予更昔洛韋聯(lián)合膦甲酸鈉治療，至CMV DNA連續(xù)2次陰性后停藥。抗病毒同時可加用人免疫球蛋白輔助治療。（3）當受者抗病毒治療后出現(xiàn)白細胞或血小板下降及腎功能不全，且抗病毒治療無效時，可給予CMV特異性靜脈注射用免疫球蛋白（CMV-intravenous immunoglobulin，CMV-IVIG），或給予供者CMV特異性細胞毒T淋巴細胞（CMV-cytotoxic T lymphocyte，CMV-CTL）輸注（但其有可能導(dǎo)致GVHD加重的風(fēng)險），同時僅給予預(yù)防量的阿昔洛韋。

1.7 研究內(nèi)容

總結(jié)CMV肺炎的發(fā)生情況，包括CMV肺炎的發(fā)生率、發(fā)生時間、臨床癥狀、影像學(xué)表現(xiàn)以及合并感染情況；分析CMV肺炎受者不同來源（血漿、痰液、BALF）標本的CMV DNA載量，分別與對照A、B、C組比較；總結(jié)CMV肺炎受者的預(yù)后情況。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。對于非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（下四分位數(shù)，上四分位數(shù)）表示，組間比較采用秩和檢驗；計數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CMV肺炎的發(fā)生情況

405例異基因造血干細胞移植受者中有19例發(fā)生了CMV肺炎，CMV肺炎總體發(fā)生率為4.7%（19/405）。19例CMV肺炎受者中，13例發(fā)生于移植后3個月內(nèi)，4例發(fā)生于移植后3～6個月，2例發(fā)生于移植后6個月后。405例異基因造血干細胞移植受者中，單倍體及非血緣移植受者有308例預(yù)處理應(yīng)用ALG，其中17例發(fā)生CMV肺炎，34例預(yù)處理應(yīng)用ATG，其中2例發(fā)生CMV肺炎，CMV肺炎發(fā)生率均為6%，兩者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

19例CMV肺炎受者的臨床癥狀包括16例咳嗽、咳痰，15例伴有低氧血癥，10例雙肺濕啰音（其中5例同時伴有干啰音），9例胸悶、氣短，8例出現(xiàn)痰中帶血或咯血，6例出現(xiàn)發(fā)熱。CMV肺炎的影像學(xué)表現(xiàn)并不特異，需結(jié)合其他臨床表現(xiàn)進行診斷。CMV肺炎受者中，16例表現(xiàn)為彌漫性磨玻璃影，8例表現(xiàn)為彌漫性小結(jié)節(jié)影，6例表現(xiàn)為多發(fā)斑片狀實變影，3例有樹芽征或網(wǎng)格影，6例合并有胸腔積液。

19例CMV肺炎受者中，11例合并肺部GVHD，6例合并肺部真菌感染，3例合并肺部細菌感染（包括銅綠假單胞菌1例、溶血性葡萄球菌1例、鮑曼不動桿菌1例）。

2.2 CMV肺炎受者多源化標本的CMV DNA載量

19例CMV肺炎受者中18例在診斷CMV肺炎時的血漿CMV DNA為陽性，僅1例在診斷后1周血漿CMV DNA才轉(zhuǎn)為陽性。CMV肺炎受者的血漿 CMV DNA載量為 7.41×103（1.20×103，1.25×105）copies/mL，高于對照 A 組的 1.79×103（5.0×102，8.43×104）copies/mL（P<0.05）。

6例CMV肺炎受者進行了纖維支氣管鏡檢查，BALF的 CMV DNA均為陽性，CMV DNA載量為1.42×104（6.48×103，2.18×106）copies/mL，高于對照B組的2.34×102（0，2.28×104）copies/mL（P<0.05）。

15例CMV肺炎受者進行了痰液CMV DNA檢測，CMV DNA 載量為 5.61×103（0，1.73×107）copies/mL，高于對照C組的0（0，1.04×104）copies/mL（P<0.05）。

2.3 CMV肺炎受者的預(yù)后情況

19例CMV肺炎受者的治療及預(yù)后情況見表1。19例受者中，有12例受者經(jīng)抗病毒治療后治愈，7例受者治療失敗死亡（其中3例放棄治療），病死率為37%（7/19）。

7例死亡受者中，5例受者在一線抗病毒治療的基礎(chǔ)上聯(lián)合應(yīng)用CMV-IVIG治療，其中1例因CMV肺炎合并肺部GVHD出現(xiàn)急性呼吸衰竭，繼而多器官衰竭，最終死亡；2例死于CMV及細菌混合性肺炎所致的呼吸循環(huán)衰竭；2例放棄治療。1例受者聯(lián)合應(yīng)用CMV-IVIG+供者CMV-CTL輸注，后放棄治療。1例受者聯(lián)合應(yīng)用西多福韋+CMV-IVIG治療，死于肺部細菌、真菌及CMV混合感染所致的呼吸循環(huán)衰竭。

表1 CMV肺炎受者的治療及預(yù)后情況Table 1 Treatment and prognosis of recipients with CMV pneumonia

