小麥種質(zhì)GLM 1701藍(lán)粒性狀的遺傳定位分析

彭 琴， 周 軍， 徐如宏， 何 方， 任明見

(貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院/國家小麥改良中心貴州分中心， 貴陽 550025)

藍(lán)粒小麥作為糊粉層中富含藍(lán)色花青素的特色小麥種質(zhì)，與普通小麥相比， 含有較高的蛋白質(zhì)和賴氨酸，銅、鐵、錳、鋅4種有色微量元素，且具有很強(qiáng)的抗氧化性[1-4]。高建偉等研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)粒小麥的籽粒藍(lán)色常常與許多優(yōu)良的農(nóng)藝性狀連鎖[5]；Li Z S等經(jīng)過連鎖遺傳分析發(fā)現(xiàn)，粗桿、寬葉、直葉、深綠色及半冬性等許多農(nóng)藝性狀與藍(lán)色胚乳性狀密切相關(guān)[6]。Jia Y.等發(fā)現(xiàn)，藍(lán)色花青素只在大麥、小麥和黑麥中積累，而且小麥族藍(lán)色籽粒是一個新的性狀，最近才進(jìn)化出來[7]。目前藍(lán)粒性狀已被用作理論研究和小麥育種中的遺傳標(biāo)記，用于測量雜交頻率，鑒定真正的雜種，并監(jiān)測染色體變化[8-13]。

藍(lán)粒小麥籽粒之所以呈現(xiàn)藍(lán)色，是由于其糊粉層中含有藍(lán)色色素，使種子呈深藍(lán)色，呈現(xiàn)胚乳直感、顯性遺傳，并具有明顯的劑量效應(yīng)[14]。國內(nèi)外學(xué)者對控制藍(lán)粒性狀的遺傳規(guī)律展開了大量研究，但是不同來源的藍(lán)粒小麥控制籽粒色素基因數(shù)目等基因源問題還存在爭議。相志國等研究表明，藍(lán)粒在遺傳過程中有母本效應(yīng)，類似一對基因控制的遺傳行為，藍(lán)粒性狀基因的表達(dá)有明顯的劑量效應(yīng)，相同的藍(lán)?；蛟谂c小麥中不同的染色體發(fā)生代換，其效應(yīng)完全不同[15]；同一基因控制著的藍(lán)?？蓜澐譃樯?、中、淺三類，在不同的環(huán)境條件下種植，也表現(xiàn)出一定的差別[16]。黃碧光等研究表明，藍(lán)粒的遺傳受1對基因控制，藍(lán)粒為顯性，且控制藍(lán)粒的基因具有劑量效應(yīng)[17]。Hurd等認(rèn)為，藍(lán)粒受2個互補(bǔ)的不完全顯性基因控制[18]；Keppenne等認(rèn)為，藍(lán)粒受2對呈抑制互作的基因控制[19]。蘭素缺等研究發(fā)現(xiàn)，來源于偃麥草的D 87065和D 87089的籽粒色素基因由2對互補(bǔ)基因控制；來源于黑麥的92-1由2對互補(bǔ)基因控制；來源不明確的7083 L-16由1對基因控制[20]。目前已經(jīng)定位的小麥藍(lán)色糊粉層基因有來自長穗堰麥草的4 AgL染色體的Bal基因[21]，來源于百薩堰麥草的BaThb位于4 JL[22]；來源于栽培一粒和野生一粒的Ba2位于4 AL[23-24]；還未定名的，源于中間偃麥草，位于4 J(FL 0.60-1.00)[25]。

BSA(Bulked Segregant Analysis)稱為混合群體分離分析法，是一種通過極端性狀進(jìn)行功能基因挖掘的方法。該方法是用合適的分子標(biāo)記對2個基因池進(jìn)行分析，在2個基因池間存在多態(tài)性的標(biāo)記與目標(biāo)性狀的基因座連鎖[26-27]。BSA雖然SSR標(biāo)記具有高可靠性、穩(wěn)定性和良好重復(fù)性的優(yōu)點，但是它們在基因定位中與BSA(例如RAPD，AFLP，SSR)結(jié)合使用有許多分子標(biāo)記，它們對某種變化具有特異性。對基因進(jìn)行靶向定位仍然是耗時且勞動密集的，并且難以同時進(jìn)行大量料或靶基因的大規(guī)模定位篩選。隨著DNA測序技術(shù)的發(fā)展，SNP標(biāo)記被發(fā)現(xiàn)且廣泛用于構(gòu)建動物和植物遺傳連鎖圖譜，SNP標(biāo)記具有數(shù)量多，密度高，遺傳穩(wěn)定性高，易于自動檢測等優(yōu)點。因此，SNP正在迅速取代傳統(tǒng)標(biāo)記，例如RFLP和SSR。BSA+基因芯片方法可以快速檢測2種不同表型之間的遺傳差異[28-29]。SNP突變及其染色體片段比全基因組基因定位更準(zhǔn)確。目前很多研究者通過這種方法完成了許多基因的定位，趙秋實等[30]通過BSA法結(jié)合660 K基因芯片以及SSR分子標(biāo)記技術(shù)成功將矮桿基因定位于1 A染色體上。蔣宏寶等[31]利用BSA法結(jié)合小麥660 K基因芯片將小麥葉綠素缺失突變體B 23定位于7 AL染色體上。

GLM 1701是貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院國家小麥改良中心貴州分中心通過遠(yuǎn)緣復(fù)合雜交創(chuàng)制的藍(lán)粒小麥新種質(zhì)。本研究通過常規(guī)雜交構(gòu)建遺傳群體結(jié)合660 K基因芯片技術(shù)進(jìn)行遺傳分析和基因定位，以期為合理有效地利用藍(lán)粒小麥新種質(zhì)GLM 1701提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究所用材料為GLM 1701(藍(lán)粒)、貴農(nóng)19(白粒)、貴農(nóng)麥30號(白粒)、中燕96-3(白粒)和綿麥301(白粒)，均由貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院國家小麥改良中心貴州分中心提供，并在該中心試驗地種植。

1.2 遺傳群體構(gòu)建

藍(lán)粒小麥品種GLM 1701分別與白粒小麥品種貴農(nóng)19號、貴農(nóng)麥30號、中燕96-3和綿麥301進(jìn)行正反雜交構(gòu)建F1群體，將收獲的F1世代夏播加代繁殖，對F1世代群體單株進(jìn)行套袋自交，構(gòu)建F2分離群體，于2018年11月將F2群體種植在貴州大學(xué)教學(xué)實驗場國家小麥改良中心貴州分中心小麥育種科研基地，于2019年3月底3葉時進(jìn)行單株編號，待長到4～5葉時，每單株取1～2片葉備提取DNA，構(gòu)建F2∶3群體，5月份按單株收獲，并進(jìn)行單株粒色統(tǒng)計。

1.3 遺傳分析

將收獲的全部F1，BC1F1、F2中群體中不能區(qū)分的藍(lán)色籽粒和籽粒橫切成兩半，含胚的一半用來繼續(xù)種植，另一半用來觀察糊粉層顏色，統(tǒng)計F1、BC1F1、F2群體各個組合藍(lán)粒、白粒比例。

1.4 基因定位及群體驗證

根據(jù)F3單株粒色結(jié)果，在貴農(nóng)19×GLM 1701組合中選取F2純藍(lán)粒和純白粒各40個單株葉片分別組建顏色性狀混池，利用賈繼增等與Affymetrix聯(lián)合研發(fā)的660 K基因芯片對2個親本和BSA混池進(jìn)行SNP基因分型，這部分工作主要在北京博奧生物技術(shù)有限公司完成。

根據(jù)芯片結(jié)果，對貴農(nóng)19×GLM 1701組合雙親及混池進(jìn)行篩選，找出具有多態(tài)性的標(biāo)記對其F2∶3群體進(jìn)行基因定位和驗證。單株葉片DNA提取參照徐如宏等[32]改良的CTAB法提取基因組。PCR反應(yīng)體系為10 μL：模板DNA(100 ng·μL-1)2.0 μL、primer(10 μmol·L-1)1.0 μL、TagE(5 U·μl-1)0.1 μL、dNTP(2.5 mmol·L-1)0.2 μL、10×Buffer(Mg2+)(5 mmol·L-1)1.2 μL、ddH2O 4.5 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min， 50～60 ℃(根據(jù)不同引物決定)退火1 min，72 ℃延伸2 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用8%的非變性的聚丙烯酰胺凝膠，銀染法檢測。顯影后，在白熾燈下觀察電泳結(jié)果，進(jìn)行條帶統(tǒng)計和照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳群體籽粒顏色性狀的表現(xiàn)