3 討 論

2014年的“CMV藥物開發(fā)論壇”對移植后CMV感染的相關(guān)名詞和定義進行了更新[3]，提出“確診的CMV肺炎”和“擬診的CMV肺炎”的診斷標準。后者的診斷標準為具有肺炎相應(yīng)的臨床癥狀、體征，BALF中CMV分離、培養(yǎng)或CMV DNA定量檢測陽性。由于肺活檢對于移植后受者存在較高風(fēng)險，受者配合度較低，所以在臨床上移植后確診的CMV肺炎很少，大多為擬診的CMV肺炎。本研究中CMV肺炎的臨床診斷標準即以此標準作為參考。

目前CMV肺炎的實驗室檢測包括CMV DNA檢測、CMV抗原檢測、CMV血清抗體檢測、CMV培養(yǎng)以及組織病理學(xué)檢查[5-6]。臨床上應(yīng)用最廣泛的是CMV DNA檢測，其靈敏度高且檢測較快，是臨床診斷CMV感染的重要手段。本研究采用RT-PCR檢測CMV DNA，標本來源包括血漿、痰液和BALF。結(jié)果顯示19例CMV肺炎受者的血漿CMV DNA載量高于CMV血癥受者，15例CMV肺炎受者痰液CMV DNA載量高于非CMV肺炎受者，而6例接受纖維支氣管鏡鏡檢的CMV肺炎受者，其BALF的CMV DNA載量亦高于非CMV肺炎受者。上述結(jié)果均提示，雖然不能僅依靠CMV DNA載量作為CMV肺炎的診斷依據(jù)，但其對診斷具有一定的支持作用，特別是當CMV DNA載量較高時，可結(jié)合受者的臨床表現(xiàn)、影像學(xué)改變作出CMV肺炎的臨床診斷。有類似研究報道，CMV DNA載量>10 000 copies/mL時，CMV肺炎發(fā)生率明顯增加，以此作為抗病毒搶先治療標準[7]。

BALF的CMV DNA檢測是目前診斷CMV肺炎最有價值的手段[8-9]，但其陽性預(yù)測價值較差，正常人群中也可檢出。CMV DNA定量檢測的靈敏度更高，但目前尚未能標準化，缺乏統(tǒng)一的診斷界值。研究表明，CMV肺炎患者BALF的CMV DNA載量明顯高于非CMV肺炎患者[10]。有類似研究顯示BALF的CMV DNA載量5 500 copies/mL對于診斷CMV肺炎的靈敏度為0.91，特異度為0.75[3]。另一方面，BALF的CMV DNA陰性預(yù)測值接近100%，可以排除CMV肺炎的可能性。

19例CMV肺炎受者中，13例發(fā)生于移植后3個月內(nèi)，4例發(fā)生于移植后3～6個月，2例發(fā)生于移植后6個月后。類似研究顯示CMV感染主要發(fā)生在移植后30～90 d[11]，其原因可能與患者的免疫功能缺陷和恢復(fù)時限有關(guān)。本研究中19例CMV肺炎受者中最常出現(xiàn)的癥狀包括咳嗽、咳痰、低氧血癥、胸悶、氣短、痰中帶血，僅6例受者出現(xiàn)發(fā)熱。CT在檢測肺部病灶方面更為敏感，CMV肺炎可表現(xiàn)為斑片狀或彌漫性磨砂玻璃影，網(wǎng)狀混濁，小葉間隔增厚，也可見樹芽征[12]。本研究中16例受者CT表現(xiàn)為磨玻璃影，其病理改變主要為間質(zhì)改變和肺泡損傷。CMV肺炎的影像學(xué)特點可以作為臨床診斷的依據(jù)之一。

近年來由于搶先抗病毒治療以及新型抗病毒藥物的應(yīng)用，CMV肺炎的病死率明顯降低[13-24]。本研究中的19例CMV肺炎受者病死率為37%（7/19），治愈的12例受者中僅2例在給予更昔洛韋或膦甲酸鈉后治愈，其余10例均聯(lián)合了CMV-IVIG和（或）供者CMV-CTL治療。7例受者接受了CMV-IVIG聯(lián)合供者CMV-CTL治療，除1例放棄治療外，其余6例均治愈且未出現(xiàn)不良反應(yīng)，安全性及有效性較高。

造血干細胞移植后CMV肺炎的易感因素包括：供者血清CMV抗體陰性而受者血清抗體陽性、無關(guān)供者或單倍體親緣供者、預(yù)處理強度大、臍血移植、使用大量免疫抑制劑、移植后未給予預(yù)防CMV治療、中重度GVHD及移植后半年內(nèi)受者免疫功能尚未恢復(fù)者[25-27]。多個指南建議移植后100 d內(nèi)應(yīng)至少每周進行外周血血漿CMV DNA檢測。對于上述高危患者，時間應(yīng)延長至移植后6～12個月[28]。

綜上所述，CMV肺炎是造血干細胞移植失敗和受者死亡的重要原因，其臨床診斷需要結(jié)合臨床表現(xiàn)、影像學(xué)特點和CMV DNA檢測。血漿、痰液、BALF的CMV DNA檢測可在一定程度上提高CMV肺炎的診斷率，從而改善異基因造血干細胞移植受者的預(yù)后。