利用藍(lán)粒小麥種質(zhì)(GLM 1701)與白粒小麥品種(貴農(nóng)19號、貴農(nóng)30號、中燕96-3、綿麥301)作為親本，分別組配正反交F1、F2和BC1F1群體，對各個群體籽粒顏色性狀進(jìn)行觀察統(tǒng)計(表1)。

表1 相關(guān)世代群體籽粒顏色性狀的表現(xiàn)

由表1可知，F(xiàn)1世代籽粒顏色深淺與藍(lán)粒親本作為父本或母本有關(guān)，當(dāng)藍(lán)粒親本GLM 1701作為母本時，F(xiàn)1籽粒顏色表現(xiàn)為中藍(lán)色，當(dāng)藍(lán)粒親本GLM 1701作為父本時，F(xiàn)1籽粒顏色表現(xiàn)為淺藍(lán)色，說明藍(lán)粒為顯性，存在劑量效應(yīng)。正反交F2世代籽粒的顏色均表現(xiàn)出藍(lán)白粒分離；回交中正反交F1與白粒親本進(jìn)行正反回交，BC1F1都是出現(xiàn)藍(lán)粒和白粒，正反交F1與藍(lán)粒親本進(jìn)行正反回交，BC1F1只有藍(lán)粒。結(jié)果表明，GLM 1701的藍(lán)粒性狀為顯性性狀，且存在劑量效應(yīng)。

2.2 遺傳群體F2代群體籽粒顏色的分析

利用GLM 1701與貴農(nóng)19號、貴農(nóng)30號、中燕96-3、綿麥301進(jìn)行正反交，調(diào)查統(tǒng)計其正反交F2群體的籽粒顏色，通過卡方檢驗分析藍(lán)粒與白粒的分離比例(表2)。

表2 F2代群體籽粒顏色的分離情況

由表2可知，各雜交組合F2發(fā)生藍(lán)粒和白粒的分離，且藍(lán)粒與非藍(lán)粒的數(shù)目相當(dāng)，分離比例為5∶4，藍(lán)粒有深淺之分，體現(xiàn)劑量效應(yīng)。

2.3 遺傳群體BC1F1群體籽粒顏色的分析

利用GLM 1701與綿麥301、貴農(nóng)30號、中燕96-3和貴農(nóng)19號進(jìn)行正反交構(gòu)建F1群體，正反交F1再與雙親進(jìn)行正反回交，調(diào)查統(tǒng)計其回交群體BC1F1的籽粒顏色(表3)。

圖1GLM 1701藍(lán)粒性狀胚乳基因的遺傳模式

由表3可知，正反交F1與白粒親本進(jìn)行正反回交，BC1F1代群體藍(lán)粒∶白粒為1∶2，正反交F1與GLM 1701進(jìn)行正反回交，BC1F1代群體全為藍(lán)粒。

表3 BC1F1代群體籽粒顏色的分離情況

2.4 F2分離比例的驗證

綜合回交群體分析表明，當(dāng)正反交F1作為母本與白粒親本回交時，BC1F1群體藍(lán)粒與白粒的比例都是1∶2，說明含藍(lán)粒基因的配子約占雌配子總數(shù)的33%，而理論上含藍(lán)?；虻男叟渥诱即婆渥涌倲?shù)的50%，因此藍(lán)?；蛲ㄟ^雌配子的傳遞率約為67%(33%/50%)。同樣當(dāng)正反交F1作為父本與白粒親本回交，BC1F1群體藍(lán)粒與白粒的比例同是1∶2，說明藍(lán)粒基因通過雌配子的傳遞率也約為67%(33%/50%)。綜合分析得出，含藍(lán)粒基因的配子約占雌或雄配子總數(shù)的33%，傳遞率均只有67%。

因含藍(lán)?；虻拇啤⑿叟渥拥膫鬟f率降低，造成了F2藍(lán)粒與非藍(lán)粒的比例失真，不符合正常的孟德爾遺傳，根據(jù)測交結(jié)果得出的藍(lán)?；虼菩蹅鬟f率推算F1產(chǎn)生2種配子在雌雄配子中的比例，據(jù)此可算出F2代各種類型的比例。用A表示藍(lán)?；颍琣表示非藍(lán)?；?，藍(lán)粒是由2 n的極核與n的精細(xì)胞結(jié)合而形成的三倍體胚乳糊粉層性狀，所以用AA和aa分別表示2種雌配子，三核胚乳的基因型有4種：AAA、AAa、Aaa和aaa。從表4可看出，在F2中，A_∶aa，即藍(lán)?！梅撬{(lán)粒=(1+2+2)∶4 =5∶4，理論上藍(lán)粒在F2中的比例為56%，非藍(lán)粒為44%。這與實際中F2非藍(lán)粒與藍(lán)粒數(shù)目相當(dāng)?shù)那闆r相吻合。各組合F2藍(lán)粒與非藍(lán)粒的比例通過卡方驗證p>0.5(表2)。說明正是含藍(lán)?；虼菩叟渥觽鬟f率的下降，造成F2藍(lán)與非藍(lán)粒比例不符合3∶1。綜合自交F2和回交BC1F1得出，GLM 1701的藍(lán)粒性狀是由一對主效基因控制。

表4 F1代2種配子在雌雄配子中的比例與F2代4種胚乳基因型的理論比例

假設(shè)藍(lán)粒小麥種質(zhì)GLM 1701胚乳的基因型為AAA，白粒小麥品種貴農(nóng)30號和貴農(nóng)19號胚乳的基因型為aaa，其胚乳遺傳模式如圖1所示。

2.5 藍(lán)粒基因定位及驗證

2.5.1SNP芯片測序結(jié)果分析

運(yùn)用小麥660 K基因芯片分別對貴農(nóng)19×Glm 1701組合2個極端混池以及雙親進(jìn)行全基因組檢測。將在2個混池以及雙親間均表現(xiàn)差異的SNP進(jìn)行比較整合，基于質(zhì)控后獲得2個混池及2個親本間共同表現(xiàn)差異的SNP共有301個。根據(jù)660 K芯片遺傳整合圖譜信息，將表現(xiàn)出差異的SNP整合到小麥21條染色體上(圖2)。由圖2可知，1 A、3 A、1 B、3 B、5 D五條染色體上沒有差異SNP，4 D染色體上差異SNP分布達(dá)到205個，約占總SNP的68%；4 B、4 A和6 D染色體上分別分布13個差異SNP，5 A染色體上分布26個差異SNP，約占總SNP的22%，其余的差異SNP分散分布在其他染色體。推測控制藍(lán)粒性狀的基因位于4 D染色體上。

圖2 差異SNP的染色體分布

注：Maker為100 bp DNA Ladder，1～48為F2群體里藍(lán)粒單株，目標(biāo)條帶位置為194 bp左右。

注：Maker為100 bp DNA Ladder，1～48為F2群體里白粒單株。

2.5.2基因定位及群體驗證

根據(jù)芯片結(jié)果選用位于4 D染色體上[33-34]的58對標(biāo)記對貴農(nóng)19×GLM 1701組合雙親及混池進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)Xgwm 165標(biāo)記能在雙親和混池中有差異。

將特異性標(biāo)記Xgwm 165對貴農(nóng)19×GLM 1701正反交F2群體進(jìn)行PCR分析，所獲結(jié)果見表5。根據(jù)表5數(shù)據(jù)，用軟件Joinmap 4.0計算，Xgwm 165標(biāo)記與GLM 1701遺傳距離為5.8 cM。此結(jié)果證明控制GLM 1701藍(lán)粒性狀的基因位于4 D染色體。

表5 群體交換單株統(tǒng)計

同時，用其他各個組合的F2∶3群體對標(biāo)記Xgwm 165進(jìn)行驗證，部分結(jié)果見圖3、圖4。在后代材料的檢測中，除其中1株未擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，其它均能擴(kuò)增出194 bp目標(biāo)條帶，與F2粒色統(tǒng)計結(jié)果基本一致，說明標(biāo)記Xgwm 165與藍(lán)?；蚴沁B鎖的。

2.5.3特性標(biāo)記Xgwm 165定位

對特異性標(biāo)記Xgwm 165的PCR產(chǎn)物進(jìn)行T載體克隆，在成都擎科生物技術(shù)有限公司完成?？寺〉玫絏gwm 165的序列為：TGCAGTGGTCAGAGTTTTCCCAGGCCACAGATGAGCAAAAGAAATCTTTTGTTGTCCAGCGTTGTCTAATCTTGCCTTGCGAATAGTACTTTTGAGCAGCTCAAGGAGAGAGAGGGAGAGAGAGAGAGAGAGAGCGCGCGCGCAAACAAAGATAGCAAAGAATTAGGCAACACTGGCGCAATCTGAAAGAAAAG，基于JBrowse網(wǎng)站(網(wǎng)址：http:202.194.139.32/jbrowse)，比對中國春(IWGSC reference V1.0 all Chromosomes)版本，得到標(biāo)記Xgwm 165在4 D染色體上的位置為412716481～412716679 Mb。

3 討 論

藍(lán)粒小麥的籽粒之所以表現(xiàn)出藍(lán)色特性，主要原因是其籽粒的胚乳糊粉層中富含花色素[34-35]。胚乳是由1個精核(n)與2個極核(n+n)受精結(jié)合為胚乳核(三倍體)，然后發(fā)育成胚乳。藍(lán)粒親本與白粒親本雜交，F(xiàn)1均為中藍(lán)(藍(lán)粒小麥作為母本)或淺藍(lán)色(藍(lán)粒小麥作為父本)[16]。籽粒顏色深淺通過表型觀察誤差較大，所以本研究對藍(lán)粒小麥的籽粒進(jìn)行橫切，含胚的一半繼續(xù)種植，另外一半用來觀察糊粉層顏色。

本研究以藍(lán)粒小麥種質(zhì)GLM 1701分別與白粒小麥品種貴農(nóng)19號、貴農(nóng)30號、中燕96-3和綿麥301進(jìn)行正反交及正反回交，對籽粒糊粉層顏色的觀察統(tǒng)計表明，F(xiàn)1籽粒顏色與李振聲等[16]的研究結(jié)果一致；正反交F2世代藍(lán)粒與白粒的比例為5∶4；正反交F1與白粒親本進(jìn)行正反回交，BC1F1群體中出現(xiàn)藍(lán)?！冒琢?∶2的比例，正反交F1與藍(lán)粒親本進(jìn)行正反回交，BC1F1群體則全為藍(lán)粒，綜合分析BC1F1群體和對自交F2群體的驗證，發(fā)現(xiàn)含藍(lán)?；虻拇菩叟渥拥膫鬟f率分別只有67%，因此造成自交F2和回交群體BC1F1偏離正常的孟德爾遺傳，通過F1、F2和BC1F1世代群體遺傳規(guī)律分析得出GLM 1701藍(lán)粒性狀的基因是一對基因控制，與李振聲等[16]、黃碧光等[17]、蘭素缺等[20]和Knievel等[36]的研究結(jié)果一致。有所不同的是，黃碧光等研究得出，含藍(lán)?；虻拇婆渥觽鬟f正常，而雄配子的傳遞率只有20%，自交F2為11∶9的比例。Knott等研究發(fā)現(xiàn)，雌蕊功能表現(xiàn)為正常的情況下，攜帶偃麥草染色體的花粉功能弱于不攜帶偃麥草的染色體的花粉[37]。傅體華等也認(rèn)為，含藍(lán)?；虻呐渥觽鬟f率會下降[ 38]；Keppenne等認(rèn)為，F(xiàn)2符合1∶2∶1的特點[19]?？刂扑{(lán)粒性狀的染色體由于種間雜交可能被群體分離成碎片或含有整個供體親本染色體，且與小麥中不同的染色體發(fā)生代換，其效應(yīng)完全不同[7,15,37]，且由于花粉直感和環(huán)境變化的影響，以及其他一些不確定因素影響藍(lán)粒小麥藍(lán)粒顏色的表型，導(dǎo)致藍(lán)色種子表面形成條紋或斑點，干擾了對藍(lán)粒性狀的觀察統(tǒng)計，從而導(dǎo)致出現(xiàn)不同的研究結(jié)果。除此之外，藍(lán)?；虻谋磉_(dá)還會受到其他基因的影響[39-42]。

利用BSA混池法結(jié)合660 K基因芯片能夠快速和高效地進(jìn)行目標(biāo)基因的定位。本試驗中芯片結(jié)果顯示，控制藍(lán)粒性狀的基因位于4 D染色體，不同于之前的研究結(jié)果，可能是一個新的基因，且篩選到一個特異性標(biāo)記Xgwm 165，位于4 D染色體的長臂上，遺傳距離為5.8 cM，本研究將控制藍(lán)粒性狀的基因命名為LM1。對Xgwm 165標(biāo)記進(jìn)行T載體克隆，比對中國春得到的物理位置為412716481～412716679 Mb。此結(jié)果可為GLM 1701藍(lán)粒小麥的進(jìn)一步利用提供基礎(chǔ)。